劉守磊,陳善苗,李耀軍,羅 曉,盧紅蓀,王詩(shī)建,沃奇軍,祁小龍

(1.桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 泌尿外科,浙江 桐鄉(xiāng) 314500;2.浙江省人民醫(yī)院 泌尿外科,浙江 杭州 310014)

前列腺癌是一類嚴(yán)重危害男性健康的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。盡管得益于診斷水平的提高及手術(shù)治療、抗雄激素治療和免疫治療等手段的綜合運(yùn)用,患者的整體生存狀況已經(jīng)有了一定的改善,但部分患者仍因發(fā)生轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡[2]。CT45家族是癌睪抗原(cancer/testis antigens,TAs)中的成員之一,由六個(gè)高度保守的基因組成,命名為CT45A1到CT45A6[3-4]。CT45A1在多種類型的惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá),并通過(guò)多種作用機(jī)制發(fā)揮著促腫瘤效應(yīng)[5-7],但CT45A1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其發(fā)揮的作用尚不明確。本研究分析CT45A1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,并從上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化角度探索分子作用機(jī)制,希望為靶向CT45A1控制前列腺癌提供實(shí)驗(yàn)性支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 高侵襲力人前列腺癌PC-3細(xì)胞、低侵襲力人前列腺癌LNCap細(xì)胞以及小鼠肺成纖維NIH-3T3細(xì)胞,均購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。LNCap和PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基,NIH-3T3細(xì)胞置于10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng);所有細(xì)胞均放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑來(lái)自Promega公司,熒光定量PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermofisher公司,定量PCR引物和shRNA寡核苷酸委托上海生工公司合成。慢病毒包裝載體以及shRNA慢病毒表達(dá)載體pLKO.1-puro購(gòu)自Addgene公司。用于遷移實(shí)驗(yàn)的Transwell小室購(gòu)自Corning公司,用于侵襲實(shí)驗(yàn)的包被基質(zhì)膠的BD BioCoatTMBD MatrigelTMInvasion Chamber購(gòu)自BD Biosciences公司。兔抗人CT45A1抗體購(gòu)自O(shè)RIGENE公司,兔抗人β-actin、E-cadherin、Vimentin、Twist、Zeb-1抗體以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)購(gòu)自Proteintech公司。

1.3 重組shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建 按照Addgene網(wǎng)站上提供的方法設(shè)計(jì)基因特異性shRNA序列。CT45A1 shRNA#1的寡核苷酸的序列為5’-CCGGCCAGCCAATTGGATTCTCAGACTCGAGTCTGA GAATCCAATTGGCTGGTTTTTG-3’和5’-AATTCAA AAACCAGCCAATTGGATTCTCAGACTCGAGTCTGAG AATCCAATTGGCTGG-3’;

CT45A1 shRNA#2的寡核苷酸的序列為5’-CCGGCAGCAGTTTCTCTGGAGATGACTCGAGTCATC TCCAGAGAAACTGCTGTTTT TG-3’和5’-AATTCAA AAACAGCAGTTTCTCTGGAGATGACTCGAGTCATCT CCAGAGAAACTGCTG-3’;

作為陰性對(duì)照的Scramble shRNA 的寡核苷酸序列為5’-CCGGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCT CGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGCTCGAGTTTTT G- 3 ’ 和5’-AATTCA AAAACCTAAGGTTAAGTCGC CCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGCTCG AG-3’。

將合成的shRNA片段進(jìn)行退火形成寡核苷酸對(duì),同時(shí)使用AgeⅠ和EcoRⅠ酶切pLKO.1-puro載體并純化回收,再利用T4DNA連接酶將寡核苷酸對(duì)與回收得到的載體進(jìn)行連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中。挑選單一克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定,鑒定正確的shRNA表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pLKO.1-puro-shCT45A1#1,pLKO.1-puro-shCT45A1#2和pLKO.1-puro-shScram。

