李 雪,孫婷婷,魏彤竹,王曉丹, 刁文麗

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica,YE)是一種人獸共患致病菌,在自然界中廣泛存在,主要傳播途徑是糞口傳播。YE宿主除人以外,還有豬、牛、雞、狗、羊、鼠等。人感染YE后,除可引起胃腸道癥狀外,還可引起腸外疾病如突眼性甲狀腺腫、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑等。由于YE具有嗜冷性,可在4 ℃冷藏條件下繼續(xù)生長和繁殖,對冷鏈條件下儲運食品的安全性提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。

YE具有較多的生物型、血清型和基因型,各種型別與其致病力密切相關(guān),且分布特征呈現(xiàn)地區(qū)性[2]。如生物型1A菌株通常被認(rèn)為無致病性,但近年來卻發(fā)現(xiàn)少數(shù)1A型菌株也攜帶有毒力基因ail,從而具有致病性,因此開展YE表型和分子特征研究,對我國食源性YE的進化機制、傳播途徑和致病性認(rèn)識有重要作用[3]。

脈沖場凝膠電泳方法(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)已經(jīng)是非常成熟的標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)方法,已實現(xiàn)數(shù)據(jù)分析的網(wǎng)絡(luò)化,曾是大部分致病菌暴發(fā)流行時分型溯源的金標(biāo)準(zhǔn),可很好的用于YE的溯源研究。而多位點序列分型方法(MultiLocus Sequence Typing,MLST)同樣具有較高的分離力,可以通過全球比對數(shù)據(jù)庫得到更多的關(guān)于進化和親緣關(guān)系的分析資料,適合長期大范圍的流行病學(xué)調(diào)查,所得實驗結(jié)果因可提供更細致的序列信息,從而展示菌株的進化過程,且容易在不同實驗室間做對比分析,甚至在某些情況下比PFGE更具鑒別力,因此MLST方法在親緣關(guān)系、流行病學(xué)和致病研究等方面占有較高優(yōu)勢[2]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 按照《遼寧省食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌研究工作方案》[4](以下簡稱方案)要求,2020-2023年6-9月份,在遼寧省農(nóng)貿(mào)市場共采集樣品2 748份(996份生豬肉、876份生牛肉和876份生雞肉)。2020-2022年480樣品來源全部為遼寧省沈陽市農(nóng)貿(mào)市場,而2023年2 268樣品來源為遼寧省內(nèi)14個市農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 菌種來源 從1.1樣品中分離鑒定的YE分離株60株,其中2020-2022年分離株20株,2023年分離株40株。標(biāo)準(zhǔn)菌株:CMCC(B)52204來自于遼寧省疾控中心。PFGE實驗分子量標(biāo)準(zhǔn)菌株SalmonellaBraenderupH9812來自于國家食品安全風(fēng)險評估中心。

1.3 主要儀器與試劑 脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)(美國伯樂CHEFMAPPER-XA)、凝膠成像系統(tǒng)(伯樂GelDocXR+)、培養(yǎng)箱(海河HHB11-22)、PCR儀(伯樂S1000)、全自動微生物生化鑒定儀和比濁儀(法國梅里埃VITEK2)。儀器均通過計量檢定或校準(zhǔn)。

改良磷酸鹽緩沖液(北京陸橋批號211009)、CIN-1平板(北京陸橋批號210827)、YE血清(日本生研批號200280)、GelRed熒光核酸凝膠染色試劑(Bio-Rad批號18G1231)、TBE緩沖液(Promega批號20190425)、DNA提取試劑盒(ABT批號T202211100)、YE生物分型生化試劑(北京陸橋20190731)、API20E生化試劑條(法國梅里埃批號1009659610)。毒力基因PCR擴增引物和MLST管家基因PCR擴增引物按照《方案》合成。

