楊超群,賈鴻儒,譚建兵,尹思琦,吳斯林,昝林森,2,楊武才,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100;2.國(guó)家肉牛改良中心,陜西 楊凌 712100)

隨著肉牛產(chǎn)業(yè)集約化和規(guī)?；潭鹊奶岣?母牛存欄量較少,基礎(chǔ)母牛繁殖率低仍是亟待解決的問題[1]。同期發(fā)情(Estrus Synchronization)是利用外源激素調(diào)整母牛的發(fā)情階段,使群體牛在較為集中的時(shí)間段出現(xiàn)發(fā)情癥狀和排卵的技術(shù)[2]。在同期發(fā)情處理中,常用前列腺素(PG)及其類似物進(jìn)行黃體溶解,通過解除孕激素對(duì)卵泡的抑制,從而恢復(fù)卵泡發(fā)育成熟。生產(chǎn)中常用兩次PG間隔10～12 d處理,防止處理群中有處于新生黃體期的母牛[3]。兩次PG法處理成本較低,操作簡(jiǎn)單,但受母牛個(gè)體體況影響較大、發(fā)情重復(fù)性較差,易出現(xiàn)安靜發(fā)情癥狀等[4]。有研究表明,兩次PG處理后雖能顯著提升發(fā)情率,但并不能顯著提高情期受胎率[5]。對(duì)此,有研究通過維生素ADE和GnRH聯(lián)合使用來探究提高PGF2α同期發(fā)情的效果[6]。在奶牛養(yǎng)殖方面,定時(shí)輸精的應(yīng)用較為成熟,通過GnRH和PG對(duì)卵泡發(fā)育的控制,能保證卵泡發(fā)育質(zhì)量,從而提高母牛情期受胎率[7],基礎(chǔ)的定時(shí)輸精法被稱為0-7-9,即第0天注射GnRH,第7天注射PG,第9天注射GnRH,16～18 h后進(jìn)行人工輸精[8]。目前應(yīng)用定時(shí)輸精也是解決肉牛繁殖率較低問題的重要手段[9]。在母牛發(fā)情調(diào)控中,卵泡發(fā)育和排卵過程中會(huì)生成大量活性氧(ROS),ROS及自由基的存在使卵母細(xì)胞質(zhì)膜受到損傷,進(jìn)而損害DNA和蛋白質(zhì),降低卵泡發(fā)育質(zhì)量,引起卵泡閉鎖,造成母牛發(fā)情率和情期受胎率下降[10]。

褪黑素(MT)是一種天然的抗氧化劑,主要合成于動(dòng)物的松果腺,其受體表達(dá)在多種組織和細(xì)胞中。MT還可清除細(xì)胞內(nèi)有害自由基,提升細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗能力[11]。在牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中,MT可增加抗氧化基因的表達(dá),降低ROS對(duì)卵母細(xì)胞的損傷,同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而增加卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的生存率[12];通過增加網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞作用促進(jìn)人類卵母細(xì)胞和早期胚胎成熟[13];MT還可促進(jìn)LH受體表達(dá)于人顆粒細(xì)胞表面,從而增加卵泡排卵的可能性,通過MAPK途徑的激活促進(jìn)黃體細(xì)胞調(diào)節(jié)孕酮的生成,提升體外培養(yǎng)胚胎的存活率[14]。在動(dòng)物繁殖生產(chǎn)中,在湖羊冷凍精液稀釋液中加入0.25 mg/mL褪黑素后可顯著提升解凍后精子的活力,提升人工輸精妊娠率[15];卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加10-6mol/L褪黑素能提升卵母細(xì)胞抗氧化能力,促進(jìn)胚胎的發(fā)育[16];埋植MT可提高薩達(dá)母羊繁殖效率,使其提前進(jìn)入繁殖期[17];注射MT可降低水牛夏季熱應(yīng)激,提高排卵和受胎比例[18];皮下注射MT可提高自然發(fā)情率和定時(shí)輸精奶牛的受胎率[19]。盡管MT在多種動(dòng)物上的研究表現(xiàn)了其對(duì)繁殖作用的積極性,但是目前其在肉牛繁殖上的研究及生產(chǎn)中的應(yīng)用報(bào)道仍較少。

