王世艷 趙睿楨 張建勇 趙建軍

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 遵義 563000)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的一種慢性傳染病〔1〕。在2020年,有987萬(wàn)新診斷的結(jié)核病患者,受到新型冠狀病毒(COVID-19)大流行影響,全球新診斷及報(bào)告的結(jié)核病患者數(shù)量有所下降〔2〕,且該年度在人類免疫缺陷病毒(HIV)陰性人群中有130萬(wàn)人死于該病〔3〕,是單一病原體感染疾病造成死亡的主要原因。結(jié)核病以肺結(jié)核最常見(jiàn),主要經(jīng)呼吸道傳播。中國(guó)是全球結(jié)核病衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)的高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,結(jié)核患者數(shù)量居于世界第二位〔4〕。近些年來(lái),由于獲得性免疫缺陷綜合征和糖尿病發(fā)病率的增高,多種耐藥肺結(jié)核患者的增多,導(dǎo)致全球結(jié)核病形勢(shì)嚴(yán)峻〔5,6〕,且隨著結(jié)核病患者逐年增多,非結(jié)核分枝桿菌(NTM)肺病病例報(bào)道亦逐步增加。目前,現(xiàn)常用的痰涂片抗酸染色陽(yáng)性率低,其中約70%為菌陰肺結(jié)核(3次痰涂片均陰性且痰培養(yǎng)陰性)且無(wú)法鑒別結(jié)核桿菌、非結(jié)核桿菌及奴卡氏菌等;利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(GeneXpert MTB/RIF)檢測(cè)、MTB環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(TB-LAMP)敏感性較高但也無(wú)法鑒別結(jié)核桿菌、非結(jié)核桿菌及奴卡菌等;羅氏培養(yǎng)法是金指標(biāo),但存在耗時(shí)長(zhǎng),靈敏度低等缺點(diǎn),故肺結(jié)核的診斷困難,漏診、誤診等情況容易在臨床上出現(xiàn),更使得結(jié)核病的控制成為難題,造成很大的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔7～10〕。因此,如何提高菌陰肺結(jié)核患者的陽(yáng)性診斷率,減少NTM誤診,是臨床亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái),MTB/NTM檢測(cè)在結(jié)核病的診斷方面取得了良好效果,使得MTB/NTM檢測(cè)成為目前結(jié)核分子生物學(xué)檢測(cè)的檢測(cè)方法之一,在臨床上得到廣泛應(yīng)用。本研究取菌陰肺結(jié)核患者肺泡灌洗液(BALF)作為標(biāo)本,分別進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF、MTB/NTM及TB-LAMP檢測(cè),評(píng)估MTB/NTM檢測(cè)的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 收集遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2017年12月至2021年11月臨床診斷為菌陰肺結(jié)核(3次痰涂片陰性、1次痰結(jié)核菌培養(yǎng)陰性)的患者324例,其中男181例,女143例,平均年齡(54.22±18.33)歲。菌陰肺結(jié)核的診斷參照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南(2008版)》〔11〕涂陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)及我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肺結(jié)核診斷》WS288-2017〔12〕。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡14～96歲;(2)患者3次痰找抗酸桿菌(即時(shí)痰、夜間痰、晨痰)均為陰性且1次痰培養(yǎng)陰性。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患者痰抗酸桿菌涂片陽(yáng)性;(2)有心肺功能嚴(yán)重下降、血小板、凝血功能障礙,難以耐受支氣管鏡檢查及支氣管鏡手術(shù)有禁忌證;(3)不愿接受支氣管鏡檢查患者。對(duì)納入患者進(jìn)行支氣管鏡檢查并收集BALF。57例納入MTB/NTM組,其中男34例,女23例,平均年齡(52.02±17.81)歲。161例納入GeneXpert MTB/RIF組,男90例,女71例,平均年齡(54.61±19.03)歲。106例納入TB-LAMP組,男57例,女49例,平均年齡(54.81±17.57)歲。3組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)所有患者進(jìn)行涂片抗酸染色和羅氏培養(yǎng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 MTB/NTM核酸檢測(cè)試劑及儀器由中國(guó)北京博奧生物提供,GeneXpert MTB/RIF試劑盒、樣品試劑由美國(guó)Cepheid公司提供,TB-LAMP檢測(cè)試劑盒、恒溫?cái)U(kuò)增儀由榮研生物科技有限公司提供,抗酸染色試劑由中國(guó)珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供,羅氏培養(yǎng)基按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》〔13〕進(jìn)行制備。

1.3涂片抗酸染色 取BALF于玻片正面涂片,自然干燥后滴加苯酚復(fù)紅染液染色5 min后以流水自玻片一端緩慢沖洗染液,待瀝干后滴加脫色液,脫色1～2 min至無(wú)可視染色,最后滴加亞甲藍(lán)溶液染色30～60 s,流水緩慢沖洗,瀝干后鏡檢。

1.4羅氏培養(yǎng) 將BALF標(biāo)本加入4%NaOH溶液(兩者等體積),充分混勻后靜置10 min,吸取沉淀液1 ml均勻接種到羅氏培養(yǎng)基斜面上,37 ℃培養(yǎng)箱孵育,觀察培養(yǎng)結(jié)果。若8 w后未見(jiàn)MTB生長(zhǎng)即認(rèn)定結(jié)果為陰性;若酸性羅氏斜面培養(yǎng)基上見(jiàn)菌落生長(zhǎng),則需進(jìn)一步行抗酸染色檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí),再采用對(duì)硝基苯甲酸鑒定菌落為NTM還是MTB,并且進(jìn)一步行菌群鑒定。

