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變異型高致病性鵝源禽呼腸孤病毒的分離和鑒定

2024-03-13 06:29:36錢金涵朱亭帆馬陳淑秦愛建金文杰
中國獸醫(yī)雜志 2024年2期
關(guān)鍵詞:呼腸尿囊水禽

錢金涵,朱亭帆,王 強(qiáng),馬陳淑,秦愛建,3,金文杰,3,4

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州 225009;3. 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009;4.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物疾病檢測與技術(shù)服務(wù)中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)是一種分節(jié)段的雙股RNA病毒,屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)[1]。ARV是引起全世界家禽疾病中最為重要的病原之一,能感染包括雞、鴨、鵝在內(nèi)的多種禽類[2],ARV感染在世界各地均有發(fā)生,我國自20世紀(jì)80年代中期以來已有多個(gè)省市發(fā)現(xiàn)本病,嚴(yán)重影響了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。ARV既能引起宿主產(chǎn)生疾病,又能引起宿主免疫抑制,加劇其他病原的感染,既可水平傳播也能垂直傳播[3,4],對全球家禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。ARV與雞的病毒性關(guān)節(jié)炎、發(fā)育遲緩綜合征和腱鞘炎有關(guān)[2]。匈牙利的一項(xiàng)研究表明,鵝感染呼腸孤病毒表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙和跛足,并伴有脾炎、肝炎、心外膜炎、關(guān)節(jié)炎和腱鞘炎[5]。綜上所述,ARV感染引起的疾病發(fā)病率不斷上升且出現(xiàn)了多樣化的臨床疾病形式,表明ARV的影響越來越大,給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。

ARV基因組可按節(jié)段大小分為大(L1-L3)、中(M1-M3)和小(S1-S4)三類,它們至少編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。其中S1基因編碼的σC蛋白是最小的結(jié)構(gòu)蛋白,為外衣殼的次要組成成分。σC蛋白具有病毒附著[6]和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]的作用。ARV誘導(dǎo)的細(xì)胞融合已被證明是由σC蛋白介導(dǎo)的,細(xì)胞融合可能在病毒發(fā)病機(jī)制中起重要作用[8]。σC蛋白攜帶有特異性中和反應(yīng)的抗原,可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生病毒型特異性的中和抗體[6,9]。ARV基因組中變異最大的基因是σC基因[10],可以利用σC基因?qū)RV進(jìn)行分類[11]。同時(shí),σC蛋白也是ARV亞單位疫苗的主要研究對象。

本試驗(yàn)從江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)某鵝場的病死鵝肝臟和脾臟中分離得到1株鵝源ARV,對該分離毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,了解ARV的變異趨勢和流行情況,以期為該地區(qū)ARV的防控提供分子流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品采集和處理 2020年9月,江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)某鵝場連續(xù)數(shù)日發(fā)生鵝死亡,對病死鵝進(jìn)行剖檢觀察大體病變。采集病死鵝的肝臟和脾臟,將肝臟和脾臟組織與磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline,PBS)按1∶3混合,研磨破碎,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,吸取上清過0.22 μm濾器過濾除菌后備用。

1.2 主要試劑 GreenTaqMix、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、RNA提取試劑盒和工程菌株DH5α,均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;T4連接酶、載體pGEM-T Easy和PrimeScriptTMⅡ 1st Stard cDNA Synthesis Kit,均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;QIAquick Gel Extraction Kit,購自QIAGEN公司;AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒,購自AXYGEN公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清,均購自Gibco公司。

1.3 主要儀器 超凈操作工作臺、渦旋混勻儀和高速冷凍離心機(jī),Eppendorf公司產(chǎn)品;96孔PCR擴(kuò)增儀,杭州博日科技股份有限公司產(chǎn)品;紫外凝膠成像系統(tǒng),DNR成像系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)級雞胚,10日齡,購自江蘇勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2022—0002]。雛鵝,11日齡,購自揚(yáng)州佳麗鵝業(yè)。

1.5 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測 取500 μL組織研磨液上清按RNA提取試劑盒說明書提取RNA,反轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary deoxyribo nucleic acid,cDNA),參照GenBank中ARV保守序列設(shè)計(jì)1對引物(表1),由南京擎科生物科技有限公司合成。聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)反應(yīng)體系:GreenTaqMix 12.5 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,模板cDNA 2 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min,4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物,將陽性條帶送南京擎科生物科技有限公司測序驗(yàn)證。

表1 ARV檢測引物

1.6 病毒分離培養(yǎng) 將組織研磨液上清加入青霉素-鏈霉素混合液,于37 ℃孵育30 min,12 000 r/min離心10 min,取上清經(jīng)0.22 μm濾器過濾。將無菌的濾液經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡SPF級雞胚,每胚接種0.2 mL,棄去24 h內(nèi)死亡胚,連續(xù)觀察8 d。收獲尿囊液經(jīng)細(xì)菌檢測后通過尿囊腔途徑再接種10日齡SPF級雞胚,連續(xù)傳代3次。將收獲的尿囊液作為種毒(命名為ARV-JSJD-2020株),分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將種毒尿囊液接種至Vero細(xì)胞,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后棄去尿囊液,用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng),待120 h后收集病毒,反復(fù)凍融5次,5 000 r/min離心10 min取上清,標(biāo)記為第1代細(xì)胞病毒液。重復(fù)上述操作,將病毒在Vero細(xì)胞上盲傳直至出現(xiàn)細(xì)胞病變。