鑒于此,本研究探究外源MT在肉牛體內(nèi)代謝情況及其對(duì)兩次氯前列醇鈉處理母牛同期發(fā)情率、情期受胎率、血液抗氧化水平和生殖激素的影響,為MT在肉牛的繁殖應(yīng)用提供理論與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 褪黑素購(gòu)自BIOFOUNT,MT溶解于無水乙醇后用生理鹽水稀釋至相應(yīng)濃度;氯前列醇鈉注射液(0.2 mg; 2 mL)購(gòu)自寧波三生;無水乙醇、生理鹽水來自國(guó)家肉牛改良中心實(shí)驗(yàn)室;MDA、SOD、GSH-Px、CAT、LH、E2和FSH ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)公司,P4和MT ELISA試劑盒購(gòu)自上海凡科維公司;采血管為EDTA抗凝采血管;細(xì)管凍精、輸精槍等來自試驗(yàn)牛場(chǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物選擇及飼養(yǎng) 2021年5月-2022年8月,在寧夏海原縣富陵村肉牛養(yǎng)殖合作社、西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心良繁場(chǎng)以及西安博赫牧業(yè)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)肉牛給予TMR日糧,每日飼養(yǎng)兩次,給予充足飲水和自由活動(dòng)。

1.2 方法

1.2.1 皮下注射褪黑素在肉牛體內(nèi)代謝的情況 將12頭青年秦川肉牛隨機(jī)分為4組,每組3頭,分對(duì)照組(0 mg MT)、0.464 mg褪黑素組、4.64 mg褪黑素組、46.4 mg褪黑素組。對(duì)每頭牛在第0天早上8:00皮下注射相應(yīng)劑量褪黑素,對(duì)照組注射生理鹽水,在8:00、8:30、9:00、10:00、12:00、16:00、22:00,第1、2、3天8:00,共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)每頭牛進(jìn)行血液采集,新鮮血液3000 r/min,15 min離心吸上清,保存至-20 ℃冰箱。

1.2.2 褪黑素對(duì)肉牛同期發(fā)情效果的影響 將80頭青年西門塔爾牛和青年秦川肉牛隨機(jī)分為四組,每組20頭牛,分對(duì)照組(0 mg MT)、0.464 mg褪黑素處理組、4.64 mg褪黑素處理組、46.4 mg褪黑素處理組。采用肌注兩次氯前列醇鈉進(jìn)行同期發(fā)情誘導(dǎo),第0天進(jìn)行第1次氯前列醇鈉注射,第11天進(jìn)行第2次注射,每次使用2支;在第2次氯前列醇鈉注射與配種的同時(shí)對(duì)試驗(yàn)組肉牛皮下注射0.464 mg、4.64 mg、46.4 mg劑量的褪黑素,對(duì)照組注射生理鹽水,藥物處理后觀察96 h內(nèi)母牛發(fā)情情況,對(duì)發(fā)情牛進(jìn)行人工輸精,配種后60 d進(jìn)行妊娠檢查。每組選擇6頭牛在第2次注射氯前列醇鈉(即第1次皮下注射褪黑素前)、人工輸精(即第2次皮下注射褪黑素前)和輸精后第7天使用EDTA抗凝管采集血液,新鮮血液放置冰盒內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室3000 r/min,15 min離心吸血漿,保存至-20 ℃冰箱備用。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,組間分析使用t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn),數(shù)據(jù)由“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素在肉牛體內(nèi)代謝規(guī)律

由圖1可知,對(duì)照組肉牛血液中MT在早上8:00-12:00,濃度從32.63 pg/mL～25.52 pg/mL呈下降趨勢(shì);在12:00-22:00,濃度從25.52 pg/mL-36.30 pg/mL呈現(xiàn)上升趨勢(shì);皮下注射0.464 mg、4.64 mg和46.4 mg MT后,血液中MT濃度在8:30采血時(shí)均已處于較高值,濃度分別為92.58 pg/mL、120.42 pg/mL、155.48 pg/mL。

