汪思云 李藝博 譚春霞 盧濤

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全球癌癥相關(guān)死亡病例中位居第四，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，死亡率接近全球發(fā)病率[1]。HCC疾病的預(yù)后很差，因此尋找有效的治療肝細(xì)胞癌的方法和藥物是抗腫瘤的熱點(diǎn)之一。

補(bǔ)骨脂有溫腎助陽、納氣止瀉的功效，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤和促進(jìn)骨生長(zhǎng)等多種藥理作用[2]。補(bǔ)骨脂素（psoralen，PSO）是補(bǔ)骨脂的呋喃香豆素類化合物，有研究報(bào)道其對(duì)HepG2細(xì)胞有體外細(xì)胞毒性，且能夠逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥[3]。補(bǔ)骨脂素還可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-actin通路使MCF-7細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖[4]。但是補(bǔ)骨脂素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制研究尚不夠深入。

RNA-seq技術(shù)是指利用高通量測(cè)序技術(shù)，將細(xì)胞或組織中的mRNA、微小RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，在一定條件和時(shí)間下比較來自不同組織和條件的基因表達(dá)譜，進(jìn)而得到差異表達(dá)基因[5]，有助于認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生發(fā)展過程和藥物在生命體的作用機(jī)制。

補(bǔ)骨脂素在抗腫瘤、治療白癜風(fēng)頑疾、白血病等方面有眾多臨床應(yīng)用，本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析補(bǔ)骨脂素對(duì)HepG2細(xì)胞作用后基因表達(dá)水平的差異，探索其可能的作用靶點(diǎn)和機(jī)制，為補(bǔ)骨脂素的臨床合理用藥研究和應(yīng)用提供參考。

材料與方法

1 主要試劑和儀器

補(bǔ)骨脂素購于上海源葉生物科技有限公司（B20123-20 mg）；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8）增強(qiáng)型（CK001）；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司（D5879-1）；胎牛血清（04-001-1）、DMEM培養(yǎng)基（01-057-1A）、凍存液（05-065-1）均購于以色列Biological Industries公司；青、鏈霉素（Penicillin-Streptomycin）購于美國(guó)Gibco公司（15140122）；天根總RNA提取試劑盒購于北京天根生化科技公司（DP451）；細(xì)胞周期試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司（C1052）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter CytoFlex S，美國(guó)）；酶標(biāo)儀Epoch，（BioTek，美國(guó)）；qPCR引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥

肝癌HepG2細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫（北京），其培養(yǎng)條件為含有10%胎牛血清、1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2的 37 ℃培養(yǎng)箱。用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化傳代。設(shè)置空白組、對(duì)照組及不同濃度的補(bǔ)骨脂素（62.5、125、250、500 μM）處理HepG2細(xì)胞12 h和24 h。

2.2 CCK-8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以5.0×103個(gè)/孔接種于96孔板，按照2.1用不同濃度補(bǔ)骨脂素處理，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，加藥后，培養(yǎng)液更換為含有10 μL CCK-8試劑的培養(yǎng)基，待培養(yǎng)箱孵育約1.5 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度（A450 nm）值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A 450 nm-空白組A 450 nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A 450 nm-空白組A 450 nm）× 100%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇250 μM補(bǔ)骨脂素作用24 h。

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)

將HepG2細(xì)胞以2.0×105個(gè)/孔接種于六孔板，用250 μM的補(bǔ)骨脂素處理24 h，胰酶消化并收集細(xì)胞沉淀，用1 mL的預(yù)冷的PBS重懸并1 000 g離心5 min，去上清，加入70%乙醇固定過夜。加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸離心后，加入配置好的碘化丙啶染色液500 μL，37 ℃避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)，用ModFit LT 5.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2.4 RNA-seq測(cè)序分析

HepG2細(xì)胞的RNA-seq測(cè)序由深圳華大基因公司進(jìn)行，平行設(shè)置3組對(duì)照組（Control組）和補(bǔ)骨脂素組（PSO組），利用試劑盒提取RNA構(gòu)建文庫上機(jī)測(cè)序，利用華大基因的Dr.Tom多組學(xué)交互系統(tǒng)（https://biosys.bgi.com）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選差異表達(dá)的基因并繪制表達(dá)量聚類熱圖。

