曾錦威 黃浩 何元平

創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎是一種發(fā)生于韌帶損傷、半月板損傷或骨折后的骨關(guān)節(jié)炎[1]。關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、運動性損傷、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨損傷[2]。至今，人們對軟骨損傷后的自然演變過程和創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制的了解還不夠深入。研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎的進展與損傷軟骨細胞外基質(zhì)的酶降解引發(fā)的炎癥有關(guān)[3]。隨著軟骨下骨在關(guān)節(jié)疾病中的作用越來越受到專家學者的關(guān)注，針對軟骨下骨細胞外基質(zhì)降解的藥物越來越多地被應用于創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)病的治療。降鈣素是一種有效的破骨細胞骨吸收抑制劑，已廣泛應用于骨質(zhì)疏松癥的治療[4]。柏明曉[5]研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素能促進軟骨分泌糖氨多糖和Ⅱ型膠原（typeⅡ collagen，Col Ⅱ），或抑制這2 種物質(zhì)的分解，并與基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）等蛋白的表達水平的增加關(guān)系密切。在本研究中，以人軟骨細胞為研究對象，通過白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導建立軟骨細胞損傷模型，探討降鈣素對軟骨細胞損傷的保護作用，并進一步研究其可能的分子機制。此文的研究結(jié)果為創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎后期標準制定提供了借鑒內(nèi)容，以期為創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的深入研究及臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2022年7月21日—11月10日于廣東醫(yī)瑞貝生物醫(yī)學科技有限公司進行實驗。試驗材料及來源：人軟骨細胞（Cell Applications 公司，美國），胎牛血清、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，中國），青霉素-鏈霉素、PBS 緩沖液（Hyclone 公司，美國），IL-1β（北京索萊寶科技有限公司，中國），降鈣素[華中海威（北京）基因科技有限公司，中國]，F(xiàn)ITC anti-human CD36 抗體（BioLegend公司， 美國），CCK-8 試劑盒（cell counting kit CCK 8，CCK-8）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物科技有限公司，中國），SYBR Green qPCR SuperMix 試劑盒（Invitrogen 公司，美國），NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor heat protein domain associated protein 3，NLRP3）一抗（CST 公司，美國），消皮素D（gasdermin-D，GSDMD）一抗、GSDMD-N 一抗（Abcam 公司，美國），蛋白酶抑制劑（Sigma 公司，美國），磷酸酶抑制劑、BCA 法蛋白含量檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國），熒光二抗（Southern biotech，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將人軟骨細胞用含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，選取第3 代細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 篩選降鈣素最佳濃度

將對數(shù)生長期的人軟骨細胞以1×105個/cm2的密度接種于不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中饑餓處理24 h，再將人軟骨細胞與濃度為10 ng/mL IL-1β 共同孵育30 min 建立創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎細胞模型。用0.1、0.5、1、5、10、50 nM 5 個濃度的降鈣素處理細胞24 h。通過CCK-8 檢測與乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性測定篩選出降鈣素最佳作用濃度進行后續(xù)實驗，其他不使用降鈣素進行治療的細胞加入等量生理鹽水作為對照。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖活性

將細胞以1×104個/孔的密度接種于96 孔板，室溫下培養(yǎng)過夜。3 組細胞分別經(jīng)過處理培養(yǎng)0、24、48 和72 h 時，將細胞懸浮于90 μL培養(yǎng)基中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，處理繼續(xù)培養(yǎng)4 h，通過酶聯(lián)免疫檢測儀記錄450 nM 光密度下的讀數(shù)評估細胞增殖能力。

1.2.4 細胞處理

按照處理方式的不同將細胞分為3 組，其中，對照組：人軟骨細胞用含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。疾病組：人軟骨細胞用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基饑餓處理24 h，再與10 ng/mL 濃度的IL-1β 共同孵育30 min。治療組：人軟骨細胞用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基饑餓處理24 h，再與10 ng/mL 濃度的IL-1β 共同孵育30 min，然后用篩選出的最佳作用濃度的降鈣素處理24 h。

1.2.5 流式細胞術(shù)分析各組CD36 和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）表達

