姚挺英 柳麗娟 廖柏濤 魏玉仙

福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院（金山院區(qū)）檢驗科，福建福州 350007

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持續(xù)感染引起的一種肝臟疾病，若臨床未及時進行有效干預(yù)，部分患者可進展為肝硬化、肝纖維化、肝癌，這是全球范圍內(nèi)面臨的一個重要的公共衛(wèi)生問題[1-2]。HBV屬嗜肝DNA病毒，具有較強傳染性、環(huán)境適應(yīng)性，最初入侵機體后可在固有免疫防御中逃避[3]，隨著慢性HBV持續(xù)感染，導(dǎo)致宿主的固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答功能障礙，引起肝臟組織發(fā)生不同程度炎癥，進一步發(fā)展為肝纖維化，最終發(fā)展為肝硬化、肝癌[4]。可見，評估患者肝纖維程度及進展性在HBV患者臨床管理中起著重要的作用。

臨床常選用肝穿刺活檢作為肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，雖具有一定應(yīng)用價值，但因?qū)儆谇秩胄圆僮骺蓳p傷機體[5]。HBV-脫氧核糖核酸（HBV-DNA）載量、HBV血清檢測、肝功能五項及肝纖維化血清標(biāo)記物等可用來診斷CHB和評估病情嚴(yán)重程度[6]，其中HBV-DNA是HBV感染最直接、特異性強和靈敏性高的指標(biāo)[7]，HBV血清檢測（即乙肝五項）是診斷HBV感染常用的臨床指標(biāo)，而肝功能五項存在低特異度、低靈敏度的缺陷[8]，肝纖維化血清標(biāo)記物無法對早期CHB進行診斷[9]。基于此，本研究嘗試分析CHB血清核心抗體與HBV-DNA、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、肝臟組織纖維化分期相關(guān)性及臨床價值，旨在為臨床診斷CHB提供臨床參考。

資料與方法

1 研究對象

將2018年1月—2022年12月于福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院感染科住院并行肝臟穿刺活檢的CHB患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）CHB患者依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》診斷[10]；（2）入選前乙型肝炎表面抗原持續(xù)陽性不低于六個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）乙肝病毒感染以外的其他肝病或人類免疫缺陷病毒感染；（2）合并有臟器腫瘤；（3）肝組織活檢所取的標(biāo)本長度不足15 mm或肝組織纖維化分期不明確；（4）臨床資料和常規(guī)實驗室檢測指標(biāo)不完整；（5）既往接受過抗病毒治療或三個月內(nèi)使用降酶藥物；（6）其他原因所致的肝硬化，如高脂血癥、酒精肝、非酒精肝等。總共200例CHB初治患者納入本研究，其中男116例，女84例；年齡24～68歲，平均（43.64±11.65）歲；體質(zhì)量指數(shù)21.6～27.2 kg/m2，平均（24.23±0.99）kg/m2；病程8個月～18年，平均（8.71±3.19）年；肝臟炎癥分級：9例G0， 26例G1， 63例G2，67例G3，35例G4；肝臟纖維化分期：50例S1期，50例S2期，50例S3期，50例S4期。本研究根據(jù)纖維化嚴(yán)重程度分為輕度組（S0～S1期，50例）、中重度組（S2～S4期，150例）。本研究得到福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（審批號：20170045）。

2 方法

2.1 臨床資料和實驗室指標(biāo)

患者臨床資料通過住院電子病歷獲取，包括年齡、性別、既往病史等，所有患者均在肝臟穿刺活檢前一周內(nèi)采集外周血檢測相關(guān)實驗室指標(biāo)。HBcAb由北京萬泰生物caris200化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進行定量檢測，標(biāo)本OD值/臨界OD值比值（S/CO）測定HBcAb＜1S/CO為陽性；HBsAg由美國雅培i2000全自動化學(xué)發(fā)光儀進行檢測，HBsAg檢測值＞1S/CO為陽性；采用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀檢測血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（glutamyl transpeptidase，GGT）、免疫球蛋白、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）；采用邁瑞B(yǎng)C-6600plus全自動血細(xì)胞分析儀檢測血小板計數(shù)（platelet count，PLT）、白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell count，WBC）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）等指標(biāo)；采用STAGO全自動凝血分析儀檢測凝血酶原國際比值；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）由日本富士LumipulseG1200全自動化學(xué)發(fā)光酶免疫分析儀檢測；采用深圳新產(chǎn)業(yè)MAGLUMI化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測血清層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原N端肽、透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原；采用實時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA，由西安天隆核酸提取儀進行血清核酸提取，由TIB-8600實時熒光定量PCR儀進行擴增，試劑盒購于泰普生物科學(xué)有限公司。其中HBV-DNA結(jié)果以log10IU/mL為單位進行轉(zhuǎn)換，定量檢測線性范圍為：2.0×101IU/mL～1.0×109IU/mL，最低檢出限為10 IU/mL，病毒載量＞20 IU/mL為陽性。

