姚文梅,寇晨雨,孫雨昕,劉 濤,2,3,王曉丹,2

[1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071000;3.瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司,河北 保定 071000]

全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid,PFOA)是一類新型的持久性有機(jī)化合污染物。自20世紀(jì)50年代以來,PFOA因具有良好的表面活性和疏水疏油等特性,而被廣泛用于生活用品和工業(yè)制造[1]。研究發(fā)現(xiàn),PFOA暴露會誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)心血管疾病、遺傳毒性、免疫毒性、慢性腎病、生殖毒性和肝臟毒性。近年來,全球范圍內(nèi)大氣[2]、土壤[3]和水體[4]等環(huán)境介質(zhì)以及畜產(chǎn)品中都能檢出含有PFOA。Li等[5]測定了我國31個省級行政區(qū)域的79個城市飲用水樣本中17種全氟烷基類化合物(Perfluoroalkyl acids,PFAAs)的水平,結(jié)果顯示,中國飲用水中普遍存在PFAAs,∑17 PFAAs在4.49～174.93 ng/L范圍內(nèi),平均值為35.13 ng/L。調(diào)查發(fā)現(xiàn),河流和自來水中普遍存在PFOA、全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonates,PFOS)、全氟己酸(Perfluorohexanoic acid,PFHxA)、全氟癸酸(Perfluorodecanoate,PFDA)和全氟戊酸(Perfluoropolyalkylether N,N-diphenylamide,PFPeA)[6]。Tan等[7]測定了我國東部地區(qū)作為飲用水主要來源的河流和湖泊中17種多氟烷基物質(zhì)(Polyfluoroalkyl substances,PFASs)的濃度,飲用水中PFASs的總濃度為1.4～175.0 ng/L,但最令人擔(dān)憂的是,杭州三區(qū)飲用水中PFOA濃度為115～151 ng/L。Bao等[8]研究發(fā)現(xiàn),阜新地區(qū)某氟化物工業(yè)園區(qū)地下水樣品中 PFOA 含量為2.47 μg/L,其溫室旁土壤樣品中 PFOA 含量為6.8 ng/g,溫室內(nèi)種植的番茄和黃瓜中 PFOA 濃度高達(dá)87和63 ng/g。PFOA不僅有很強(qiáng)的生物富集性[9],還可以通過食物鏈進(jìn)行傳遞。研究發(fā)現(xiàn),肉類產(chǎn)品中大部分含有PFASs,其中含量最多的是PFOA和PFOS。白潤葉[10]對全國部分主產(chǎn)區(qū)1 445份雞肉樣品中PFASs進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果顯示,PFOA含量位列第二,濃度為0.055 7 ng/g;隨著對人群血清[11-12]、動物性食品(肉[13]、蛋[14]、奶[15]、水產(chǎn)[16])和生活飲用水[17]中PFOA含量進(jìn)行檢測分析,發(fā)現(xiàn)長期暴露于PFOA環(huán)境中對全球生態(tài)環(huán)境和人類健康都存在很大的威脅。