圖1 不同劑量褪黑素在血液中的代謝Fig.1 The line chart of different doses of melation in blood

皮下注射0.464 mg MT后,在8:30、9:00、10:00三個(gè)時(shí)間點(diǎn),血液中MT濃度極顯著高于注射前(P<0.01),12:00時(shí),血液中MT濃度顯著高于注射前(P<0.05);皮下注射4.64 mg MT后,在8:30、9:00、10:00、12:00四個(gè)時(shí)間點(diǎn),血液中MT濃度極顯著高于注射前(P<0.01),16:00時(shí),血液中MT濃度顯著高于注射前(P<0.05);皮下注射46.4 mg MT后,在8:30、9:00、10:00、12:00、16:00、22:00六個(gè)時(shí)間點(diǎn),血液中MT濃度極顯著高于注射前(P<0.01)。以上結(jié)果表明,皮下注射0.464 mg MT后8 h代謝至正常水平,皮下注射4.64 mg和46.4 mg MT后14 h代謝至正常水平。

2.2 褪黑素對(duì)肉牛血漿抗氧化水平的影響

由圖2可知,皮下注射4.64 mg和46.4 mg MT后,配種時(shí)采血(第2次采血)與第2次氯前列醇鈉注射時(shí)采血(第1次采血)相比,顯著提高了血漿GSH-Px的含量(P<0.05),極顯著提高了血漿SOD的含量(P<0.01),且顯著降低了血漿MDA的含量(P<0.05);皮下注射4.64 mg MT后,極顯著提高第2次采血時(shí)血漿CAT的含量(P<0.01),表明皮下注射4.64 mg MT和46.4 mg MT均能提升肉牛抗氧化水平。

圖2 注射褪黑素后兩次采血期間血漿抗氧化水平的變化

2.3 褪黑素對(duì)肉牛血漿生殖激素的影響

由圖3可知,與對(duì)照組相比,皮下注射4.64 mg MT或46.4 mg MT均可顯著提高配種時(shí)血漿FSH的濃度(P<0.05);注射46.4 mg MT可顯著提高血漿LH濃度(P<0.05);注射4.64 mg MT可使肉牛配種時(shí)血漿E2和配種后第7天血漿P4值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),表明皮下注射4.64 mg MT和46.4 mg MT有利于肉牛生殖激素的合成和分泌。

圖3 注射褪黑素后血漿生殖激素濃度的變化Fig. 3 Changes of plasma reproductive hormone concentration after melatonin injectionA. 促卵泡素;B. 促黃體生成素;C. 孕酮;D. 雌二醇A. FSH; B. LH; C. P4; D. E2

2.4 褪黑素對(duì)肉牛同期發(fā)情率的影響

由表1可知,對(duì)照組、0.464 mg處理組、4.64 mg處理組和46.4 mg處理組分別有14、15、17、19頭牛在第2次氯前列醇鈉注射后96 h內(nèi)發(fā)情,不同組發(fā)情時(shí)間段均集中在24～96 h,其中48～72 h發(fā)情牛數(shù)占比最高,分別為對(duì)照組25.00%,0.464 mg處理組40.00%,4.64 mg處理組50.00%和46.4 mg處理組55.00%,說明皮下注射不同劑量MT不會(huì)影響肉牛同期發(fā)情處理后的發(fā)情時(shí)間。

表1 不同劑量褪黑素對(duì)肉牛同期發(fā)情率的影響Table 1 Effect of estrus rate of beef cattle with different doses of melatonin

0.464 mg處理組、4.64 mg處理組發(fā)情率分別為75.00%和85.00%,均高于對(duì)照組發(fā)情率,雖未出現(xiàn)差異變化(P>0.05),而46.4 mg處理組發(fā)情率為95.00%,顯著高于對(duì)照組發(fā)情率(P<0.05),說明在第2次氯前列醇鈉注射的同時(shí),皮下注射MT有利于肉牛發(fā)情率的提升,其中46.4 mg效果最為明顯。

