張 露，王新惠，2*，冉凌云，楊婷婷，趙樂樂，吳明陽

（1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都農(nóng)業(yè)科技中心，四川 成都 610213；3.達(dá)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 達(dá)州 635000）

紫馬鈴薯具有豐富的營養(yǎng)成分，而且富含花青素、多酚等多種生物活性成分。市面上關(guān)于紫馬鈴薯的食品以鮮品為主，加工產(chǎn)品較少，發(fā)酵制品更少。紫馬鈴薯發(fā)酵酒是以紫馬鈴薯為原料，經(jīng)過挑選、粉碎、糖化及發(fā)酵等加工流程，制得的酒體通透且呈紫色，口感微酸，香氣宜人的產(chǎn)品[1]，但目前紫馬鈴薯酒的制備方法中，存在紫馬鈴薯汁花青素含量較低、可溶性固形物含量少、發(fā)酵液渾濁度較高及其加熱處理溫度和時間局限性大等問題[2]，影響發(fā)酵成品質(zhì)量。

花青素具有抗氧化[3]、防癌、護肝、降血糖[4]、抗衰老和預(yù)防疾病[5]等多種功效，但其相對不穩(wěn)定，在加工及儲存過程中易降解，尤其在煮沸過程，花青素?fù)p失最高[6]。方忠祥等[7]研究了紫肉甘薯中的花青素在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在不同pH環(huán)境中，花青素呈現(xiàn)顏色不同，且對溫度的耐熱性較差，在100 ℃條件下保存5 h，粗提取物保留率僅為47.4%。孫倩怡等[8]對藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性研究得出，pH≤3條件保存6 h后，花青素保存率基本趨于穩(wěn)定（90%以上），而乳清蛋白對花青素保留率達(dá)到89%。通過使用酶解方法對紫馬鈴薯汁進(jìn)行處理，有利于提高發(fā)酵效率、增加發(fā)酵底物產(chǎn)量和提高感官質(zhì)量，同時糖化升溫過程，熱處理會將多糖分解為簡單的單體，并且殺死不必要的微生物[9]。鄒穎等[10]研究了不同高溫α-淀粉酶添加量對紫馬鈴薯的出汁率、花色苷含量和還原糖的影響，紫馬鈴薯出汁率隨著添加高溫α-淀粉酶顯著增加，花色苷含量亦隨之升高，并且酶用量增大，還原糖含量顯著提高。

因此，本試驗以紫馬鈴薯為原料，通過單因素及田口試驗設(shè)計對紫馬鈴薯酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素及雙因素方差分析對紫馬鈴薯汁護色條件進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到提升紫馬鈴薯發(fā)酵酒質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫馬鈴薯（黑金剛，產(chǎn)于西藏）：市售；無水檸檬酸：濰坊英軒實業(yè)有限公司；乳清蛋白粉：永信食品配料有限公司；纖維素酶（2×103IU/mg）、果膠酶（2×104IU/mg）：北京鴻潤寶順科技有限公司；高溫α-淀粉酶（1×104IU/mg）：南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5200紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；ESJ120-4B分析天平：北京市六一儀器廠；L-500 折光計：溫濕制造公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海-恒科學(xué)儀器有限公司；JYL-C19V 攪拌機：九陽股份有限公司；K2025 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司；LDZX-75L 立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；WGZ-100 濁度計：上海昕瑞儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫馬鈴薯汁制備操作要點[11-14]

挑選稱量500 g紫馬鈴薯，清洗、去皮，切割為2 cm方塊，快速添加試劑（檸檬酸、乳清蛋白）和酶，混勻后放入攪拌機2 300 r/min攪碎1 min，轉(zhuǎn)接入玻璃容器，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中分3個階段升溫（N1：55 ℃、3 h，N2：80 ℃、3 h，N3：100 ℃、3 h）并不斷攪拌，使其受熱均勻，直至達(dá)到出現(xiàn)分層現(xiàn)象，過濾取上清液，得成品紫馬鈴薯汁。

1.3.2 紫馬鈴薯酶解工藝優(yōu)化單因素試驗

以不添加酶（空白組）為對照，參考GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中最大使用量，分別考察高溫α-淀粉酶（0.1%、0.2%、0.3%）、果膠酶（0.1%、0.2%、0.3%）和纖維素酶（0.1%、0.3%、0.5%）添加量對紫馬鈴薯出汁率、可溶性固形物、濁度的影響。平行測定3組，重復(fù)2組。