2.2 APRI和FIB4指數(shù)

計算天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶與血小板比率指數(shù)（aspartate aminotransferase and platelet ratio index，APRI）、FIB4指數(shù)，APRI=AST/ULN×100/PLT（109/L），ULN為AST正常上限值；FIB4=[年齡×AST]/[PLT（109/L）×ALT的平方根][11]。

2.3 觀察指標(biāo)

（1）單因素分析輕度組、中重度組患者臨床資料（年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、肝臟炎癥分級）、實驗室指標(biāo)（ALT、AST、GGT、ARPI、FIB4、凝血酶原國際比值、免疫球蛋白、TBIL、ALP、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原N端肽、透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原、PLT、WBC、Hb、甲胎蛋白、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg）。

（2）分析HBcAb與HBV-DNA、HBsAg、肝臟組織纖維化分期相關(guān)性。

（3）采用LASSO回歸篩選變量，分析中重度肝臟組織纖維化的相關(guān)影響因素。

（4）受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析肝臟炎癥分級、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg診斷中重度肝臟組織纖維化的價值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 25.0軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以[n（%）]表示、χ2檢驗，等級資料用Ridit檢驗；計量資料采用K-S正態(tài)性檢驗，確認(rèn)近似服從符合正態(tài)分布規(guī)律，采用t檢驗，以（）表示；相關(guān)性分析采用Spearman/Pearson相關(guān)系數(shù)模型，運用LASSO回歸篩選變量，診斷效能分析采用ROC曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 中重度肝臟組織纖維化的單因素分析

中重度組病程長于輕度組，肝臟炎癥分級分布較輕度組嚴(yán)重，ALT、AST、TBIL、ALP、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原N端肽、透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原、HBcAb高于輕度組，HBV-DNA、HBsAg低于輕度組（P＜0.05）。見表1。

表1 中重度肝臟組織纖維化的單因素分析

2 HBcAb與HBV-DNA、HBsAg、肝臟組織纖維化分期相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，HBcAb與肝臟組織纖維化分期呈正相關(guān)（rs=0.285），與HBV-DNA、HBsAg呈負(fù)相關(guān)（r=-0.384、-0.354，P＜0.05）；HBVDNA、HBsAg與肝臟組織纖維化分期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.265、-0.266，P＜0.05）。見圖1。

圖1 HBcAb與HBV-DNA、HBsAg相關(guān)性

3 Lasso推論模型分析

運用R語言glmnet程序包，以肝纖維化情況（賦值：輕度=0，中重度=1）為因變量，以單因素分析中P＜0.05的13個變量為自變量：病程、肝臟炎癥分級、ALT、AST、TBIL、ALP、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原N端肽、透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原、HBcAb、HBVDNA、HBsAg進行LASSO回歸分析（除肝臟炎癥分級賦值G0=0，G1=1，G2=2，G3=3，G4=4外，其余變量均為連續(xù)變量，按實際值賦值），隨著懲罰系數(shù)λ變化，模型初始納入的13個影響因素的系數(shù)被壓縮，避免了模型的過度擬合，達到最佳影響因素選擇的效果圖（圖2）。采用交叉驗證法繪制均方誤差隨logλ的變化圖（圖3），尋找到可使模型性能優(yōu)良且影響因素最少的最佳懲罰系數(shù)λ，即圖中虛線對應(yīng)的λ=-2.30。依據(jù)此λ值選出4個預(yù)測變量為肝臟炎癥分級、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg。肝臟炎癥分級、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg是中重度肝纖維化相關(guān)影響因素（P＜0.05），見表2。

圖2 LASSO回歸篩選變量動態(tài)過程圖

圖3 交叉驗證最佳參數(shù)λ的選擇過程圖

表2 Lasso推論模型的二項Logistic回歸分析結(jié)果

4 中重度肝臟組織纖維化的無創(chuàng)診斷分析

繪制肝臟炎癥分級、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg診斷中重度肝臟組織纖維化的ROC曲線顯示，HBV-DNA診斷的AUC最大，診斷敏感度為88.00%，特異度為62.00%；采用SPSS聯(lián)合應(yīng)用ROC理論模式，對各單獨項目進行綜合回歸，建立Logistic診斷評估模型，用以分析四者聯(lián)合診斷價值，結(jié)果顯示，四者聯(lián)合診斷的AUC為0.920，大于任一單一項目（Z=5.009、3.142、4.683、4.441，均P＜0.05），聯(lián)合診斷敏感度為90.00%，特異度為82.00%，見圖4、表3。

