黃曉珊，王亞琴，盧佳佳，曾俊棠，黃爍，范宇夢，呂立銘，李大煒

（ 惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東惠州，516025）

0 引言

新型冠狀病毒肺炎的爆發(fā)使人們逐漸認識到小型密閉空間的空氣質(zhì)量對健康的影響。而評估空間空氣質(zhì)量的重要指標之一是微生物含量［1］。為了減少微生物對空氣質(zhì)量的影響，現(xiàn)多采用化學(xué)消毒、換氣或過濾的方法，但這些方法往往對人體不夠友好或效率低下［2-4］。在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，熏香法是最常見的空氣抑菌消毒技術(shù)之一［5，6］?，F(xiàn)代研究表明，許多中藥材中包含的揮發(fā)性成分具有良好的抑制或殺滅空氣浮游菌的作用［7-11］。然而，單一種類的中藥揮發(fā)油的抑菌作用范圍較窄，難以對復(fù)雜的微生物群產(chǎn)生良好的抑菌效果，需通過復(fù)配起到協(xié)同增效和拓寬抑菌譜的作用［12，13］。揮發(fā)油氣相接觸體外抑菌優(yōu)于分散在培養(yǎng)基中固相接觸的效果［14-16］，原因可能是液相和固相在應(yīng)用時都要進行乳化并包裹上水膜才能分散，而氣相親脂性分子更容易穿過細胞壁，通過影響膜脂和膜蛋白破壞細胞膜而發(fā)揮作用［17，18］。中藥空氣抑菌消毒法具有純天然、無毒、安全等優(yōu)勢，可以實現(xiàn)安全的連續(xù)性抑菌消毒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

耗材：丁香、艾葉、香茅揮發(fā)油（廣州化工）；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；φ7cm 快速濾紙、φ9cm 硼硅玻璃培養(yǎng)皿均采購自國內(nèi)供應(yīng)商。

主要儀器設(shè)備：DSX-280B 立式滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2F 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ZRG-1000C-LC 智能人工氣候箱（上海丙林電子科技有限公司）；P-C20L/H 超純水機（中壯純凈水科技有限公司）。

1.2 復(fù)配抑菌劑試驗方法

采用最優(yōu)混料設(shè)計（D-Optimal）進行配方篩選［19-21］。對前期研究所得的3 種高效抑菌的植物揮發(fā)油進行復(fù)配。利用Design-Expert 12.0 中自帶的Optimal（custom）進行試驗設(shè)計，隨機組成16 個模擬配方組合（運行序列），見表1。以一定量揮發(fā)油處理后的平板孵育菌落數(shù)量作為考察指標，對3 種植物揮發(fā)油復(fù)配比例與孵育菌落數(shù)擬合模型方程，最終得到復(fù)配抑菌劑的最佳配方組合。

表1 最優(yōu)混料設(shè)計組合及孵育菌落數(shù)實測值和預(yù)測值

采樣：采用平板暴露法，參考《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》（GB 15982—2012）執(zhí)行。2022 年5—6 月，采用平板暴露法在校內(nèi)飯?zhí)秒x地75cm 的桌面上收集落菌，每次采樣的采樣點不低于3 處。運行序列不重復(fù)的有11 組，按每處采樣點平行取樣不低于11 個，每個采樣點之間及與墻壁、立柱間隔4 米以上。在中午就餐高峰期過后，商鋪打烊期間采樣，單次采樣時長30min。

抑菌孵育：參考抑菌效果評價試驗進行孵育。將300μl 的運行序列配方揮發(fā)油滴加在滅菌濾紙上，并放置在培養(yǎng)皿內(nèi)底面，然后將之前的采樣平板倒扣其上，用封口膜封閉并標注記號。在37℃、濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)倒置孵育48 小時。孵育后，將平板置黑色背景上拍照并計數(shù)。