1.4 方法

1.4.1 增菌、分離和鑒定 按照《方案》要求對2 748份樣品進行冷增菌。取25 g生肉樣品,置入225 mL改良磷酸鹽緩沖液中增菌培養(yǎng),所有樣品增菌液于4 ℃中冷增菌20 d。使用普通PCR方法對冷增菌后的樣品進行YE初篩。首先使用DNA提取試劑盒提取樣品中菌株基因組DNA,對樣品中基因組DNA進行YE種foxA特征基因擴增,根據(jù)擴增結(jié)果對樣品中YE的污染情況進行初步判斷。根據(jù)增菌液PCR初篩結(jié)果,將YE檢測陽性的增菌液充分混勻后,三區(qū)劃線接種于CIN-1平板,26 ℃培養(yǎng)48 h,選取典型YE菌落進行純培養(yǎng)。采用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)VITEK2和API20E試劑進行生化鑒定。

1.4.2 血清和生物分型 按照《GB4789.8-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗》[5]中玻片凝集法對YE分離株進行血清和生物分型。根據(jù)生化反應(yīng)不同,可將其分為生物1A、1B、2、3、4、5共6個生物型。

1.4.3 毒力基因檢測 按照《方案》對YE分離株進行ail、ystA、ystB、yadA、virF、foxA、rfbC基因檢測。PCR擴增參數(shù):94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;57 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s;30個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。根據(jù)foxA基因PCR初篩結(jié)果,可對樣品中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌或假結(jié)核耶爾森菌的污染情況進行初步判斷。

1.4.4 PFGE分子分型和聚類分析 按照小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗PFGE操作標(biāo)準(zhǔn)進行分型研究。應(yīng)用BioNumerics 7.6軟件對PFGE圖譜進行聚類分析。

1.4.5 MLST分子分型和聚類分析 根據(jù)https://pubmlst.org/公布的MLST分型方法,目的基因選擇7個管家基因(adk、argA、aroA、glnA、thrA、tmk、trpE)進行分析比對。對YE分離株進行管家基因PCR擴增,DNA純化產(chǎn)物由沈陽鑫脈生物公司進行測序。將測序結(jié)果提交網(wǎng)站https://pubmlst.org/數(shù)據(jù)庫,比對測序基因的等位基因號得到測序株的ST型,按順序連接測序株的等位基因序列,應(yīng)用SPSS13.0軟件,UPGMA聚類法對分離株進行聚類分析[11]。并將ST型字符型數(shù)據(jù)導(dǎo)入BN軟件,應(yīng)用goeBURST distance聚類分析生成最小生成樹圖。

1.4.6 分型方法 分辨力的計算最終使用Hunter和Gaston的方法計算出各種分型方法的區(qū)分能力即分辨力(DI)[6]。

上述公式中,DI是分辨力,s是型別數(shù),nj是j型菌株數(shù),N是菌株總數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 樣品初篩結(jié)果 2 748份樣品增菌液通過對YE的foxA特征基因擴增,初篩得到60份陽性樣品,總檢出率為2.2%。每份陽性樣本中分離到1株YE,共得到60株YE。具體情況見表1。2023年遼寧省11個市均有檢出,陽性樣本檢出率較高的地區(qū)為:沈陽市檢出率3.44%(26/756),鐵嶺市檢出率1.85%(2/108),丹東市檢出率1.85%(2/108),大連市檢出率為1.38%(2/108)。

表1 YE分離株不同來源陽性樣品分離情況

2.2 血清型、生物型及毒力基因型結(jié)果 60株YE鑒定為4個血清型、2個生物型、8個毒力基因型。14株血清型為O∶3的YE分離株全部攜帶rfbC基因。根據(jù)分離株毒力基因攜帶和生物型鑒定情況,38株血清型O∶8分離株(生物1A型)是非致病菌,非致病株占比63.3%,其余22株為致病株,致病株占比36.7%。具體血清型、生物型和毒力基因型情況見表2。

表2 60株YE分離株分型結(jié)果

2.3 PFGE分型結(jié)果 本研究對2023年40株YE分離株進行了PFGE分型實驗,PFGE的分辨力(DI)為0.954。根據(jù)Tenove FC等提出的有關(guān)菌株同源性的判別標(biāo)準(zhǔn),折換成按相似度>85%為相近菌株,進行分型[7]。40株YE分離株可分成23個型,其中有8組優(yōu)勢帶型,主要分子型為A-G組。相同血清型和ST型菌株間相似度高。毒力基因型接近的菌株相似度高,PFGE聚類結(jié)果見圖1。