1.4 慢病毒包裝及感染 參照文獻(xiàn)報(bào)道[8],使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑將shRNA表達(dá)載體與psPax2和pMD2.G病毒包裝載體按 5∶4∶1 的質(zhì)量比轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中;轉(zhuǎn)染8 h后,換成新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h;收集新鮮含病毒上清液過(guò)濾后用于PC-3細(xì)胞的感染。將感染后的細(xì)胞置于含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72 h,得到的細(xì)胞分別標(biāo)記為shCT45A1#1,shCT45A1#2和shScram。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。使用SYBR-Gree方法在Bio-Rad CFX 96 實(shí)時(shí)定量 PCR 系統(tǒng)上檢測(cè) CT45A1 的表達(dá)水平。CT45A1 的上游引物序列為 5’-AGGAAGCAGCAAGATGTATGAG-3’,下游引物序列為5’-CTGGAAGGCTATTTGATTCGG-3’;β-actin(看家基因)的上游引物序列為5’-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3’,下游引物序列為5’-GTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt值計(jì)算 CT45A1 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blot,WB) 收集細(xì)胞提取總蛋白,BCA法對(duì)蛋白定量后依次進(jìn)行SDS PAGE、轉(zhuǎn)膜和脫脂奶粉封閉,分別加入不同的兔抗人多克隆抗體作為一抗,包括抗CT45A1、β-actin、E-cadherin、Zbe-1、Vimentin以及Twist,4 ℃條件下孵育過(guò)夜;再用TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗,室溫孵育2 h后洗膜以及顯影,使用Quantity One 軟件對(duì)各種蛋白的表達(dá)豐度進(jìn)行半定量分析,以β-actin作為內(nèi)參。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞懸液以每孔 5×103個(gè)細(xì)胞/100 μL 的條件接種于96 孔板中,每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于不同時(shí)間點(diǎn)(4 ～ 96 h)將10 μL 的MTT試劑加入每個(gè)孔中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后小心吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO后振蕩混勻15 min,至結(jié)晶物充分溶解;使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量490 nm處的吸光度。

1.8 Transwell 小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

1.8.1 遷移實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)報(bào)道[8],收集細(xì)胞重懸于含0.1%BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中,按照3×104個(gè)細(xì)胞/150 μL/室加至Transwell小室的上室中,下室加入600 μL無(wú)血清條件培養(yǎng)的NIH-3T3細(xì)胞上清液作為趨化因子繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12 h。用棉簽?zāi)▋羯蠈有∈覂?nèi)的細(xì)胞,以甲醇固定后加入結(jié)晶紫溶液染色15 min,洗去多余的染料后晾干。在顯微鏡下觀察并拍照,再切下完整的濾膜置于30%乙酸溶液內(nèi)洗脫,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)OD570 nm讀數(shù)反映細(xì)胞遷移能力。

1.8.2 侵襲實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)報(bào)道[8],收集細(xì)胞重懸于含0.1% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中,按照6×104個(gè)細(xì)胞/150 μL/室加至BD BioCoatTMBD MatrigelTMInvasion Chamber的上室,下室同樣加入600 μL NIH-3T3細(xì)胞條件培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞18 h,后續(xù)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于6孔板中,過(guò)夜后細(xì)胞均勻鋪成單層。用200 μL移液管尖頭輕輕劃擦穿過(guò)孔中心的單層,然后用PBS沖洗3遍以除去漂浮的細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),于0 h和24 h拍照記錄。用Image J軟件分析并計(jì)算劃痕面積(S),細(xì)胞劃痕的愈合率(%)=(S0h-S24h)/S0h×100。

2 結(jié)果

2.1 CT45A1在具有不同侵襲力的前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 熒光定量PCR和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PC-3細(xì)胞中CT45A1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(4.37±0.34)、CT45A1的蛋白表達(dá)水平(2.49±0.12)明顯高于LNCap細(xì)胞,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.23、21.78;均P<0.0001)。見(jiàn)圖1。因此,后續(xù)選用PC-3細(xì)胞進(jìn)行CT45A1基因沉默的實(shí)驗(yàn)學(xué)研究。