2.5 GO和KEGG富集分析

通過華大基因的Dr.Tom多組學(xué)交互系統(tǒng)進(jìn)行GO功能富集分析，確定差異基因表達(dá)主要的生物學(xué)功能。通過KEGG通路富集分析差異基因的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。以p-value值＜0.05為差異基因中顯著的GO注釋和富集通路。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因表達(dá)水平

將HepG2細(xì)胞以2.0×105個(gè)/孔接種于六孔板，給予補(bǔ)骨脂素250 μM（每組三個(gè)復(fù)孔）處理24 h后，利用試劑盒提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用兩步法進(jìn)行PCR熒光定量檢測(cè)（反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃ 10 s，退火＆延伸60 ℃ 30 s），以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（引物序列見表1），實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

表1 qRT-PCR驗(yàn)證引物序列

表2 reads過濾質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Prism 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組均數(shù)采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 補(bǔ)骨脂素對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

CCK-8結(jié)果顯示（圖1），補(bǔ)骨脂素對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯抑制增殖作用，且呈劑量依賴性，與對(duì)照組相比250、500 μM的補(bǔ)骨脂素作用HepG2細(xì)胞12 h和24 h后，細(xì)胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇補(bǔ)骨脂素250 μM處理24 h。

圖1 補(bǔ)骨脂素作用HepG2細(xì)胞的存活率（）

2 補(bǔ)骨脂素作用HepG2細(xì)胞周期的變化

HepG2細(xì)胞經(jīng)補(bǔ)骨脂素處理后，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，細(xì)胞周期中處于G0/G1期比例明顯增加，G2/M期比例明顯減少（76.90%vs66.82%，7.91%vs16.64%）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 補(bǔ)骨脂素對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞周期的影響（）

3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評(píng)估

測(cè)序的原始數(shù)據(jù)包含低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads，數(shù)據(jù)分析之前需要去除這些reads以保證結(jié)果的可靠性。過濾后得到高質(zhì)量的reads達(dá)到92%以上，GC平均含量為51.48%，說明測(cè)序質(zhì)量較好，完整性高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

4 差異基因統(tǒng)計(jì)分析

分析補(bǔ)骨脂素處理組與對(duì)照組HepG2細(xì)胞的差異表達(dá)基因，以P＜0.05且|log2FC|≥1.5為篩選條件。結(jié)果顯示（圖3）共有286個(gè)差異基因，其中上調(diào)130個(gè)，下調(diào)156個(gè)。差異基因熱圖聚類分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)補(bǔ)骨脂素干預(yù)HepG2細(xì)胞的生物學(xué)過程和功能區(qū)分明顯（圖4）。

圖3 補(bǔ)骨脂素處理HepG2細(xì)胞的差異基因火山圖

圖4 補(bǔ)骨脂素處理HepG2細(xì)胞的差異基因熱圖

5 GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能富集最顯著的前20個(gè)注釋進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在生物學(xué)過程（biological process，BP）中主要富集在核糖體生物合成、有絲分裂、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的正向調(diào)節(jié)等過程。富集差異基因較多的細(xì)胞組分（cellular component，CC）主要包括細(xì)胞質(zhì)、核小體、胞質(zhì)。分子功能（molecular function，MF）主要是結(jié)合信號(hào)序列（圖5）。KEGG富集分析結(jié)果顯示（圖6），差異表達(dá)基因共涉及354個(gè)通路，我們篩選出了前20個(gè)顯著富集的KEGG通路，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在核糖體蛋白、細(xì)胞周期信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、剪切體等信號(hào)通路。其中，與細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的通路中差異基因較多。

圖5 補(bǔ)骨脂素顯著差異基因GO功能富集分析

圖6 KEGG信號(hào)通路富集氣泡圖

6 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR驗(yàn)證差異基因

根據(jù)GO和KEGG差異基因富集的分析，補(bǔ)骨脂素作用于HepG2細(xì)胞與影響其細(xì)胞周期信號(hào)通路有關(guān)，因此選取與cell cycle通路和p53信號(hào)通路最顯著的相關(guān)基因p53、GADD45B、CDK2、CDK4、RRM2、CCND1進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示（圖7）p53、GADD45B基因上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；CDK2、RRM2、CCND1基因下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