2.5 褪黑素對(duì)肉牛情期受胎率的影響

不同劑量褪黑素對(duì)肉牛情期受胎率的影響見表2。由表2可知,對(duì)照組、0.464 mg處理組、4.64 mg處理組和46.4 mg處理組情期受胎率分別為42.85%、53.33%、58.82%和73.68%,46.4 mg處理組情期受胎率比對(duì)照組情期受胎率高30.83%,雖未達(dá)到顯著差異(P>0.05),但也說明褪黑素對(duì)肉牛情期受胎率的提升呈積極作用。

表2 不同劑量褪黑素對(duì)肉牛情期受胎率的影響Table 2 Effect of conception rate of beef cattle with different doses of melatonin

3 討 論

3.1 外源褪黑素對(duì)肉牛體內(nèi)褪黑素代謝的影響

在哺乳動(dòng)物體內(nèi),視交叉上核在受到視網(wǎng)膜傳導(dǎo)的節(jié)律信號(hào)后調(diào)控松果體合成褪黑素,褪黑素可直接進(jìn)入中樞系統(tǒng)發(fā)揮作用或被分泌進(jìn)入血液循環(huán)[20]。血液中褪黑素的含量隨著晝夜變化而改變[21]。陳玉林等[22]對(duì)不同品種綿羊的研究表明,在日落后或日出前1 h 20 min,綿羊體內(nèi)褪黑素濃度均已達(dá)到夜間最高水平或日間最低水平;Mizuna等[23]研究表明,在不同季節(jié),日本短角牛機(jī)體褪黑素濃度變化均符合日落快速升高、日出快速下降的規(guī)律。本研究顯示,褪黑素在8:00-12:00呈下降趨勢(shì),在12:00-22:00呈上升趨勢(shì),表明外源褪黑素在肉牛血漿中的變化符合生理代謝規(guī)律,與先前研究結(jié)論符合。本試驗(yàn)采用皮下注射的手段給予肉牛不同劑量的褪黑素,結(jié)果表明在注射后半個(gè)小時(shí)血漿褪黑素濃度均處于較高值,隨后呈下降趨勢(shì),其中注射46.4 mg褪黑素可在血液中持續(xù)14 h的高濃度,這與楊明輝等[24]在奶牛上的研究結(jié)果一致。在生理水平,人體口服褪黑素后受首過效應(yīng)影響血漿中褪黑素在7～8 h代謝至正常水平[25];對(duì)荷斯坦奶牛連續(xù)4 d皮下注射4.64 mg褪黑素后可以使其在8 d內(nèi)血漿褪黑素濃度高于正常水平[26]。本試驗(yàn)中,褪黑素分別在注射后8或14 h代謝至正常水平,血液中褪黑素在這期間可進(jìn)入外周組織發(fā)揮功能或被肝臟等器官分解,從而達(dá)到褪黑素在生理循環(huán)中的穩(wěn)定值[27]。因此,在生產(chǎn)中可通過皮下注射的方式補(bǔ)充褪黑素,從而提高動(dòng)物循環(huán)血液中褪黑素的含量。

3.2 褪黑素對(duì)肉牛同期發(fā)情效果的影響

外源褪黑素通過血液循環(huán)作用于卵巢,以直接結(jié)合的方式清除細(xì)胞內(nèi)自由基,同時(shí)上調(diào)抗氧化基因表達(dá),刺激抗氧化酶,如谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的合成與分泌[28],進(jìn)而降低ROS對(duì)卵泡發(fā)育的損傷,同時(shí)通過增強(qiáng)線粒體功能、促進(jìn)性激素分泌、調(diào)節(jié)抗凋亡基因表達(dá)等方式促進(jìn)卵泡發(fā)育和胚胎的生長(zhǎng)[29],最終影響肉牛的發(fā)情率和情期受胎率。Ramadan等[30]使用CIDR聯(lián)合褪黑素對(duì)非繁殖季節(jié)水牛進(jìn)行處理,發(fā)情率為100%,顯著高于單獨(dú)使用CIDR得到的發(fā)情率(38%);Cemil等[31]對(duì)奶山羊使用同期發(fā)情聯(lián)合褪黑素,處理組同期率也顯著高于未使用褪黑素的組別;吳昊等[32]研究表明,褪黑素可以顯著提高自然發(fā)情奶牛的受胎率,還可顯著提高奶牛同期發(fā)情-定時(shí)輸精的妊娠率和產(chǎn)犢率。本試驗(yàn)在氯前列醇鈉同期發(fā)情處理中聯(lián)合使用0.464 mg、4.64 mg和46.4 mg的褪黑素,結(jié)果表明不同劑量褪黑素處理發(fā)情率百分比均高于對(duì)照組,皮下注射46.4 mg的褪黑素對(duì)發(fā)情影響最大,能顯著提高發(fā)情率,可能與處理后能長(zhǎng)時(shí)間維持機(jī)體褪黑素高濃度有關(guān)。而46.4 mg褪黑素處理后,肉牛情期受胎率(73.68%)高于對(duì)照組(30.83%),但未出現(xiàn)顯著變化,可能是因?yàn)樘幚砼?shù)量太少造成的。