1.5MTB/NTM檢測(cè) 取BALF樣本提取核酸、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、結(jié)果判定。對(duì)于MTB,其標(biāo)本擴(kuò)增曲線呈S形,且Ct值<36,判定其結(jié)果為陽(yáng)性;對(duì)于NTM,其標(biāo)本擴(kuò)增曲線呈S形,且Ct值<40,判其結(jié)果定為陽(yáng)性。在MTB、NTM均為陽(yáng)性時(shí),判定為MTB陽(yáng)性,MTB、NTM均為陰性時(shí),則表示無(wú)MTB檢出。

1.6GeneXpert MTB/RIF檢測(cè) 取BALF樣本離心15 min(3 000 r/min),取其沉淀液,按GeneXpert MTB/RIF操作說(shuō)明進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測(cè),2 h后直接在檢測(cè)系統(tǒng)觀察結(jié)果。GeneXpert MTB/RIF同時(shí)檢測(cè)MTB對(duì)利福平的耐藥性。由A、B、C、D、E,5條分子探針針對(duì)MTB rpoB基因81 bp的利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)序列,可檢測(cè)rpoB基因是否突變,判斷對(duì)RIF耐藥性。

1.7TB-LAMP檢測(cè) 取BALF樣本離心15 min(3 000 r/min),取其沉淀液,按照LAMP試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行TB-LAMP檢測(cè),40 min后由檢測(cè)儀器判定結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行McNemar檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

MTB/NTM檢測(cè)陽(yáng)性率〔43.86%(25/57)〕與羅氏培養(yǎng)〔14.04%(8/57)〕、涂片抗酸染色陽(yáng)性率〔1.75%(1/57)〕比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率〔54.66%(88/161)〕與羅氏培養(yǎng)〔16.77%(27/161)〕、涂片抗酸染色〔3.73%(6/161)〕陽(yáng)性率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。TB-LAMP檢測(cè)陽(yáng)性率〔49.06%(52/106)〕與羅氏培養(yǎng)〔18.87%(20/106)〕、涂片抗酸染色〔4.72%(5/106)〕陽(yáng)性率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。3種方法陽(yáng)性率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.185,P=0.335)。

3 討 論

我國(guó)每年新發(fā)的結(jié)核病例約有90萬(wàn)例〔14〕。MTB是引起結(jié)核病的主要病菌,是單一病原體感染疾病造成死亡的主要原因,所以對(duì)其進(jìn)行快速檢測(cè)及鑒別診斷是防控結(jié)核疫情傳播和擴(kuò)散的關(guān)鍵。為了盡快發(fā)現(xiàn)和診斷肺結(jié)核,提高陽(yáng)性診斷率,對(duì)MTB檢測(cè)方法的積極探索越來(lái)越多〔15～18〕。臨床上,痰液作為診斷肺部疾病的首選樣本,常被用于結(jié)核病的診斷〔19〕,但對(duì)肺結(jié)核兒童,尤其是年齡<5歲的兒童,存在標(biāo)本采集困難〔20〕,少痰患者亦然。應(yīng)用痰作為標(biāo)本進(jìn)行涂片抗酸染色陽(yáng)性率低〔21〕,羅氏培養(yǎng)時(shí)效低,容易造成延誤及漏診〔22〕,同時(shí)部分患者為NTM感染,臨床癥狀、影像學(xué)及抗酸桿菌涂片無(wú)法鑒別,可能導(dǎo)致誤診,延誤病情及增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。故找到一種能夠提高檢測(cè)陽(yáng)性率且能夠區(qū)分MTB與NTM的檢測(cè)方法成為結(jié)核病診療臨床策略急需解決的問(wèn)題之一。一方面,臨床上通過(guò)對(duì)菌陰肺結(jié)核采取支氣管BALF樣本離心檢測(cè)提高陽(yáng)性率;另一方面,對(duì)BALF樣本通過(guò)MTB/NTM檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)提高檢測(cè)陽(yáng)性率且能夠區(qū)分MTB與NTM,該方法采用 PCR-熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行核酸檢測(cè),采用 DNA 微陣列芯片法對(duì) NTM 陽(yáng)性的樣本進(jìn)行菌種鑒定,具有簡(jiǎn)便、快捷的特點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的其他針對(duì)結(jié)核菌核酸檢測(cè)方法GeneXpert MTB/RIF,能夠快速檢測(cè)MTB,判斷是否對(duì)RIF耐藥。LAMP是日本學(xué)者Notom開(kāi)發(fā)的一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)的核心是針對(duì)靶基因6個(gè)特定區(qū)域(F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3)設(shè)計(jì)4個(gè)特異性引物(兩個(gè)外部引物F3、B3,兩個(gè)內(nèi)部引物FIP、BIP),利用鏈置換型DNA聚合酶在等溫條件下進(jìn)行基因擴(kuò)增〔23〕。本研究結(jié)果顯示,MTB/NTM檢測(cè)具有較好診斷效能,對(duì)檢測(cè)人員專業(yè)技術(shù)要求相對(duì)較低,較為簡(jiǎn)單、快捷,并能鑒別NTM,及時(shí)減少NTM患者使用結(jié)核藥物引起的身體損害及經(jīng)濟(jì)損失。GeneXpert MTB/RIF、TB-LAMP檢出陽(yáng)性率亦較高,但其費(fèi)用偏高,加重了衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究中僅采用BALF作為標(biāo)本對(duì)各種檢測(cè)方法進(jìn)行比較,結(jié)合目前臨床需要,可進(jìn)一步探討多種樣本如胸水、尿液等在各檢查方法中的陽(yáng)性率,向臨床提供更加完整、優(yōu)化的診斷策略。