圖4 中重度肝臟組織纖維化的無創(chuàng)診斷ROC曲線

表3 中重度肝臟組織纖維化的無創(chuàng)診斷ROC分析結(jié)果

討 論

CHB是一種免疫細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟損傷[12]，慢性HBV侵襲機體后HBV-DNA大量復(fù)制可激活體內(nèi)非特異性免疫，改變肝內(nèi)結(jié)締組織增生，誘導(dǎo)肝細(xì)胞外基質(zhì)大量合成并募集在肝臟，可導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生，因此，CHB也被認(rèn)為是免疫性肝炎[13]。機體一旦發(fā)生肝纖維化很難逆轉(zhuǎn)，臨床應(yīng)盡早預(yù)防或發(fā)現(xiàn)肝纖維化，可有效預(yù)防CHB疾病進展[14]。

本研究單因素分析顯示，ALT、AST、TBIL、ALP、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原N端肽、透明質(zhì)酸等13個變量可能是中重度肝臟組織纖維化的影響因素。由于影響其相關(guān)因素較多，為避免出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，本研究運用R語言glmnet程序包，以單因素分析中P＜0.05的13個變量進行LASSO回歸分析，隨懲罰系數(shù)λ變化，模型初始納入的13個影響因素的系數(shù)被壓縮，避免了模型的過度擬合，其中HBcAb、HBVDNA、HBsAg、肝臟炎癥分級4個變量λ未歸零，以上4個變量均是影響中重度肝纖維化相關(guān)影響因素。

HBV-DNA載量是評價HBV復(fù)制活躍程度的重要手段，也是治療CHB復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素 。YANG等[15]報道稱，CHB患者經(jīng)抗纖維化治療，肝纖維化水平、HBV-DNA載量明顯改變，同時肝組織損傷也得到明顯改善。HBV血清學(xué)檢查（乙肝5項）是臨床判斷CHB患者感染、評估病情的常用指標(biāo)，可從不同角度反映患者HBV感染情況[16]。HBcAb是體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一種中和性抗體，在HBV感染早期發(fā)生陽轉(zhuǎn)；LI等[17]研究發(fā)現(xiàn)，中重度纖維化患者血清HBcAb水平高于單純CHB患者或輕度纖維化患者，說明HBcAb在評估患者肝纖維化中發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，HBcAb水平與HBV感染后不同時期密切相關(guān)，在免疫耐受期水平HBcAb較低，隨HBV大量復(fù)制可激活機體非特異性免疫過程，導(dǎo)致HBcAb在免疫清除期水平升高，在非活動HBsAg攜帶者或低復(fù)制時期HBcAb水平就很低，表明HBcAb水平高低與炎癥密切相關(guān)[18]。HBsAg是乙肝病毒的外殼蛋白，自身不具備傳染，常伴HBV存在，是HBV感染的標(biāo)記，HBsAg水平高低可反映HBV在肝細(xì)胞復(fù)制中的活躍程度[19]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，低水平HBsAg患者通過干擾素聯(lián)合核苷類藥物治療可提高HBsAg清除率，治愈率較高[20]。肝臟纖維化或炎癥是慢性HBV感染疾病進展的關(guān)鍵因素，2019年版中國《慢性乙型肝炎防治指南》指出肝臟組織炎癥分級≥G2或纖維化≥S2，疾病進展風(fēng)險較高，需要接受抗病毒治療，以延緩疾病進展[10]；目前，肝臟活檢穿刺是評價肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可用于評估患者肝纖維化程度和肝臟炎癥[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，中重度組HBcAb高于輕度組，HBVDNA、HBsAg低于輕度組，這與LI等[17]研究相似，與NISHIDA等[22]研究結(jié)果不一致。而曾艷麗等[23]研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化程度越嚴(yán)重，HBcAb越高，HBVDNA、HBsAg水平越低，提示HBcAb與HBV-DNA、HBsAg呈負(fù)相關(guān)，與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且HBcAb＞10標(biāo)本OD值/臨界OD值比值為截斷值時，預(yù)測中重度肝纖維化的敏感性為72.9%、特異度為52.63%。本研究經(jīng)Spearman/Pearson相關(guān)分析顯示，HBcAb與肝臟組織纖維化分期呈正相關(guān)，與HBVDNA、HBsAg呈負(fù)相關(guān)，與上述結(jié)果一致。本研究將肝臟炎癥分級、HBcAb、HBV-DNA、HBsAg繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)以上因素聯(lián)合診斷中重度肝臟組織纖維化的AUC優(yōu)于單獨診斷，敏感度為90.00%、特異度為82.00%，提示其聯(lián)合預(yù)測具有一定診斷效能。

綜上所述，血清HBCAb與肝纖維化呈正相關(guān)，與HBV-DNA和HBsAg呈負(fù)相關(guān)，且以上指標(biāo)聯(lián)合診斷中重度肝臟組織纖維化具有一定臨床診斷價值，本研究為進一步了解CHB免疫學(xué)機制提供參考，并為中重度肝纖維化的無創(chuàng)診斷提供一種新方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突