于 歡,宮敬利,張曉美,吳 迪,馬瑩慧,張慧鋒

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

草蓯蓉[Boschniakiarossica(Cham. et Schlecht.) Fedtsch.]為列當(dāng)科草蓯蓉屬寄生肉質(zhì)草本植物,在中國(guó)、印度、日本、韓國(guó)和俄羅斯均有分布[1-2]。現(xiàn)代研究表明,草蓯蓉具有抗衰老、抗癌、抗炎、抗肝纖維化、保肝和抗氧化活性[3]。草蓯蓉全草入藥可作為中藥肉蓯蓉的代用品,有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、潤(rùn)腸通便之效,主治腎虛陽(yáng)萎、腰關(guān)節(jié)冷痛、便秘等。據(jù)文獻(xiàn)記載,肉蓯蓉可以用于牛前胃病的治療,作為肉蓯蓉的代用品,草蓯蓉也具有類似的功效,并且相較肉蓯蓉而言可及性更好[4]。質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(Quality by design,QbD) 理念是通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(Critical quality attributes,CQAs) 與關(guān)鍵工藝參數(shù)(Critical process parameters,CPPs) 之間的關(guān)系模型,建立能夠確保產(chǎn)品質(zhì)量的生產(chǎn)過(guò)程輸入和過(guò)程參數(shù)組合的范圍,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)和穩(wěn)定性的控制[5-8]。將制藥過(guò)程由基于固定工藝參數(shù)的操作方式過(guò)渡到對(duì)工藝參數(shù)范圍的準(zhǔn)確控制中,將藥品生產(chǎn)中對(duì)經(jīng)驗(yàn)操作的依賴轉(zhuǎn)化為對(duì)工藝參數(shù)的精準(zhǔn)把握,從而保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定[9]。

質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)是制約中藥制劑現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。由于中藥本身的復(fù)雜性,結(jié)合研究思路和方法、科學(xué)技術(shù)條件等因素的局限性,現(xiàn)行中藥制劑的質(zhì)控模式和方法難以對(duì)中藥制劑的質(zhì)量進(jìn)行有效控制和評(píng)價(jià),更難以反映其安全性和有效性[10]。本試驗(yàn)以QbD 理念為指導(dǎo),采用單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對(duì)草蓯蓉顆粒的提取和成型工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,旨在確保顆粒均一、穩(wěn)定、安全和可控,從而為顆粒的成型工藝過(guò)程和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 DS-Y400A型中藥粉碎機(jī)(上海頂帥電器有限公司);KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波有限公司);ML203型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-600型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所);DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 主要材料和試劑 草蓯蓉藥材干品,購(gòu)自吉林市當(dāng)?shù)厮幉氖袌?chǎng),經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院李景華教授鑒定為正品;糖粉、糊精、乳糖和可溶性淀粉,均為藥用級(jí)輔料,均購(gòu)自北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司;用水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水;其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 草蓯蓉浸膏提取工藝優(yōu)化

1.3.1.1 草蓯蓉浸膏的制備 稱取粉碎的草蓯蓉藥材干品,按照Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)條件進(jìn)行水提[11],合并提取液,減壓濃縮即得草蓯蓉浸膏。根據(jù)公式(1)計(jì)算浸膏得率。

(1)

1.3.1.2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 采用Design-Expert 10 軟件,根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法,以提取時(shí)間(A)、液料比(B)和提取次數(shù)(C) 為考察因素,以浸膏得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)(表1)。

表1 提取工藝因素水平

1.3.2 草蓯蓉顆粒成型工藝優(yōu)化

1.3.2.1 草蓯蓉顆粒的制備 精密稱取草蓯蓉浸膏和輔料適量,充分混勻,噴適量乙醇作為潤(rùn)濕劑,制備軟材,使之呈現(xiàn)“握之成團(tuán),輕觸即散”的狀態(tài),然后以14 目篩制粒,65 ℃下常壓干燥1.5 h,經(jīng)過(guò)1和5號(hào)篩篩選即得草蓯蓉顆粒。