1.7 病毒血凝活性測定 配置體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液,在96孔板每孔均加入50 μL PBS,于左側(cè)第1孔加入50 μL種毒尿囊液,依次倍比稀釋至第11孔,吸出50 μL棄去,最后一孔作為對照。向每孔中均加入50 μL 1%雞紅細(xì)胞懸液,37 ℃靜置15 min后觀察結(jié)果。

1.8 病毒雞胚半數(shù)致死量(Median embryo lethal dose,ELD50)測定 將ARV-JSJD-2020株病毒的種毒尿囊液用PBS緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋,取10-1~10-8每個(gè)稀釋度通過尿囊腔膜接種10日齡SPF級雞胚3枚,接種量為每胚0.2 mL。每天照蛋觀察,記錄死亡情況并根據(jù)Karber法計(jì)算ELD50。

1.9 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 選擇11日齡的雛鵝,試驗(yàn)組頸部皮下注射種毒尿囊液0.2 mL,對照組頸部皮下注射無菌PBS 0.2 mL,每日觀察雛鵝情況。若出現(xiàn)死亡,剖檢觀察發(fā)病情況,并用4%甲醛固定臟器制作病理切片,將肝臟和脾臟組織研磨液上清接種雞胚。

1.10 病毒σC基因分析

1.10.1σC基因PCR擴(kuò)增 參照GenBank上已發(fā)表的ARVσC基因序列,設(shè)計(jì)1對特異性引物(表2),由南京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系:2×Phanta Max Buffer 25 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL,dNTP Mix 1 μL,上游引物2 μL,下游引物2 μL,模板cDNA 1 ng,補(bǔ)足ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 26 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min,4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后與載體pGEM-T Easy連接,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。

表2 ARV σC基因檢測引物

1.10.2σC基因序列分析 將ARV-JSJD-2020株的σC基因序列與NCBI上發(fā)表的ARVσC基因序列(表3)進(jìn)行比較,運(yùn)用MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列分析,并使用MEGA 7軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。

表3 ARV參考株信息

2 結(jié)果

2.1 病死鵝剖檢觀察 剖檢可見病死鵝的肝臟和脾臟腫大出血,有心包積液,腸道出現(xiàn)粘連,胰腺出血,腺胃黏膜充血出血,喉頭有黏液樣滲出。

2.2 RT-PCR檢測 如圖1所示,疑似病料用RT-PCR可擴(kuò)增出約585 bp的特異性條帶,與預(yù)期大小相符。

圖1 疑似病料的RT-PCR檢測

2.3 病毒分離培養(yǎng) 接種病死鵝肝臟和脾臟研磨液上清的大多數(shù)雞胚在24~96 h內(nèi)死亡,死亡雞胚尿囊液清澈,細(xì)菌檢驗(yàn)結(jié)果為陰性,死亡雞胚的胚體充血出血呈鮮紅或紫紅色,胚體發(fā)育不良,剖檢肝臟紅腫出血。將收獲的種毒尿囊液接種Vero細(xì)胞,接種120 h后,未見細(xì)胞病變,收獲細(xì)胞懸液,反復(fù)凍融后繼續(xù)在Vero細(xì)胞上傳代,至第5代時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病變,細(xì)胞界限模糊,皺縮死亡,出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象,折光性改變(圖2)。

圖2 病毒的分離培養(yǎng)(100×)

2.4 病毒血凝活性測定 ARV-JSJD-2020株病毒對1%雞紅細(xì)胞無肉眼可見的凝集作用。

2.5 病毒ELD50測定 尿囊液以10-1和10-2稀釋度接種雞胚各死亡3枚,10-3、10-4和10-6稀釋度接種雞胚各死亡1枚,10-5稀釋度接種雞胚死亡2枚,10-7和10-8稀釋度接種雞胚均未死亡。根據(jù)Karber法計(jì)算,病毒ELD50為10-4.166/0.2 mL。

2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 試驗(yàn)組接種種毒尿囊液的雛鵝24 h后即出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,剖檢可見其肝臟和脾臟出血。組織病理學(xué)觀察顯示,肝臟出現(xiàn)局灶性壞死,壞死灶內(nèi)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(圖3)。將試驗(yàn)組肝臟和脾臟研磨液上清接種雞胚,雞胚在24~96 h內(nèi)死亡。

圖3 肝臟組織病理學(xué)觀察(H.E.染色,100×)

2.7σC基因PCR擴(kuò)增 如圖4所示,σC部分基因擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期大小相符,測序結(jié)果證實(shí)為ARVσC基因。