圖7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因的表達(dá)

討 論

有研究顯示補(bǔ)骨脂素處理細(xì)胞24h后的IC50=176.5813 μM[6]。本研究CCK-8實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了250 μM的補(bǔ)骨脂素可明顯降低肝癌細(xì)胞的存活率，具有一定的細(xì)胞毒性作用。

RNA-seq測(cè)序技術(shù)是一種用于研究細(xì)胞或組織中全mRNA分子的高通量測(cè)序方法，其可以提供基因表達(dá)譜的分析，從分子層面了解在特定條件下的基因表達(dá)模式和功能調(diào)控機(jī)制[7]。利用RNA-seq測(cè)序技術(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞經(jīng)過補(bǔ)骨脂素處理后在轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達(dá)有明顯差異。GO功能富集結(jié)果提示其在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能等方面均存在較大差異。KEGG通路富集分析提示差異顯著基因主要富集在細(xì)胞周期通路，表明細(xì)胞周期可能在補(bǔ)骨脂素抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞生長(zhǎng)、遺傳物質(zhì)復(fù)制和細(xì)胞分裂過程與細(xì)胞周期的高度調(diào)控密切相關(guān)，細(xì)胞周期在分子水平上由細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）介導(dǎo)[8-9]。Cyclin D和CDK4/6在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，可使Rb蛋白磷酸化和失活，阻滯細(xì)胞增殖周期進(jìn)入S期[10]。CCND1（cyclin D1）基因的過表達(dá)是HCC發(fā)病的可能危險(xiǎn)因素，其增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，在細(xì)胞周期的G1-S期轉(zhuǎn)變中起到關(guān)鍵作用[11]。p53是重要的腫瘤抑制基因，在正常情況下p53基因?qū)?xì)胞分裂起著減慢或監(jiān)視的作用。有研究表明激活p53基因可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的周期阻滯及凋亡，參與細(xì)胞的新陳代謝和DNA修復(fù)過程[12]。本研究表明補(bǔ)骨脂素可以上調(diào)p53基因的表達(dá)，下調(diào)CDK2和CCND1基因表達(dá)，阻滯肝癌細(xì)胞周期的進(jìn)程，其中G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例降低。

核糖核苷酸還原酶M2（RRM2）是一種催化核糖核苷酸脫氧還原為脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的酶，編碼蛋白（M2）的合成以細(xì)胞周期依賴性方式進(jìn)行調(diào)節(jié)，有研究表明其對(duì)DNA復(fù)制和修復(fù)至關(guān)重要[13]。RRM2基因的高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，可以作為幾種癌癥的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物[14]。YANG[15]等通過挖掘癌癥基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2（RRM2）是HCC的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。生長(zhǎng)抑制與DNA損傷修復(fù)基因B（GADD45B）基因與DNA修復(fù)、DNA甲基化、細(xì)胞周期、細(xì)胞生存、細(xì)胞炎癥相關(guān)。研究表明索拉非尼等多種VEGFR靶向藥物可通過促進(jìn)GADD45B表達(dá)，來抑制癌細(xì)胞增殖[16]。有研究證明GADD45B在肝癌中表達(dá)特異性下調(diào)，且其表達(dá)與肝癌的組織分化、核分級(jí)等臨床指標(biāo)成負(fù)相關(guān)[17]。qPCR結(jié)果驗(yàn)證補(bǔ)骨脂素作用HepG2細(xì)胞后RRM2基因表達(dá)明顯下調(diào)，GADD45B基因表達(dá)上調(diào)，提示其可能是潛在的作用靶標(biāo)。

綜上所述，補(bǔ)骨脂素可能通過HepG2細(xì)胞周期和p53信號(hào)通路發(fā)揮腫瘤抑制作用，與RRM2、p53、CDKs、GADD45B的調(diào)控有關(guān)。此外有補(bǔ)骨脂及其復(fù)方制劑在臨床使用過程中引起肝臟不良反應(yīng)的報(bào)道，其臨床安全用藥也面臨著挑戰(zhàn)。本文論述了其良好的臨床應(yīng)用潛力，為補(bǔ)骨脂素的進(jìn)一步研究提供參考，但在臨床用藥時(shí)需建立全面系統(tǒng)的安全用藥指南。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突