PFOA主要通過污染的飲水和食物進(jìn)入機(jī)體并蓄積,進(jìn)而對機(jī)體產(chǎn)生毒性作用。目前,關(guān)于PFOA的毒性研究主要集中于小鼠,對生產(chǎn)實(shí)踐動物的研究較少。因此,本試驗(yàn)通過檢測肉雞生長性能和胸肌肉品質(zhì),肝臟和十二指腸中炎癥因子,觀察肉雞肝臟和十二指腸形態(tài)變化,檢測肝臟組織中轉(zhuǎn)氨酶和抗氧化指標(biāo),以探究飲水中暴露不同質(zhì)量濃度的PFOA對肉雞生長性能、胸肌肉品質(zhì)、肝臟和十二指腸的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PFOA(純度為95%),購自Sigma-Aldrich公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒、過氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(Plasma glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒,均購自南京建成科技有限公司;白介素-1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)試劑盒、白介素-6(Interleukin 6,IL-6)試劑盒和腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor α,TNF-α)試劑盒,均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀(BioTek,USA);Seven CompactTM多參數(shù)測試儀(梅特勒-托利多儀器有限公司);三恩馳NR60CP手持式色差儀(深圳市三恩馳科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)動物和分組 1日齡健康愛拔益佳肉雞160羽,由天津靜海慶源有限公司提供。將肉雞隨機(jī)分為4個組:0 mg/L PFOA組(C組)、0.5 mg/L PFOA組(D組)、1.0 mg/L PFOA組(Z組)和1.5 mg/L PFOA組(G組),每組4個重復(fù),每個重復(fù)10羽。試驗(yàn)期間采用3層籠養(yǎng),24 h恒定光照,自由采食和飲水,按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)3 d,第4天在飲水中添加不同質(zhì)量濃度的PFOA,連續(xù)添加至42日齡。于42 d試驗(yàn)結(jié)束時,于每組中的每個重復(fù)隨機(jī)選取4羽肉雞,翅下靜脈采血,處死后采取肉雞的胸肌、肝臟和十二指腸,保存待測。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 平均日增重和肝臟指數(shù) 試驗(yàn)肉雞1日齡和42日齡清晨空腹稱重。按公式(1)計算平均日增重(Average daily gain,ADG)。將收集的肝臟用生理鹽水沖洗,去除表面結(jié)締組織和脂肪,稱重,按公式(2)計算肝臟指數(shù)。

平均日增重=(末重-初始重)÷試驗(yàn)天數(shù)

(1)

肝臟指數(shù)(%)=肝臟重量(g)÷體重(g)×100%

(2)

1.4.2 胸肌肉品質(zhì)和常規(guī)指標(biāo)測定 取肉雞左側(cè)胸肌用于測定屠宰后24 h的肉品質(zhì)和常規(guī)指標(biāo)的測定,包括肉色、pH和蒸煮損失。

肉色:采用三恩馳NR60CP手持式色差儀,測定胸肌的亮度值(L*)、紅度值(a*)和黃度值(b*)。同一樣品測定3次,取平均值。

pH:將胸肌放入4 ℃冰箱保存,用Seven CompactTM多參數(shù)測試儀測定胸肌的pH,測定時將電極完全插入胸肌樣品中。同一樣品測定3次,取平均值。

蒸煮損失:剪下厚約3 cm、重約30 g的樣品,剔除脂肪和結(jié)締組織,裝入蒸煮袋置于90 ℃水浴,測得胸肌樣品中心溫度為70 ℃時,取出并冷卻至室溫,用濾紙將表面水分吸干后稱重,按公式(3)計算蒸煮損失。

蒸煮損失(%)=(樣品煮前重-樣品煮后重)÷樣品煮前重×100%

(3)

1.4.3 肝臟中ALT和AST活力測定 將0.1 g肝臟組織和0.9 mL PBS勻漿后取上清,制備10%的肝臟組織勻漿。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,測定肝臟中ALT和AST的活力。

1.4.4 肝臟和十二指腸組織病理學(xué)觀察 將肉雞的肝臟和十二指腸用4%多聚甲醛固定24 h。每組選取3份樣品,經(jīng)過修塊,流水過夜,梯度酒精脫水,透明,浸蠟,包埋,制成5 μm石蠟切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。取3張不同的十二指腸切片,每張切片選取6處走向完整的腸絨毛,用Image J圖像分析軟件測量絨毛高度(V)和隱窩深度(C),并計算V/C值。

1.4.5 肝臟氧化指標(biāo)測定 將0.1 g肝臟組織和0.9 mL PBS勻漿后取上清,制備10%的肝臟組織勻漿。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,測定肝臟中SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量。