將各組細胞用胰蛋白酶消化并重懸細胞，經(jīng)PBS 充分洗滌細胞2 次后，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×107/mL，每管加入100 μL 細胞，再向管中加入5 μL 抗體，室溫，避光，反應30 min，用PBS 洗滌2 次，通過流式細胞儀觀察熒光強度，分析CD36 和ROS 的表達情況。

1.2.6 酶標法檢測各組細胞SOD 和MDA 水平

離心后收集細胞，用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解細胞，收集上清液。根據(jù)制造商的說明分別采用硫代巴比妥酸法和羥胺法檢測各組細胞MDA 和SOD 的含量。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測mRNA 的相對表達量

使用總RNA 提取試劑盒，按說明書要求提取總RNA，再使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，通過SYBR Green 實時PCR 對樣品進行擴增。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算降鈣素、白介素-17（interleukin17，IL-17）、MMP13、Col Ⅱ的相對表達量。

1.2.8 蛋白印跡法（Western blot）檢測蛋白的相對表達量

收集各組細胞，提取細胞內(nèi)總蛋白并用蛋白定量試劑盒測定濃度。蛋白通過PAGE 聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDSPAGE）電泳分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加1 ∶1 000 稀釋的NLRP3、GSDMD、GSDMD-N 和GAPDH 一抗。4 ℃過夜后，用含有辣根的過氧化物酶偶聯(lián)二抗室溫孵育2 h，將化學熒光發(fā)光底物加到膜的表面，對蛋白條帶進行灰度掃描、定量，蛋白表達水平根據(jù)GAPDH 進行標化。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗，3 組比較使用F檢驗；基因間相關(guān)性研究采用Pearson 分析。檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 法篩選降鈣素最佳作用濃度結(jié)果

采用0.1、0.5、1、5、10、50 nM 5 個濃度的降鈣素分別處理人軟骨細胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著降鈣素濃度的增加，人軟骨細胞的活力逐漸升高，這種變化具有濃度依賴性，因此選擇50 nM 濃度的降鈣素作為治療組進行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 不同濃度降鈣素對人軟骨細胞增殖活性和細胞毒性的影響。

2.2 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞軟骨退化相關(guān)因子的影響

與對照組比較，疾病組人軟骨細胞肥大標志物MMP13的mRNA 相對表達量升高，而軟骨形成標志物Col Ⅱ的mRNA 相對表達量降低（P＜0.05）。但在降鈣素治療后人軟骨細胞軟骨退化得到了緩解，與疾病組比較，治療組人軟骨細胞MMP13 的mRNA 表達降低，同時Col Ⅱ的mRNA表達升高（P＜0.05）。見表1。

表1 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞中MMP13、Col Ⅱ含量的影響（±s）

表1 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞中MMP13、Col Ⅱ含量的影響（±s）

注：與對照組比較，①P ＜0.05；疾病組MMP13 的mRNA 相對表達量、Col Ⅱ的mRNA 相對表達量與對照組比較，t ＝10.312、8.380，P ＝0.002、0.001。與疾病組比較，②P ＜0.05；治療組MMP13 的mRNA 相對表達量、Col Ⅱ的mRNA 相對表達量與疾病組比較，t ＝18.730、7.878，P ＜0.001、P ＝0.001。

組別MMP13 mRNA（相對表達量）Col Ⅱ mRNA（相對表達量）對照組（n ＝8）1.00±0.091.00±0.09疾病組（n ＝8）2.23±0.19①0.47±0.06①治療組（n ＝8）0.19±0.03②1.83±0.16②F 值216.800113.700 P 值＜0.001＜0.001

2.3 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞氧化應激水平的影響

與對照組比較，IL-1β 處理使人軟骨細胞中的ROS 的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）及MDA含量增加，同時伴隨SOD 活力的下降（P＜0.05）。然而，與疾病組比較，降鈣素處理細胞后，ROS 的MFI 及MDA含量下降，且SOD 活力增強（P＜0.05）。見表2。