圖1 2023年40株YE分離株P(guān)FGE分型聚類圖Fig.1 PFGE cluster analysis results of PFGE for 40 YE strains in 2023

2.4 MLST分型結(jié)果分析 MLST分辨力(DI)為0.948。按UPGMA聚類法中∑2 <5,ST型可聚類分為10組,相同ST型相似度高。ST252與ST340、ST178與ST157和ST165、ST166與ST290、ST429與ST470相似度高,親緣關(guān)系近。60株YE分離株共分為29個ST型,普通ST型16種(37株),與江蘇省人源相同ST型5種(13株),新發(fā)現(xiàn)型8種(10株),共29種ST型。2016-2019年江蘇省人源YE分離株6種ST型33株,ST17(6株),ST178(6株),ST157(5株),ST404(4株),ST340(3株),ST3(3株),ST166(2株),ST335(2株),ST703(2株)[7-9]。本研究將遼寧省YE分離株60株ST型與江蘇省人源YE分離株33株ST型共同進行MLST分型研究。ST3、ST252位于圖2核心位置向四周發(fā)散。

圖2 93株YE分離株MLST分型最小生成樹圖Fig.2 Minimum spanning tree of MLST typing for 93 YE isolates

MLST最小生成樹圖及聚類結(jié)果見圖2。主要MLST分子型占比分析情況見表3。

表3 毒力基因型和ST型

3 討 論

3.1 檢出率分析 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種可通過食物進行傳播的人獸共患病病原菌,2020-2023年遼寧省YE分離率分別為3.1%、5.6%、3.8%、1.8%,提示由于遼寧省人民生活水平的提高和疾病防控意識的增加,遼寧省YE流行強度可能會出現(xiàn)下降趨勢。本研究顯示,豬體內(nèi)的YE檢出率較高,豬是遼寧省地區(qū)近年來YE的重要傳染源和宿主。安徽省六安市2015-2018年監(jiān)測結(jié)果顯示當(dāng)?shù)豗E分離率高達12.22%[8],江蘇省2016-2019年監(jiān)測標(biāo)本YE分離率為2.91%[10],河南省2011-2017年YE分離率則為3.06%[11],江蘇省和河南省與遼寧省檢出情況相似,提示國內(nèi)其他地區(qū)YE分離率差異較大。

由于國內(nèi)YE檢出率一直較低[3],本研究為了提高YE檢出率,在采樣時做出以下調(diào)整:1)根據(jù)本項目前期工作基礎(chǔ),沈陽地區(qū)YE檢出率高,本研究對沈陽市樣品采集量大,各市樣品采集量有所不同;2)根據(jù)國家風(fēng)險評估中心的前期工作基礎(chǔ),豬、牛、雞中YE檢出率高,且豬是國內(nèi)近年來YE的重要傳染源和宿主[4],本研究中豬的樣品采集量大,其次為牛和雞;3)采樣時間確定在了檢出率較高污染較重的夏季,且采樣地點選擇了污染較嚴(yán)重的集市和農(nóng)貿(mào)市場。

3.2 血清型分析 YE血清型非常多,曾經(jīng)報道的血清型至少有60個,我國流行血清型是O∶1、O∶2、O∶3、O∶5、O∶8、O∶9[12],而血清型O∶8菌株絕大部分是非致病株。近幾年,占比最高的致病性YE流行血清型為O∶3,O∶3成為國內(nèi)外最主要致病性YE流行血清型[13-14],本研究顯示,2020-2023年遼寧省食源性YE分離株流行致病血清型是O∶3,O∶5和O∶9少量分布的特點,這與江蘇省2016-2019年人源株血清型分布相似[10],這與我國僅存在O∶3和O∶9兩種血清型致病株的報道存在差異[13]。