1.4.6 肝臟和十二指腸中炎性因子含量測定 將0.1 g組織(肝臟或十二指腸)和0.9 mL PBS勻漿后取上清,制備10%的組織勻漿。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,測定組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0(Statistical Package for The Social Sciences,SPSS)軟件進(jìn)行單因素方差分析,若方差齊性,采用最小顯著差異法(Least significance difference,LSD)檢驗(yàn);若方差不齊,采用Dunnett法檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示無顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 PFOA對肉雞平均日增重和肝臟指數(shù)的影響 由表1可知,飲水中暴露PFOA后能降低肉雞的平均日增重,與C組(0 mg/L)相比,G組(1.5 mg/L)的平均日增重極顯著降低(P<0.01)。飲水中暴露PFOA后能升高肝臟指數(shù),與C組(0 mg/L)相比,Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)的肝臟指數(shù)極顯著升高(P<0.01),且呈劑量依賴性。

表1 PFOA對肉雞平均日增重和肝臟指數(shù)的影響

2.2 PFOA對肉雞胸肌肉品質(zhì)和常規(guī)指標(biāo)的影響 由表2可知,與C組(0 mg/L)相比,暴露于PFOA對屠宰后24 h的肉色(L*、a*、b*)和pH均無顯著影響(P>0.05);與C組(0 mg/L)相比,僅G組(1.5 mg/L)屠宰后24 h的蒸煮損失顯著升高(P<0.05)。

表2 PFOA對肉雞胸肌肉品質(zhì)的影響

2.3 PFOA對肉雞肝臟中AST和ALT活力的影響 由圖1可知,與C組(0 mg/L)相比,在飲水中暴露PFOA后,肉雞肝臟中AST和ALT的活力都升高,其中Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)的AST和ALT的活力都極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明,飲水中暴露PFOA會造成肉雞肝臟損傷,且隨著PFOA質(zhì)量濃度增加,肉雞肝臟中AST和ALT活力逐漸升高。

圖1 PFOA對肉雞肝臟中AST和ALT活力的影響

2.4 PFOA對肉雞肝臟組織病理學(xué)的影響 如圖2所示,C組(0 mg/L)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核清晰,無明顯變性。飲水中暴露PFOA會破壞肉雞肝臟組織的正常結(jié)構(gòu),其中D組(0.5 mg/L)肝索排列較整齊,肝細(xì)胞有空泡變性和細(xì)胞核固縮;Z組(1.0 mg/L)肝索結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞發(fā)生空泡變性和細(xì)胞核固縮;G組(1.5 mg/L)肝索紊亂,肝細(xì)胞空泡變性并伴有炎性浸潤。

圖2 PFOA對肉雞肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響(400×)

2.5 PFOA對肉雞十二指腸絨毛形態(tài)的影響 如圖3所示,C組(0 mg/L)十二指腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,絨毛排列整;Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)絨毛高度降低且絨毛出現(xiàn)水腫。如表3所示,與C組(0 mg/L)相比,在飲水中暴露不同質(zhì)量濃度的PFOA后,十二指腸絨毛高度和隱窩深度及其比值均有極顯著差異(P<0.01)。

圖3 PFOA對肉雞十二指腸絨毛形態(tài)的影響(200×)

表3 PFOA對肉雞十二指腸絨毛高度和隱窩深度的影響

2.6 PFOA對肉雞肝臟氧化指標(biāo)的影響 如圖4所示,與C組(0 mg/L)相比,D組(0.5 mg/L)肉雞肝臟中SOD活性顯著降低(P<0.05),MDA含量顯著升高(P<0.05);Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)肝臟中SOD、GSH-Px和CAT活性極顯著降低(P<0.01),MDA含量極顯著升高(P<0.01)。

圖4 PFOA對肉雞肝臟氧化指標(biāo)的影響

2.7 PFOA對肉雞肝臟中炎癥因子的影響 如圖5所示,與C組(0 mg/L)相比,Z組(1.0 mg/L)肉雞肝臟中IL-6含量顯著升高(P<0.05),IL-1β和TNF-α含量極顯著升高(P<0.01);G組(1.5 mg/L)肉雞肝臟中IL-1β、IL-6和TNF-α含量都極顯著升高(P<0.01)。