表2 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞中ROS、MDA、SOD 含量的影響（±s）

表2 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞中ROS、MDA、SOD 含量的影響（±s）

注：與對照組比較，①P ＜0.05；疾病組ROS（MFI）、MDA、SOD 與對照組比較，t ＝46.970、8.049、6.460，P ＜0.001、P ＝0.001、P ＝0.003。與疾病組比較，②P ＜0.05；治療組ROS（MFI）、MDA、SOD 與疾病組比較，t ＝33.623、6.369、4.670，P＜0.001、P ＝0.003、P ＝0.010。

組別ROS（MFI）MDA（nmol/mL）SOD（U/mL）對照組（n ＝8）1 192.21±15.105.85±0.56242.33±21.17疾病組（n ＝8）2 026.45±26.80①13.93±1.64①151.14±12.26①治療組（n ＝8）1 404.34±17.58②7.14±0.83②214.23±19.93②F 值1 348.00045.62019.710 P 值＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞炎癥反應標志物的影響

與對照組比較，疾病組人軟骨細胞中炎癥反應標志物NLRP3 和GSDMD 的蛋白表達水平上升，而GSDMD-N 蛋白表達水平下降（P＜0.05）。然而，降鈣素治療后，人軟骨細胞中NLRP3 和GSDMD 的蛋白表達受到抑制，而GSDMD-N 的蛋白表達則上升（P＜0.05）。見圖2。

圖2 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞炎癥反應標志物的影響。A：Western blot檢測降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞炎癥反應標志物蛋白的影響；B：降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞炎癥反應標志物蛋白影響的量化；與對照組比較，①P ＜0.05；與疾病組比較，②P ＜0.05。

2.5 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞CD36 與IL-17 表達的影響

與對照組比較，疾病組的CD36 陽性率降低；同時，IL-17 的mRNA 相對表達量升高（P＜0.05）。但是，降鈣素治療后可緩解這些改變，與疾病組比較，治療組細胞中CD36 陽性率升高，而IL-17 的mRNA 相對表達量受到抑制（P＜0.05）。見表3。

表3 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞CD36 與IL-17 表達的影響（n ＝8， ±s）

表3 降鈣素對IL-1β 誘導的人軟骨細胞CD36 與IL-17 表達的影響（n ＝8， ±s）

注：與對照組比較，①P ＜0.001；疾病組CD36 陽性率、IL-17 的mRNA 相對表達量與對照組比較，t ＝13.974、10.700，P ＜0.001。與疾病組比較，②P ＜0.001；治療組CD36 陽性率、IL-17 的mRNA 相對表達量與疾病組比較，t ＝13.512、16.610，P ＜0.001。

組別CD36 陽性率（%）IL-17 mRNA（相對表達量）對照組1.50±0.161.00±0.11疾病組0.17±0.02①2.58±0.24①治療組11.20±1.23②0.34±0.03②F 值210.900180.300 P 值＜0.001＜0.001

2.6 降鈣素與CD36、IL-17 表達的相關(guān)性

通過Pearson 分析降鈣素與CD36、IL-17 之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，降鈣素與CD36 呈正相關(guān)（r＝0.922，P＝0.001），與IL-17 呈負相關(guān)（r＝-0.881，P＝0.002）。另外，同樣通過Pearson 分析探討CD36 與IL-17 的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者的表達水平呈負相關(guān)（r＝-0.650，P＝0.023）。

3 討論

透明軟骨、纖維軟骨和彈性軟骨在人體中發(fā)揮多種作用，包括在關(guān)節(jié)和椎間盤中承受載荷，提供關(guān)節(jié)潤滑，形成外耳和鼻子，支撐氣管，并在發(fā)育和生長過程中形成長骨[6]。因為軟骨的摩擦力比較小，很容易在運動中因為破裂而受傷。作為骨關(guān)節(jié)炎的常見類型之一，創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的主要特征就是軟骨損傷，而軟骨組織自我修復能力較差，一旦損傷很難自然愈合[1-2]。軟骨和關(guān)節(jié)損傷容易使軟骨退化，轉(zhuǎn)變?yōu)楣顷P(guān)節(jié)炎，嚴重影響人類的生活和工作，目前尚無治愈方法[7]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨和關(guān)節(jié)損傷時伴隨多個微環(huán)境的變化，包括炎癥、骨重塑、血管、神經(jīng)的出現(xiàn)以及細胞外和細胞周圍基質(zhì)、氧張力、生物力學、關(guān)節(jié)軟骨組織下、pH 值的改變[8]。