注:*與LNCap細(xì)胞比較,P<0.05。

2.2 shRNA重組慢病毒感染對(duì)細(xì)胞中CT45A1表達(dá)水平的影響 將兩種靶向CT45A1的重組慢病毒包括pLKO.1-puro-shCT45A1#1和pLKO.1-puro-shCT45A1#2,以及陰性對(duì)照慢病毒pLKO.1-puro-shScram分別感染PC-3細(xì)胞。熒光定量PCR和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與shScram細(xì)胞相比,shCT45A1#1和shCT45A1#2細(xì)胞中的CT45A1 mRNA表達(dá)水平(圖2A)和蛋白表達(dá)水平(圖2B)均明顯下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注:*與shScram細(xì)胞比較,P<0.05。

2.3 沉默CT45A1基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響 采用MTT法檢測(cè)shCT45A1#1,shCT45A1#2和shScram細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果如封三圖1A所示,三種細(xì)胞在培養(yǎng)4、24、48、72 和96 h時(shí)OD值間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明沉默CT45A1基因不影響PC-3細(xì)胞的體外增殖能力。

2.4 沉默CT45A1基因?qū)?xì)胞遷移和侵襲能力的影響 基于Transwell小室的遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(封三圖1B)顯示,shCT45A1#1組、shCT45A1#2組的穿膜細(xì)胞數(shù)(OD值=0.24±0.07、0.31±0.07)低于shScram組(0.74±0.09);劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果(封三圖1C)顯示,shCT45A1#1和shCT45A1#2組的細(xì)胞劃痕愈合率為(57.99±1.43)%、(58.33±3.60)%,均低于shScram細(xì)胞組;侵襲小室法分別測(cè)試這三種細(xì)胞的侵襲能力,結(jié)果如封三圖1D顯示,shCT45A1#1組、shCT45A1#2組的穿膜細(xì)胞數(shù)(OD值=0.32±0.04、0.15±0.02)低于shScram組(0.11±0.03);差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 沉默CT45A1基因?qū)?xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)表型的影響 WB技術(shù)檢測(cè)EMT相關(guān)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)水平,結(jié)果如圖3所示:與shScram組相比,shCT45A1組中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平升高,而Vimentin的蛋白表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注:*與shScram組比較,P<0.05。

2.6 沉默CT45A1基因?qū)wist和Zeb-1蛋白表達(dá)水平的影響 WB技術(shù)檢測(cè)shCT45A1#1組,shCT45A1#2組和shScram組細(xì)胞中Twist和Zeb-1蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果如圖3所示:Zeb-1蛋白在shCT45A1#1和shCT45A1#2組細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于其在shScram組中的表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而Twist蛋白在這些組別細(xì)胞中的表達(dá)水平并無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討論

癌睪抗原CT45A1在多種惡性腫瘤中高度表達(dá)且發(fā)揮著提升腫瘤細(xì)胞的增殖水平、耐藥性、遷移力和侵襲力的作用,表明其具有原癌基因的特性,然而其在人前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其功能尚無(wú)人報(bào)道。我們?cè)趦煞N被廣泛使用的人前列腺癌細(xì)胞株LNCap和PC-3中測(cè)試了CT45A1的mRNA和蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC-3細(xì)胞表達(dá)較高水平的CT45A1 mRNA和蛋白;鑒于PC-3細(xì)胞比LNCap細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力,筆者推斷CT45A1可能參與調(diào)控了PC-3細(xì)胞的侵襲能力。為了進(jìn)一步明確CT45A1在PC-3細(xì)胞中所發(fā)揮的作用,本研究在利用shRNA技術(shù)抑制CT45A1基因表達(dá)后,系統(tǒng)性分析了PC-3細(xì)胞在增殖、遷移和侵襲能力方面的變化情況。本研究采用了2條不同的shRNA干擾片段去沉默CT45A1基因,據(jù)此獲得的攜帶2種不同shRNA干擾片段的PC-3細(xì)胞在遷移和侵襲能力以及EMT相關(guān)基因表達(dá)水平上的變化基本一致,因而所觀察到的研究結(jié)果不太可能是shRNA導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)。