圖5 PFOA對肉雞肝臟中炎癥因子的影響

2.8 PFOA對肉雞十二指腸中炎癥因子的影響 如圖6所示,與C組(0 mg/L)相比,D組(0.5 mg/L)肉雞十二指腸中TNF-α含量顯著升高(P<0.05);Z組(1.0 mg/L)肉雞十二指腸中IL-1β和TNF-α含量顯著升高(P<0.05);G組(1.5 mg/L)肉雞十二指腸中IL-1β、IL-6和TNF-α含量都極顯著升高(P<0.01)。

圖6 PFOA對肉雞十二指腸中炎癥因子的影響

3 討論

PFOA的廣泛存在對全球環(huán)境和人類健康存在嚴(yán)重威脅[18]。近幾年研究發(fā)現(xiàn),PFOA對機(jī)體的影響主要表現(xiàn)在生殖毒性[19]、神經(jīng)毒性、腎臟毒性、心臟毒性和肝臟毒性等方面,而肝臟是機(jī)體最重要的代謝和解毒器官,也是PFOA毒性損傷作用的靶器官[20]。李丹陽等[21]研究妊娠期暴露PFOA對子代小鼠肝臟的損傷作用,發(fā)現(xiàn)PFOA可以極顯著增加子代小鼠肝臟指數(shù),導(dǎo)致肝細(xì)胞腫大,并發(fā)生空泡變性。胥夢晨[22]研究發(fā)現(xiàn),PFOA可導(dǎo)致小鼠肝臟腫大并產(chǎn)生氧化應(yīng)激,進(jìn)而造成肝臟損傷。大量研究表明,PFOA引起的肝臟毒性與過氧化物酶體增殖物激活受體及其下游功能密切相關(guān)[23-24]。目前,飲水和飲食是機(jī)體暴露于PFOA的主要途徑[25]。因此,本試驗(yàn)通過在肉雞飲水中暴露不同質(zhì)量濃度的PFOA,研究PFOA對肉雞肝臟和十二指腸的損傷作用。

肝臟是動物機(jī)體能量供應(yīng)、物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)換的主要器官。PFOA因其特殊結(jié)構(gòu),在體內(nèi)難以降解,如果長期在機(jī)體中富集,就會對肝臟帶來負(fù)面影響。有研究表明,暴露于PFOA可以誘發(fā)肝臟炎癥,破壞抗氧化穩(wěn)態(tài),造成肝臟腫大,并最終導(dǎo)致肝臟損傷[26]。肝臟指數(shù)在一定程度上能夠反映動物機(jī)體的健康狀況。在本試驗(yàn)中,與C組(0 mg/L)相比,PFOA組中肉雞肝臟指數(shù)逐漸增加;其中,Z組(1.0 mg/L)和G組(1.5 mg/L)肝臟指數(shù)極顯著增加。AST主要存在于心肌、線粒體和肝細(xì)胞胞漿中,ALT主要分布在肝細(xì)胞胞漿中,因此,肝臟中AST和ALT的水平可以反映肝臟的受損程度。本試驗(yàn)飲水中暴露PFOA后,肉雞肝臟中AST和ALT的活力隨著PFOA濃度的增加而上升。大量研究表明,PFOA能導(dǎo)致哺乳動物肝細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平上升[27-28]。當(dāng)機(jī)體長時間暴露于高氧環(huán)境而導(dǎo)致ROS水平超過肝細(xì)胞抗氧化能力時,肝細(xì)胞就會遭受到氧化應(yīng)激損傷。SOD、CAT和GSH-Px是機(jī)體清除自由基的抗氧化酶,在防止細(xì)胞氧化損傷方面起著重要的作用。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化過程的最終產(chǎn)物,具有細(xì)胞毒性,其含量可以直接反映出機(jī)體脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞損傷的程度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,暴露于PFOA肉雞的肝臟組織中SOD、CAT和GSH-Px抗氧化酶活性降低,MDA含量升高,這可能是因?yàn)镻FOA在體內(nèi)積累,誘導(dǎo)過量的ROS產(chǎn)生從而導(dǎo)致肝臟發(fā)生氧化損傷。