1.3.2.2 草蓯蓉顆粒合格率測(cè)定 參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020 版)通則0982 第二法雙篩分法測(cè)定草蓯蓉顆粒合格率。將干燥后的草蓯蓉顆粒稱重,依次過(guò)1和5號(hào)篩,能通過(guò)1號(hào)篩但不能通過(guò)5號(hào)篩的顆粒即為合格顆粒,按照公式(2)計(jì)算顆粒合格率。

(2)

1.3.2.3 草蓯蓉顆粒溶化性測(cè)定 按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020 版)通則0104 所載“可溶顆粒檢查法” 測(cè)定草蓯蓉顆粒溶化性。稱取10 g草蓯蓉顆粒,加(75±2) ℃熱水200 mL,攪拌,測(cè)定全部顆粒溶化所需時(shí)間。如5 min 后仍有顆粒不能完全溶解,則顆粒溶化性不合格。

1.3.2.4 草蓯蓉顆粒吸濕率測(cè)定 稱取2 g 草蓯蓉顆粒,于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h至恒重,將其置于干燥稱量瓶中,分布均勻,打開蓋放在底部盛有NaCl 飽和溶液的干燥器中,將干燥器密封,48 h后精密稱重,按公式(3)計(jì)算草蓯蓉顆粒吸濕率。

吸濕率(%)=

(3)

1.3.2.5 草蓯蓉顆粒感官評(píng)價(jià) 在草蓯蓉顆粒處方優(yōu)化過(guò)程中,選擇以軟材狀態(tài)、顆粒外觀、溶液狀態(tài)和顆粒氣味作為感官評(píng)價(jià)的內(nèi)容[12-13],感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12-13]

1.3.2.6 草蓯蓉顆粒質(zhì)量相關(guān)指標(biāo)分析 本試驗(yàn)采用顆粒合格率、溶化性、吸濕率和感官評(píng)價(jià)作為指標(biāo),這4個(gè)指標(biāo)具有不同的量綱和量綱單位,為了避免指標(biāo)間的量綱影響,需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。根據(jù) Hassan公式對(duì)指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理[14],取值越大越好的指標(biāo)按照公式(4)計(jì)算歸一化值(di),取值越小越好的指標(biāo)按照公式(5)計(jì)算di。

di=(Yi-Ymin)÷Ymax-Ymin

(4)

di=(Ymax-Yi)÷Ymax-Ymin

(5)

式中Yi為實(shí)測(cè)值,Ymax和Ymin系每個(gè)指標(biāo)在不同次試驗(yàn)中測(cè)得的所有值中的最大值和最小值。

計(jì)算出各指標(biāo)的d值后,按照公式(6)計(jì)算總評(píng)歸一值(Overall desirability normalization,OD值)。

OD=(d1×d2…×dn)÷n

(6)

式中n為指標(biāo)數(shù)。

1.3.2.7 填充劑種類對(duì)顆粒質(zhì)量的影響 顆粒常用的填充劑有糖粉、糊精、乳糖和可溶性淀粉等,綜合考慮制粒的吸濕率和成型度問題,本試驗(yàn)采用麥芽糊精、糖粉、乳糖和可溶性淀粉共4種填充劑,按照1.3.2.1項(xiàng)方法制備草蓯蓉顆粒,以O(shè)D值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2.8 填充劑配比對(duì)顆粒質(zhì)量的影響 選擇不同配比的乳糖和糊精作為混合填充劑,按照1.3.2.1項(xiàng)方法制備草蓯蓉顆粒,以O(shè)D值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2.9 浸膏用量對(duì)顆粒質(zhì)量的影響 選擇3∶1的乳糖和糊精作為混合填充劑,逐步增加浸膏用量,按照1.3.2.1項(xiàng)方法制備草蓯蓉顆粒,以O(shè)D值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2.10 潤(rùn)濕劑濃度對(duì)顆粒質(zhì)量的影響 選擇3∶1的乳糖和糊精作為混合填充劑,浸膏用量為6%,以不同濃度乙醇作為潤(rùn)濕劑,按照1.3.2.1項(xiàng)方法制備草蓯蓉顆粒,以O(shè)D值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2.11 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化草蓯蓉顆粒成型工藝 在單因素考察的基礎(chǔ)上確定填充劑配比、浸膏用量和潤(rùn)濕劑濃度是影響顆粒質(zhì)量的關(guān)鍵因素,各因素設(shè)置3個(gè)水平進(jìn)行因素水平設(shè)計(jì)(表3)。以草蓯蓉顆粒合格率、溶化性、吸濕率和感官評(píng)價(jià)的OD值為評(píng)價(jià)指標(biāo)Y進(jìn)行試驗(yàn)。