3.3 褪黑素對(duì)肉?？寡趸胶蜕臣に氐挠绊?/h3>

本試驗(yàn)對(duì)血漿丙二醛和抗氧化酶的測(cè)定表明,4.64 mg褪黑素和46.4 mg褪黑素可以顯著降低血漿中MDA的含量,同時(shí)提高CAT、GSH-Px和SOD的含量,提升肉牛機(jī)體抗氧化水平,從而利于發(fā)情率和情期受胎率的提高,這與高翔[33]在肉牛Ovsynch處理的同時(shí)進(jìn)行褪黑素注射的結(jié)果一致,其研究同時(shí)表明抗氧化水平顯著改變的組其受胎率也顯著增加。Megahed等[34]研究表明,抗氧化水平的改善使機(jī)體減少氧化應(yīng)激的損傷,從而提升炎熱時(shí)期水牛的發(fā)情率、發(fā)情強(qiáng)度和受胎率。Maria等[35]研究表明,補(bǔ)充抗氧化劑后可提升細(xì)胞抗氧化能力,從而確保體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育質(zhì)量和環(huán)境耐受性。褪黑素除促進(jìn)抗氧化水平提升,還能影響生殖激素的分泌,提高卵泡和胚胎質(zhì)量[36]。在本試驗(yàn)中,褪黑素對(duì)配種時(shí)血液中的雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)、促黃體生成素(LH)以及配種后第7天血漿孕酮(P4)濃度有提升作用,皮下注射褪黑素有利于以上4種生殖激素合成分泌,其中4.64 mg褪黑素能顯著提高FSH、E2和P4的含量,而46.4 mg褪黑素僅能顯著提高血漿中FSH和LH的含量,E2和P4的變化并未出現(xiàn)差異,可能是由于同期發(fā)情處理后不同母牛體內(nèi)生殖激素水平不一致造成的。奶牛定時(shí)輸精研究中,皮下注射30 mg褪黑素顯著提升了血漿FSH、E2和P4的含量,生殖激素分泌的增多顯著提高了奶牛的發(fā)情率和受胎率[32]。Zhang等[37]研究表明,褪黑素在黃體細(xì)胞中增加了GnRH和LH的分泌以及LH對(duì)孕酮分泌的誘導(dǎo),從而提高了母豬妊娠率。Yang等[38]研究表明,褪黑素能促進(jìn)小鼠垂體中FSH的合成,進(jìn)而增加雌激素的水平,加速小鼠進(jìn)入青春期,對(duì)提高小鼠生殖能力有潛在作用。雌二醇的補(bǔ)充可以增加以孕酮栓為基礎(chǔ)的奶牛定時(shí)輸精過程中大卵泡的比例和排卵比例,從而提高無熱應(yīng)激期奶牛發(fā)情率和受胎率[39]。

4 結(jié) 論

肉牛皮下注射0.464 mg、4.64 mg、46.4 mg褪黑素可以提高循環(huán)血液中褪黑素含量,在8～14 h代謝至正常水平;肉牛皮下注射褪黑素可提高血漿抗氧化水平和生殖激素水平,進(jìn)而影響兩次氯前列醇鈉同期發(fā)情的發(fā)情率和情期受胎率,以46.4 mg褪黑素對(duì)兩次氯前列醇鈉同期發(fā)情提高效果最好。