目前臨床對于創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的治療多以鎮(zhèn)靜、止痛、抗感染等藥物治療為主，然而這些方法只能短期改善關(guān)節(jié)功能，停藥后易復發(fā)，且后期可能會導致軟骨退化[7，9]。降鈣素是由甲狀腺濾泡旁細胞分泌的激素，其能夠通過降低血鈣水平，抑制破骨細胞介導的骨吸收，從而降低骨折的發(fā)生率，刺激成骨細胞的形成并增加其活性[10]。細胞外基質(zhì)是由軟骨細胞合成分泌并起著保護軟骨細胞的屏障作用。王康等[11]研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)合成和失衡是引起創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)病的重要原因之一。作為細胞外基質(zhì)的兩大主要成分之一，ColⅡ是關(guān)節(jié)軟骨中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其在維持軟骨的生物力學功能方面具有重要的作用[12]。MMP13 是一種依賴于Zn2+的蛋白酶，催化Col Ⅱ的裂解，過多的MMP13活性導致骨關(guān)節(jié)炎的軟骨退化，使這種蛋白酶成為一個有吸引力的治療靶點[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素治療后IL-1β 誘導的軟骨細胞的增殖能力升高，MMP13 的mRNA 表達降低，同時Col Ⅱ的mRNA 表達升高。這些結(jié)果證實降鈣素有助于創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞活力恢復，抑制軟骨細胞退化。

ROS 已被確定為炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，控制氧化應激和抗氧化酶活性，從而促進炎癥活性的增加[15]。當ROS 的產(chǎn)生速度快于關(guān)節(jié)軟骨清除活性氧的速度時，關(guān)節(jié)軟骨就會受到氧化應激的影響。在創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的背景下，軟骨中氧化應激水平高，導致慢性炎癥，這反過來又可以驅(qū)動滑膜炎癥、關(guān)節(jié)內(nèi)病變形成、軟骨細胞合成代謝處理和軟骨變性[16]。CD36 其廣泛存在于多種組織細胞中，在多個生理過程中參與細胞的清除。同時，CD36 被多種炎癥因子抑制其表達，目前已成為間接研究炎癥反應的熱點[17-18]。IL-17 是T 細胞誘導的炎癥反應的早期啟動因子，可以通過促進釋放前炎癥細胞因子來放大炎癥反應。馮方等[19]研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中IL-17 的水平高于健康患者，且IL-17 的水平與膝關(guān)節(jié)VAS 評分呈正相關(guān)（r＝0.914，P＜0.01），即IL-17 可反映膝骨關(guān)節(jié)炎患者疼痛程度及功能損傷程度，臨床通過減少關(guān)節(jié)滑液中IL-17，可能會減輕膝骨關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀。本研究通過檢測軟骨細胞氧化應激相關(guān)因子及炎癥反應標志物的變化來探討降鈣素的作用機制。實驗發(fā)現(xiàn)，人軟骨細胞經(jīng)IL-1β 損傷后CD36 陽性率、SOD 活力及GSDMD-N 蛋白表達降低，同時MMP13 和IL-17 的mRNA 相對表達量、NLRP3 和GSDMD 的蛋白表達水平、ROS 的MFI 及MDA 的含量升高。然而，降鈣素治療能夠逆轉(zhuǎn)上述指標的變化。所有結(jié)果表明降鈣素對軟骨細胞的保護機制可能與抑制IL-17 的表達，增強CD36 的表達及緩解軟骨細胞的應激炎癥反應有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果闡明降鈣素對IL-1β 誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用，其有助于創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞活力恢復，抑制軟骨細胞退化，緩解軟骨細胞的應激炎癥反應，其機制與抑制IL-17 的表達，增強CD36 的表達有關(guān)。該研究為軟骨損傷的深入研究及降鈣素治療軟骨損傷的臨床應用提供參考。