表3 成型工藝因素水平

2 結(jié)果

2.1 草蓯蓉浸膏提取工藝優(yōu)化

2.1.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 結(jié)果見表4,各因素對(duì)草蓯蓉浸膏得率的回歸方程Y=26.14+0.77×A+0.80×B+0.37×C-1.03×AB-1.48×AC-0.16×BC-2.52×A2-1.76×B2-2.84×C2(R=0.956)。

表4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化草蓯蓉提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

對(duì)模型的分析結(jié)果如表5所示,回歸模型顯著度高(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),相關(guān)系數(shù)R=0.956,說(shuō)明回歸方程擬合度和可信度適當(dāng),該模型能夠分析草蓯蓉浸膏得率與相應(yīng)提取因素之間的關(guān)系,模型與實(shí)際情況擬合較好,適用于分析和預(yù)測(cè)草蓯蓉浸膏得率的實(shí)際情況。分析可知,提取時(shí)間(A)和液料比(B)對(duì)浸膏得率影響顯著(P<0.05),提取次數(shù)(C)對(duì)浸膏得率的影響相對(duì)較弱(P>0.05);交互項(xiàng)AB和AC對(duì)浸膏得率影響顯著(P<0.05),二次項(xiàng)均對(duì)浸膏得率有明顯影響(P<0.05);各因素對(duì)浸膏得率的影響順序?yàn)橐毫媳?B)>提取時(shí)間(A)>提取次數(shù)(C)。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法方差分析(Ⅰ)

2.1.2 草蓯蓉浸膏得率工藝Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法分析 影響草蓯蓉浸膏得率自變量與因變量關(guān)系的等高線和響應(yīng)面曲線見圖1。響應(yīng)面曲線的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀反映各因素對(duì)浸膏得率的影響,曲面越陡峭說(shuō)明因素間的交互作用越顯著;交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可以從等高線的形狀得出,等高線形狀越接近圓形則兩因素的交互作用越弱。由圖1可知,各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響交互項(xiàng)強(qiáng)弱順序?yàn)锳C>AB>BC,這一結(jié)果與2.1.1中方差分析的結(jié)果一致。

圖1 各因素對(duì)草蓯蓉浸膏得率影響的響應(yīng)面曲線和等高線

2.1.3 浸膏得率回歸模型驗(yàn)證 采用Design-Expert 10軟件預(yù)測(cè)草蓯蓉浸膏最優(yōu)提取工藝參數(shù)為:提取時(shí)間62 min,液料比10.4∶1,提取次數(shù)2次?？紤]到實(shí)施工藝參數(shù)的實(shí)際可操作性,將最佳工藝條件修正為:提取時(shí)間60 min,液料比10∶1,提取次數(shù)2次。為檢驗(yàn)修正后工藝參數(shù)的合理性,在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),經(jīng)模型預(yù)測(cè)浸膏得率為26.14%,驗(yàn)證試驗(yàn)浸膏得率平均為(25.96±0.59)%,觀察值和模型預(yù)測(cè)值比較接近,說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好。

2.2 草蓯蓉顆粒成型工藝優(yōu)化

2.2.1 填充劑種類對(duì)顆粒質(zhì)量的影響 不同填充劑種類對(duì)草蓯蓉顆粒質(zhì)量的影響結(jié)果見表6,以乳糖作為填充劑時(shí),OD值最高,但在制粒過(guò)程中產(chǎn)生粉末較多,所以選擇與其評(píng)分接近且成本較低的糊精作為填充劑,以改善顆粒成型工藝。