小腸是動物機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所。腸黏膜的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的完整性是維持腸道健康的有效屏障[29]。Rashid等[30]研究發(fā)現(xiàn),給予CD1小鼠PFOA[1、5、10和20 mg/(kg·bw·d)]10 d后,小鼠的小腸和結(jié)腸組織中會積累大量的PFOA;與結(jié)腸相比,小腸中PFOA的蓄積水平更高,并且腸道上皮內(nèi)層的結(jié)構(gòu)完整性和功能受到影響。小腸絨毛是機(jī)體吸收營養(yǎng)的主要途徑,絨毛高度和隱窩深度是衡量腸道黏膜功能的重要指標(biāo):小腸絨毛高度越高,說明腸上皮細(xì)胞發(fā)育越好,可以增加與腸道內(nèi)容物的接觸面積,促進(jìn)消化酶的合成和分泌;小腸隱窩深度可以反映出上皮細(xì)胞的增殖速度,隱窩越淺,說明小腸上皮細(xì)胞增殖越快,有利于更好的吸收營養(yǎng)物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在飲水中暴露PFOA可導(dǎo)致肉雞十二指腸絨毛高度變低、隱窩深度變深、絨毛高度與隱窩深度比值降低,并且絨毛腫脹,最終破壞了十二指腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對各種刺激所發(fā)生的防御反應(yīng)。通常來說,炎癥對機(jī)體是有益的:當(dāng)機(jī)體受到損傷和感染時,可通過炎癥反應(yīng)來促進(jìn)組織的恢復(fù),起到一種自我保護(hù)的作用。有研究表明,PFOA能夠增加肝臟中促炎因子IL-6的表達(dá),從而誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[31]。IL-1β主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生,可引起機(jī)體局部發(fā)生炎癥反應(yīng)。IL-6可由多種免疫細(xì)胞合成和分泌,影響著T細(xì)胞的分裂和B細(xì)胞的增殖,并且參與肝臟細(xì)胞和腸黏膜上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)。TNF-α是目前發(fā)現(xiàn)的生物活性因子之一,主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,其可以促使一氧化氮和趨化因子等產(chǎn)生,加劇機(jī)體炎癥的發(fā)生。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飲水中暴露PFOA會使肉雞肝臟和十二指腸中促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的含量升高,從而導(dǎo)致肝臟和十二指腸發(fā)生炎癥反應(yīng)。

肉品質(zhì)的測定主要包括肉色、pH、蒸煮損失、滴水損失和嫩度等指標(biāo)。在指標(biāo)測定中,L*表示亮度,L*值越低,顏色越淺,肉質(zhì)越好;a*值表示肌肉的紅度;b*值表示肌肉的黃度。pH對肌肉的顏色、保質(zhì)期和系水力等均有影響,是評價肉品質(zhì)性狀的重要指標(biāo)之一[32]。肌肉系水力是指肌肉保水能力,通常用蒸煮損失和滴水損失進(jìn)行評估,一般蒸煮損失越低,系水力越高,肉質(zhì)越好。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飲水中暴露PFOA對肉色和pH無顯著影響,G組(1.5 mg/L)蒸煮損失顯著增加,說明PFOA會降低肉雞胸肌的保水性能。

目前,環(huán)境中存在的是PFAS的混合物,而不是單獨(dú)的物質(zhì),因此應(yīng)更好地了解PFAS的聯(lián)合效應(yīng)對我國畜禽業(yè)發(fā)展的影響。后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)一步探究PFAS暴露于飲水后對家禽生長性能、肉品質(zhì)的影響以及在機(jī)體內(nèi)殘留等問題。綜上所述,飲水中暴露PFOA會對肉雞的肝臟和十二指腸造成損傷,其中1.5 mg/L的PFOA會增加肉雞胸肌蒸煮損失,導(dǎo)致肉雞肝臟細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng),使抗氧化能力降低;且導(dǎo)致肉雞十二指腸絨毛變短、水腫和炎癥反應(yīng)。