表2中血清型顯示,22株致病株全部分離自沈陽市樣品,這些致病菌株具有引起食源性疾病的風(fēng)險,而且沈陽市樣品YE檢出率最高,提示沈陽地區(qū)YE污染較嚴(yán)重,致病菌株在沈陽市呈流行趨勢,沈陽市地區(qū)發(fā)生食源性疾病風(fēng)險大,應(yīng)引起重視。另外,遼寧省除沈陽市外,其他13個市樣品中,均有YE檢出,檢出率低,YE地域流行特征不明顯。

3.3 生物型分析 根據(jù)生化結(jié)果YE還可分為6個生物型,據(jù)文獻報道,美國、歐洲地區(qū)和江蘇省在人類臨床樣本中經(jīng)常檢出1A型分離株[9-10],但它們的致病性仍有爭議,研究顯示1A型菌株對人體血清補體殺傷普遍表現(xiàn)出抗性,這表明生物1A型菌株可能具有致病的潛力,但它們的致病機制仍不清楚。本研究顯示,遼寧省動物源YE存在2個生物型,其中1A型為優(yōu)勢生物型,其次為3型。

本研究發(fā)現(xiàn),遼寧省動物源分離株與江蘇省人源YE分離株相同ST型共13株,其中10株為生物3型,3株(ST157)是生物1A型,而在江蘇省研究中顯示這些人源相同ST型全部是生物1A型[9-10],江蘇省絕大部分人源YE分離株是生物1A型。遼寧省沈陽市有兩株生物1A型YE(sy15和sy26)是攜帶毒力基因ail的且MLST型為ST340,而ST340未有文獻報道有從人源菌中得到,提示生物型、ST型和致病性并不一致,應(yīng)重點加強對于生物1A型菌株的研究工作。

血清型O∶3分離株全部攜帶rfbC基因,說明rfbC基因是用于檢測血清型O∶3的YE分離株的特異性基因,這與文獻結(jié)果相同[15]。2株血清型O∶8分離株攜帶毒力基因(Ⅱ型),為致病菌株,而大多數(shù)血清型O∶8菌株缺乏毒力質(zhì)粒不攜帶毒力基因,為非致病菌,個別血清型O∶8菌株單獨攜帶ail基因,致病性有待進一步驗證。

3.5 分子分型分析 沈陽市分離株sy35和sy28(血清型O∶8、生物3型)與沈陽市其他7株致病菌分離株(血清型O∶3、生物3型)PFGE分子型相似度高,PFGE分子型都是A組,提示雖然一般情況下血清型O∶8是非致病菌株,但這兩株分離株為致病菌,除了rfbC基因,其他毒力基因全部攜帶,致病力不容小覷,PFGE分子型A組為毒力基因Ⅱ和Ⅲ型、血清型O∶3、生物型3的優(yōu)勢帶型。fs29、tl13、dl24(血清型O∶8、生物1A型)與致病菌PFGE分子型相似度高,雖然為非致病性菌株,下一步應(yīng)該對其深入研究,這些菌株應(yīng)引起注意。40株分離株中,相同血清型菌株P(guān)FGE分子型相似度高,攜帶毒力基因情況越相似的菌株P(guān)FGE分子型相似度越高。相同的ST型菌株P(guān)FGE分子型相似度高,相同的ST型菌株基本都被分成相同的組,提示ST型與PFGE分子型具有一致性。PFGE分子型A組為2023年遼寧省沈陽市地區(qū)流行分子型。