表6 不同填充劑種類對(duì)顆粒質(zhì)量的影響

2.2.2 填充劑配比對(duì)顆粒質(zhì)量的影響 不同配比的乳糖和糊精對(duì)顆粒質(zhì)量的影響結(jié)果見表7。由于乳糖吸濕性較低,隨著乳糖比例的升高,草蓯蓉顆粒的吸濕率不斷下降,同時(shí)合格率逐步升高,溶化時(shí)間呈降低趨勢(shì)。但乳糖比例過(guò)高會(huì)出現(xiàn)粉末增多,制粒性不好的問題,并且會(huì)提高成本,同時(shí)進(jìn)一步增加乳糖比例對(duì)顆粒質(zhì)量的改善并不顯著,綜合考量乳糖與糊精的比例為3∶1較為合適。

表7 不同填充劑配比對(duì)顆粒質(zhì)量的影響

2.2.3 浸膏用量對(duì)顆粒質(zhì)量的影響 不同浸膏用量對(duì)顆粒質(zhì)量的影響結(jié)果見表8,隨著浸膏用量的增加,草蓯蓉顆粒合格率逐步下降,吸濕率上升,溶化時(shí)間延長(zhǎng),綜合藥效和成本考慮,選擇浸膏用量為6%。

表8 不同浸膏用量對(duì)顆粒質(zhì)量的影響

2.2.4 潤(rùn)濕劑濃度對(duì)顆粒質(zhì)量的影響 不同潤(rùn)濕劑濃度對(duì)顆粒質(zhì)量的影響結(jié)果見表9,隨著乙醇濃度的升高,草蓯蓉顆粒合格率和溶化時(shí)間都隨之改善,但當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí),制粒過(guò)程中有較多粉末生產(chǎn),所得顆粒松散性提高,故得到較為適合的乙醇濃度為75%。

表9 不同潤(rùn)濕劑濃度對(duì)顆粒質(zhì)量的影響

2.2.5 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化草蓯蓉顆粒成型工藝 結(jié)果見表10,各因素對(duì)草蓯蓉顆粒質(zhì)量影響的回歸方程為Y=0.55+0.021×A+0.089×B+0.014×C+0.011×AB-0.032×AC+0.060×BC-0.047×A2-0.090×B2-0.109×C2。

表10 Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化草蓯蓉顆粒成型工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

對(duì)模型的分析結(jié)果如表11所示,回歸模型顯著度高(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),相關(guān)系數(shù)R= 0.984,說(shuō)明回歸方程擬合度和可信度適當(dāng),該模型能夠分析草蓯蓉顆粒質(zhì)量與相應(yīng)成型因素之間的關(guān)系,模型與實(shí)際情況擬合較好,適用于分析和預(yù)測(cè)草蓯蓉顆粒成型過(guò)程的實(shí)際情況。分析可知,填充劑配比和浸膏用量對(duì)草蓯蓉顆粒質(zhì)量影響顯著(P<0.05),潤(rùn)濕劑濃度的影響相對(duì)較弱(P>0.05);交互項(xiàng)AC和BC對(duì)草蓯蓉顆粒質(zhì)量影響顯著(P<0.05),二次項(xiàng)均對(duì)草蓯蓉顆粒質(zhì)量有明顯影響(P<0.05);在所選的各因素水平范圍內(nèi),各因素對(duì)草蓯蓉顆粒質(zhì)量的影響程度依次為B>A>C,即浸膏用量>填充劑配比>潤(rùn)濕劑濃度。

表11 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法方差分析(Ⅱ)

2.2.6 草蓯蓉顆粒成型工藝Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法分析 影響草蓯蓉顆粒質(zhì)量自變量與因變量關(guān)系的等高線和響應(yīng)面曲線如圖2所示,各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響交互項(xiàng)強(qiáng)弱順序?yàn)锽C>AC>AB,這一結(jié)果與2.2.5中方差分析的結(jié)果一致。