圖4 ARV-JSJD-2020 σC基因片段的PCR擴(kuò)增

2.8σC基因序列分析 將ARV-JSJD-2020與GenBank上參考毒株進(jìn)行比對,分析σC基因遺傳進(jìn)化差異,結(jié)果如圖5和圖6所示,ARV-JSJD-2020與GenBank上參考毒株的核苷酸同源性為38.5%~98.7%,氨基酸同源性為28.0%~98.1%。ARV-JSJD-2020與水禽源ARV的核苷酸同源性為49.6%~98.7%,而與雞源ARV的核苷酸同源性只有38.5%~41.6%。ARV-JSJD-2020與水禽源ARV的氨基酸同源性為38.2%~98.1%,而與雞源ARV的氨基酸同源性僅為28.0%~31.1%。為了進(jìn)一步分析ARV-JSJD-2020與其他毒株在遺傳進(jìn)化上的關(guān)系,建立遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果如圖7所示,通過對σC基因進(jìn)行基因分析,可將ARV劃分成2個(gè)大群(GI和GII),GI群屬于水禽源ARV,GII群屬于雞源ARV,分離得到的ARV-JSJD-2020屬于GI群,即為水禽源ARV。其中S1133、減毒S1133和1733均為疫苗株,但它們均為雞源ARV,與ARV-JSJD-2020屬于不同分支,親緣性較遠(yuǎn)。番鴨呼腸孤病毒CA是市售的弱毒活疫苗株,與ARV-JSJD-2020雖然同屬水禽源ARV,但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。GI群水禽源ARV又可以分為2個(gè)亞群,ARV-JSJD-2020、YY10G和03G這3株鵝源呼腸孤病毒與鴨源呼腸孤病毒屬同一亞群,而在匈牙利分離得到的D34-99和D20-99、在法國分離得到的89330以及在我國分離得到的GRV-GD2020這4株鵝源呼腸孤病毒與番鴨源呼腸孤病毒屬同一亞群。

圖5 σC基因核苷酸序列同源性比對

圖6 σC基因氨基酸序列同源性比對

圖7 σC基因的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

ARV感染在世界各地均有發(fā)生,美洲[12]、歐洲[13]、亞洲[14]、非洲[15]和大洋洲[16]這五大洲無一例外,在肉雞、蛋雞、火雞、鴨、鵝、鴿子、鸚鵡和野生鳥類等上均檢測分離到ARV,ARV影響范圍波及全世界的各種禽類物種。自20世紀(jì)80年代中期以來,我國已有多個(gè)省市發(fā)現(xiàn)本病,嚴(yán)重影響了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。1985年,王錫堃等[17]發(fā)現(xiàn)了我國第1例雞病毒性關(guān)節(jié)炎病例;2001年,吳寶成等[18]從患病番鴨中分離出7株呼腸孤病毒株,是我國首次分離出的鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus,DRV)毒株;2002年,王光鋒等[19]首次從表現(xiàn)為出血性壞死的病鵝肝臟中分離得到鵝呼腸孤病毒(Goose reovirus,GRV)毒株。近年來,ARV表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性且其致病性呈上升趨勢[20],出現(xiàn)了不斷多樣化的臨床疾病形式,表明ARV的影響越來越大,給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。

本試驗(yàn)從江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)某鵝場進(jìn)行采樣,通過組織病料PCR檢測、雞胚分離、細(xì)胞培養(yǎng)等方法分離得到1株鵝源ARV,將該分離株命名為ARV-JSJD-2020。ARV-JSJD-2020造成的臨床病變與其他毒株相似,肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)與波蘭鵝群中分離得到的GRV類似[21],但其雞胚致死率和雛鵝發(fā)病情況相對于其他毒株較高且致死時(shí)間較快,并且對成年鵝有致死性,有可能是1株變異型強(qiáng)毒株。

ARV感染造成的家禽飼養(yǎng)業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失,強(qiáng)調(diào)了對新出現(xiàn)的ARV分離株進(jìn)行患病率、遺傳特征和致病性進(jìn)化等研究的重要性[22]。王丹等[23]對ARV所有基因節(jié)段構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)除了M2基因外,雞源毒株和水禽源毒株分別形成2個(gè)獨(dú)立的分支。本試驗(yàn)對分離株ARV-JSJD-2020的σC基因進(jìn)行測序分析,并與GenBank中其他ARV毒株進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果顯示,ARV-JSJD-2020屬于水禽源分支。而目前廣泛使用的滅活疫苗毒株S1133和1733以及減毒活疫苗毒株減毒S1133[24]均屬于雞源ARV,與水禽源ARV不屬于同一分支。番鴨呼腸孤病毒毒株CA是已經(jīng)市售的弱毒活疫苗,與ARV-JSJD-2020雖然同屬水禽源ARV,但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)基因進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn),從鵝源分離得到的ARV,部分與鴨呼腸孤病毒屬同一亞群,而另一部分與番鴨呼腸孤同屬另一亞群,2個(gè)亞群之間親緣性不高,這給防治水禽ARV帶來了巨大的挑戰(zhàn)。本試驗(yàn)分離得到的ARV-JSJD-2020可以為后續(xù)鵝源ARV的防控和疫苗的研發(fā)提供參考依據(jù)。

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