遼寧省地區(qū)ST型呈現(xiàn)多樣化狀態(tài),YE基因組在進化過程中容易大段的插入或丟失,所以7個管家基因變異度較高,ST型呈分散分布。圖2顯示,所有ST型以ST3、ST252為核心,呈分散分布。ST3位于聚類圖上核心位置向四周發(fā)散,并有4個與江蘇省人源相同的ST型(ST157、ST166、ST17、ST178)相關(guān)的主要進化方向。ST252也位于聚類圖上核心位置有一個與江蘇省人源相同的ST型(ST340)相關(guān)的主要進化方向。遼寧省60株分離株中數(shù)量最多的ST型為ST429(8株)只在動物源樣品中分離到,ST157(5株)、ST3(3株)、ST340(2株)、ST166(2株)、ST17(1株)這5個ST型在江蘇省地區(qū)人源樣品中也分離到,歐洲地區(qū)均有報道,且ST17和ST157在人源分離株中數(shù)量最多,ST157型在歐洲地區(qū)和美國YE爆發(fā)流行時有檢出的相關(guān)報道[14],提示這些分離株具有引起食源性疾病的高風(fēng)險,應(yīng)該引起高度重視。

既往研究顯示,YE分離情況大致呈現(xiàn)以豬為“圓心”向四周以同心圓形式發(fā)散的分布理論[11]。本研究采集3種肉類標(biāo)本中均有菌株檢出,豬中分離率最高,牛和雞中分離率也不低,提示遼寧省地區(qū)YE動物宿主分布并不單一,從豬分離到與人源菌(江蘇省)相同ST型的菌株最多,提示豬是遼寧省地區(qū)重要的宿主和傳染源。下一步,將重點加入遼寧省人源YE分離株和食品YE分離株的相關(guān)性研究。遼寧省內(nèi),豬、牛和雞飼養(yǎng)比較普遍,在動物飼養(yǎng)、屠宰、運輸和肉制品加工過程中,相關(guān)從業(yè)人員需做好個人防護,同時加強對周邊環(huán)境消毒消殺等保護工作[13]。

3.6 分子分型比對研究評價 分型方法因素[6]:1) 分辨力(DI),定量區(qū)分兩個不相關(guān)菌株為不同型的可能性;2) 分型力。即種屬內(nèi)細菌通過該方法得到分型的能力;3) 可重復(fù)性。指對菌株用該方法重復(fù)測試時能產(chǎn)生相同結(jié)果的能力;4) 電泳帶型是否易于解釋,成為評定一種分型方法實用性的一個因素;5)同時還應(yīng)考慮該方法是否經(jīng)濟、快速、簡便等。

PFGE和MLST方法對遼寧省YE分離株分型均是可行的,方法擴增均基本穩(wěn)定,每次試驗均能重復(fù)產(chǎn)生不同程度多態(tài)性DNA主條帶。這2種分子分型方法均滿足上述5種評價標(biāo)準(zhǔn),分辨力:PFGE>MLST。PFGE較MLST方法分辨力稍高,相同ST型菌株在PFGE分型中可以進一步分型。分子分型研究結(jié)果與本項目組前期研究結(jié)果一致,與國內(nèi)其他省研究結(jié)果相似[11]。

MLST方法需要對基因序列進行測序后分型,個別核苷酸序列的差異可能就會導(dǎo)致型別不同,ST型出現(xiàn)較多,新型間的比對需要時間互通。MLST是一種基于測定菌株的核苷酸序列來對菌株進行分子分型的新型技術(shù),其主要是利用不同菌株都存在管家基因和其管家基因上存在足夠的位點產(chǎn)生變異的等位基因的特點來對菌株進行研究,因此該方法不適用于變異程度低的菌株,缺少基因組中毒力島的更加詳細的信息。MLST實驗中新技術(shù)要求嚴(yán)格,且現(xiàn)階段測序及分析成本高。因此PFGE在現(xiàn)階段的病原菌分型上,仍能夠發(fā)揮優(yōu)越的效能,PFGE具有公認(rèn)的圖譜判定標(biāo)準(zhǔn)、配套的儲存分析軟件,對于追蹤與驗證食源性疾病感染、食物中毒爆發(fā)流行的致病菌方面,仍是一種非常實用高效的分型工具[11]。

利益沖突：無

引用本文格式：李雪,孫婷婷,魏彤竹,等.2020-2023年遼寧省小腸結(jié)腸炎耶爾森菌表型分布和分子特征研究[J].中國人獸共患病學(xué)報,2024,40(2):97-103. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.015