圖2 各因素對(duì)草蓯蓉顆粒成型影響的響應(yīng)面曲線和等高線

2.2.7 草蓯蓉顆粒成型工藝回歸模型驗(yàn)證 采用Design-Expert 10軟件預(yù)測(cè)草蓯顆粒最佳成型工藝參數(shù):填充劑配比3.223∶1,浸膏用量7.15%,潤(rùn)濕劑濃度75.97%,考慮到實(shí)施工藝參數(shù)的實(shí)際可操作性,將最佳工藝條件修正為:輔料配比3∶1,浸膏用量7%,潤(rùn)濕劑濃度75%。根據(jù)篩選得到的最佳成型工藝條件,進(jìn)行5批次驗(yàn)證試驗(yàn),實(shí)際測(cè)得平均OD值為0.561(RSD為0.43%),觀察值和模型預(yù)測(cè)值0.575比較接近,說(shuō)明模型預(yù)測(cè)性良好。故優(yōu)化后的工藝參數(shù)合理可行。

3 討論

本試驗(yàn)基于QbD理念,研究草蓯蓉的提取工藝及其顆粒成型工藝,通過(guò)Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法建立模型,預(yù)測(cè)工藝參數(shù)對(duì)于浸膏得率的影響,研究發(fā)現(xiàn)各工藝參數(shù)對(duì)于草蓯蓉浸膏得率影響大小順序?yàn)?液料比>提取時(shí)間>提取次數(shù),經(jīng)過(guò)回歸分析得到草蓯蓉浸膏最優(yōu)提取工藝為:提取時(shí)間60 min,液料比10∶1,提取2次;實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的吻合度較好,說(shuō)明回歸方程可以較好的預(yù)測(cè)真實(shí)條件下的工藝狀況。本試驗(yàn)進(jìn)一步采用單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化草蓯蓉顆粒成型工藝,以填充劑配比、浸膏用量和潤(rùn)濕劑濃度為考察因素,以顆粒合格率、溶化性、吸濕率和感官評(píng)價(jià)作為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用Hassan法對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行歸一化,求算出OD值作為優(yōu)化使用的響應(yīng)值,避免了各指標(biāo)優(yōu)化條件間的沖突。結(jié)果顯示,各工藝因素對(duì)于顆粒質(zhì)量影響程度存在顯著差異,影響大小依次為:浸膏用量>填充劑配比>潤(rùn)濕劑濃度,優(yōu)化得到成型工藝為:輔料乳糖∶糊精=3∶1,浸膏用量為7%、潤(rùn)濕劑為75%乙醇,實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值基本吻合,說(shuō)明方程預(yù)測(cè)得到工藝參數(shù)具有可行性。

Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法可以在小區(qū)域內(nèi)用簡(jiǎn)單的一次或多次多項(xiàng)式模型來(lái)擬合復(fù)雜的未知函數(shù)關(guān)系。常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法(例如單因素和正交試驗(yàn))建立的均是線性模型,而現(xiàn)實(shí)操作中的工藝參數(shù)和質(zhì)量之間的關(guān)系通常是非線性的,并且參數(shù)之間可能存在交互作用,Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法在試驗(yàn)條件優(yōu)化過(guò)程中可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析,克服了正交試驗(yàn)只能對(duì)每個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析和不能給出直觀圖形的缺陷,適用于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題,可彌補(bǔ)正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)等線性模型精密度低的不足,能更好地揭示自變量和非自變量之間的關(guān)系。Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面法是優(yōu)化工藝條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量、降低開發(fā)成本和解決生產(chǎn)過(guò)程中實(shí)際問題的一種有效方法。本試驗(yàn)中對(duì)于草蓯蓉提取工藝和顆粒成型性的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與模型方程理論值之間的偏差在合理范圍內(nèi),表明所擬合模型預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,優(yōu)選出的工藝穩(wěn)定可行,可以為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供一定參考。