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,PC-3細(xì)胞的體外增殖能力在CT45A1基因被沉默后未發(fā)生明顯改變,表明CT45A1蛋白的表達(dá)與PC-3 細(xì)胞的增殖能力并無(wú)直接聯(lián)系。有文獻(xiàn)報(bào)道,CT45A1在一些腫瘤細(xì)胞如肺癌細(xì)胞中具有促進(jìn)增殖的效應(yīng)[6],而在另一些腫瘤細(xì)胞如纖維肉瘤細(xì)胞中敲低其表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞增殖水平并無(wú)明顯影響[9],因而CT45A1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響具有細(xì)胞背景依賴性。借助于體外遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)沉默CT45A1基因?qū)е翽C-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力受損,表明CT45A1基因發(fā)揮了促進(jìn)PC-3細(xì)胞遷移和侵襲的效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)一種名為EMT的表型轉(zhuǎn)換來(lái)提升惡性轉(zhuǎn)化能力進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤組織局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用,發(fā)生EMT的細(xì)胞的典型特征性表現(xiàn)是上皮細(xì)胞標(biāo)志物(如:E-cadherin)表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(如:Vimentin)表達(dá)水平上升;與此同時(shí)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)[10-11]。蛋白印跡法結(jié)果顯示,沉默CT45A1基因?qū)е翽C-3細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào),同時(shí)Vimentin 蛋白表達(dá)受到抑制,提示沉默CT45A1基因可以通過(guò)削弱PC-3細(xì)胞的EMT表型來(lái)減弱PC-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

Zeb-1和Twist是在生理和病理?xiàng)l件下調(diào)控EMT表型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,二者均在前列腺癌中高度表達(dá),同時(shí)它們的高度表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[12-17];沉默Zeb-1或者Twist基因均能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的EMT表型并降低遷移和侵襲能力[15,17],提示這兩種基因均可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT來(lái)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。Shang等[5]報(bào)道在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CT45A1可以通過(guò)提升Twist基因的表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)EMT的發(fā)生,但本研究發(fā)現(xiàn),敲低CT45A1在抑制前列腺癌細(xì)胞EMT的同時(shí)并不影響Twist的表達(dá)水平,提示我們CT45A1對(duì)Twist的調(diào)控具有細(xì)胞背景依賴性。有意思的是,本研究發(fā)現(xiàn)敲低CT45A1能顯著降低PC-3細(xì)胞中Zeb-1蛋白的表達(dá)水平,提示CT45A1可能通過(guò)上調(diào)Zeb-1的蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)EMT進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)PC-3細(xì)胞遷移和侵襲的作用。值得指出的是,CT45A1對(duì)于Zeb-1的這種調(diào)控關(guān)系目前尚未有報(bào)道,它是否特異性存在于前列腺癌細(xì)胞中,抑或也適用于其他腫瘤細(xì)胞仍需進(jìn)一步的探討。另一方面,CT45A1調(diào)控Zeb-1的具體機(jī)制也有待闡明,近期Wen等[7]報(bào)道CT45A1可以與β-catenin發(fā)生蛋白間互作而促進(jìn)后者的蛋白表達(dá),需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)CT45A1是否可能通過(guò)類似的機(jī)制來(lái)調(diào)控Zeb-1蛋白的表達(dá)。

綜上所述,CT45A1基因在高侵襲性前列腺癌細(xì)胞PC-3中高度表達(dá);盡管沉默CT45A1基因不影響PC-3細(xì)胞的增殖能力,卻可以顯著抑制后者的遷移和侵襲,這可能是通過(guò)逆轉(zhuǎn)Zeb-1介導(dǎo)的EMT來(lái)實(shí)現(xiàn)的。鑒于CT45A1能通過(guò)驅(qū)動(dòng)EMT來(lái)促進(jìn)前列腺癌的遷移和侵襲,靶向該分子的治療方法有望用于治療前列腺癌轉(zhuǎn)移。我們的研究還存在一些不足之處,尤其是沒(méi)有在荷瘤小鼠模型中探索Zeb-1是否介導(dǎo)了CT45A1對(duì)前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。