1.3 抑菌效能驗證

實驗室驗證：根據(jù)1.2 方法得出的揮發(fā)油復(fù)配比例與孵育菌落數(shù)擬合模型方程，優(yōu)選3 組配方比例。按1.2 試驗方法采樣、抑菌孵育、計數(shù)重復(fù)試驗，對3組配方進行抑菌效果驗證試驗，選取最優(yōu)配方。

現(xiàn)場驗證：選取2 間28m2宿舍，采樣前清空人員并密閉宿舍1h。對角離墻≥1m、離地75cm～80cm 三點采樣，采樣時長30min。以通用精油霧化器熏蒸最佳配方揮發(fā)油3mL/間，熏蒸完畢30min 后，按前述方法采樣。培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃、濕度95%的條件下孵育48h，三個采樣點合并計數(shù)。重復(fù)4 次。

1.4 統(tǒng)計分析

所有分析測試均采用多次平行處理，每項測試所得取均值計入。采用IBM SPSS Statistics 24.0 對試驗數(shù)據(jù)進行處理，同時分析前對各數(shù)據(jù)進行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗。計量資料符合正態(tài)分布，采用均值±標準差（x-±s）描述，樣本數(shù)據(jù)組間比較采用ANOVA 方差分析。計量資料不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)和四分位間距M（P25～P75）描述，樣本數(shù)據(jù)組間比較采用Kruskal Wallis H 和Mann-Whitney U 秩和檢驗。顯著性水平p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配抑菌劑優(yōu)選結(jié)果

試驗最終獲得樣品312 份，因16 組運行序列配方有重復(fù)，所以實際按11 組配方開展試驗，使用樣品286 份。由表1 看出，3 種揮發(fā)油單獨作為抑菌劑使用時，孵育菌落數(shù)在17.47～53.57 個之間；若組合使用，8 個組合孵育菌落數(shù)在6.10～37.23 個之間，這顯示出復(fù)配抑菌劑具有明顯的增效作用，見圖1。

圖1 11 組運行序列揮發(fā)油配方抑菌孵育菌落數(shù)的實測值

根據(jù)表1 所得的運行序列組合孵育菌落數(shù)實測值和Design-Expert 12.0 給出的預(yù)期值進行二次多項回歸擬合，得到孵育菌落數(shù)（Y）與各揮發(fā)油配方比例之間的擬合方程：Y=17.60A+53.01B+36.76C-1 0 6.1 1 A B-8 4.8 7 A C-6 3.9 3 B C+ 7 8 2.7 9 A2B C-1178.89AB2C+413.15ABC2，其中A、B、C 分別代表丁香揮發(fā)油、艾葉揮發(fā)油、香茅揮發(fā)油的比例。通過對模型進行方差分析（見表2），發(fā)現(xiàn)二項式模型達到極顯著水平（p＜0.01），判定系數(shù)R2=0.9893。校正后的判定系數(shù)，這表明模型方程很好地擬合了孵育菌落數(shù)與各揮發(fā)油在復(fù)配抑菌劑最終配方中的比例關(guān)系。從各因素的交互作用差異性分析可看出，僅AB、AC、BC 和AB2C 的交互作用對孵育菌落數(shù)量有顯著影響（p＜0.05，下同），其中AB、AC 的交互作用有非常顯著的影響（p＜0.01），其原因可能是丁香與艾葉、香茅揮發(fā)油結(jié)合對落菌的抑制存在強烈的互補增效作用。

表2 回歸方程的方差與顯著性差異

使用Design-Expert 12.0 的最優(yōu)化功能，從隨機組合開始進行最陡爬坡預(yù)測。從軟件給出的最低孵育菌落數(shù)預(yù)測組合中優(yōu)選三組組合，并提供預(yù)測值（見表3），這些值均落在擬合3D 曲面的最佳配方區(qū)域（見圖2）。由表3 可看出，要想使孵育菌落數(shù)達到最小預(yù)測結(jié)果（5 個），復(fù)配抑菌劑中丁香、艾葉、香茅3 種揮發(fā)油的最佳比例分別為31.00%、51.20%、17.80%。

表3 最佳配方組合的抑菌孵育菌落數(shù)預(yù)測結(jié)果和實測結(jié)果

圖2 三種揮發(fā)油配方與孵育菌落數(shù)擬合的3D 曲面

2.2 優(yōu)選配方驗證

通過實驗室驗證，實測三組配方孵育菌落數(shù)在0～18 個之間，均值見表3。對三組配方進行兩兩相互比較，序列72 的實測菌落數(shù)與序列76、69 存在顯著性差異（p＜0.05），序列76、69 之間差異不顯著（p＞0.05），見表4。最終選擇爬坡序列69 配方，即以丁香、艾葉、香茅揮發(fā)油比例為45.2：41.6：13.2 制備空氣抑菌劑。

表4 爬坡序列3 組配方抑菌孵育菌落數(shù)兩兩比較結(jié)果

選擇宿舍進行現(xiàn)場實驗驗證，結(jié)果顯示，空氣抑菌劑熏蒸能顯著減少空氣浮游菌（見表5）。

表5 最佳配方空氣抑菌劑的現(xiàn)場實驗抑菌結(jié)果

3 結(jié)論

古代空氣抑菌技術(shù)多采用燃燒艾葉、蒼術(shù)的方法熏蒸空氣，然而燃燒產(chǎn)生的煙霧往往比較嗆鼻，而且蒼術(shù)的價格較高不利于開發(fā)使用。我們通過實驗驗證了中藥抑菌揮發(fā)油復(fù)配后具有明顯的增效作用，可以采用價格相對比較低廉易得的中藥材，通過復(fù)配的方式達到抑菌效能顯著增強的效果。丁香便是其中一種熱門備選中藥，其揮發(fā)油能對多種致病菌起到較強的殺滅作用，這與其所含的酚酸類化合物成分有密切關(guān)系［22，23］。本實驗也證實了丁香對艾葉和香茅揮發(fā)油的抑菌效能有互補增強的作用。

在現(xiàn)實生活中，空氣浮游菌是由多種致病菌和非致病菌構(gòu)成的，其中致病菌主要分為細菌和真菌兩大類。為了更接近生活應(yīng)用場景，若采用標準菌株實驗法需要眾多菌種樣本，且在抑菌試驗完成后還需要評估每種菌種對抑菌劑效益價值權(quán)重，才能最終確定抑菌配方，操作比較復(fù)雜。因此，本研究采用現(xiàn)場實驗法開展實驗，其優(yōu)點是能直接評估總體抑菌效能。但現(xiàn)場實驗容易引入許多干擾因素，因此需要增加重復(fù)實驗數(shù)量以減少偶然誤差。同時，現(xiàn)場實驗的場所有其相對固定的菌群譜，未來需要增加更多現(xiàn)場實驗的場所重復(fù)驗證最佳抑菌配方。此外，由于疫情的影響，宿舍的現(xiàn)場實驗難以順利開展，導(dǎo)致重復(fù)實驗次數(shù)不足。

本研究未來將會與高校微生物科研機構(gòu)合作，將抑菌孵育后仍然存活的少量菌種送檢和鑒定。若是致病菌種，將結(jié)合數(shù)種常見的致病空氣浮游菌進行配方驗證，適當調(diào)整配方比例或者劑量，以開發(fā)出更有針對性的中藥空氣抑菌劑，拓寬產(chǎn)品的抑菌譜。

綜上所述，隨著我國居民衛(wèi)生健康意識的提高，室內(nèi)空氣抑菌消毒用品需求量激增，消費者已不再滿足單純的化學(xué)類消毒產(chǎn)品。中藥空氣抑菌劑作為一種新型的天然抗菌劑，市場需求將會越來越大。本研究的產(chǎn)品抑菌效果明顯，氣味芳香，易于被人們接受，具有廣泛的應(yīng)用前景和推廣價值。