1.3.3 紫馬鈴薯酶解工藝優(yōu)化田口試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用田口試驗分析法[15-16]對紫馬鈴薯酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定控制因素為高溫α-淀粉酶添加量（A）、果膠酶添加量（B）和纖維素酶添加量（C），選擇單因素試驗中效果最佳2個水平；噪音（不可控因素）為糖化升溫過程中3個階段N1（55 ℃、3 h）、N2（80 ℃、3 h）和N3（100 ℃、3 h），進(jìn)行優(yōu)選研究，田口試驗因素與水平見表1。

表1 紫馬鈴薯酶解工藝優(yōu)化田口試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of taguchi experiments for enzymatic process optimization of purple potato

1.3.4 紫馬鈴薯汁護色工藝優(yōu)化單因素試驗[15-16]

分別考察檸檬酸（1.4%、1.5%、1.6%）、乳清蛋白（0.1%、0.2%、0.3%）添加量對紫馬鈴薯汁花青素含量及花青素保留率的影響。平行測定3組，重復(fù)2組。

1.3.5 紫馬鈴薯汁護色工藝優(yōu)化雙因素試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用雙因素試驗對紫馬鈴薯汁護色工藝優(yōu)化，雙因素試驗因素與水平見表2。

表2 紫馬鈴薯汁護色工藝優(yōu)化雙因素試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of two-factor experiments for color protection process optimization of purple potato juice

1.3.6 測定方法

可溶性固形物含量：按照參考文獻(xiàn)[17-18]的方法進(jìn)行；出汁率：按照參考文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行；濁度值：按照參考文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行。

總花青素含量[21-22]：取紫馬鈴薯汁，分別加入pH 1.0和pH 4.5的緩沖液，避光放置15 min，測定波長510 nm處和波長700 nm處的吸光度值。每個樣品平行測定3次，取平均值，計算總花青素含量，其計算公式如下：

式中：A為吸光度值差值A(chǔ)=（A510nmpH1.0-A700nmpH1.0）-（A510nmpH4.5-A700nmpH4.5）；ε為矢車菊花素-3-O-葡萄糖苷的消光系數(shù)（26 900 L/（mol·cm））；AW為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量（449.2 g/mol）；DF為稀釋因子，mg；L為光程，cm。

總花青素保留率[23-24]：測定紫馬鈴薯汁加熱前后在波長525 nm處的吸光度值，計算保留率，其計算如下：

式中：R為總花青素保留率，%；A為加熱后紫馬鈴薯汁OD525nm的值；A0為加熱前紫馬鈴薯汁OD525nm的值。

花青素含量、種類：按照參考文獻(xiàn)[25-26]的方法進(jìn)行測定。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用R 4.2.2軟件進(jìn)行方差齊性檢驗、多因素方差分析和田口試驗分析、差異顯著性檢驗分析。每個試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均值”或“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫馬鈴薯酶解工藝優(yōu)化試驗

2.1.1 紫馬鈴薯酶解工藝優(yōu)化單因素試驗

由圖1可知，隨著高溫α-淀粉酶添加量的增加，紫馬鈴薯的出汁率和可溶性固形物含量增長趨勢明顯，且在高溫α-淀粉酶添加量為0.2%時到達(dá)頂點，分別為（54.6±6.6）%和（66±11.4）g/L，同時，濁度值呈明顯下降趨勢，高溫α-淀粉酶添加量為0.3%時，濁度值下降，但出汁率和可溶性固形物含量下降。因此，當(dāng)高溫α-淀粉酶添加量為0.2%和0.3%時，紫馬鈴薯的品質(zhì)指標(biāo)有所提升。選擇高溫α-淀粉酶添加量為0.2%和0.3%進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖1 高溫α-淀粉酶對紫馬鈴薯出汁率、可溶性固形物含量及其濁度的影響Fig.1 Effect of thermostable α-amylase on juice yield, soluble solid content and turbidity in purple potato

由圖2可知，隨著果膠酶添加量的增加，紫馬鈴薯的出汁率和可溶性固形物含量增加趨勢明顯，且在果膠酶添加量為0.3%時達(dá)到頂點，分別為（51.4±6.0）%和（66±11.8）g/L，但同時濁度值高達(dá)（106.9±10.3）NTU，觀察時有明顯渾濁現(xiàn)象。果膠酶添加量0.2%和0.3%進(jìn)行對比，紫馬鈴薯汁出汁率、可溶性固形物含量和濁度值無明顯差異。因此，在改善紫馬鈴薯出汁率和可溶性固形物含量方面，果膠酶添加量為0.2%和0.3%有類似效果。因此，選擇果膠酶添加量為0.2%和0.3%進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖2 果膠酶對紫馬鈴薯出汁率、可溶性固形物及其濁度的影響Fig.2 Effect of pectinase addition on juice yield, soluble solid content and turbidity in purple potato

由圖3可知，隨著纖維素酶添加量的增加，紫馬鈴薯的出汁率和可溶性固形物含量增加趨勢明顯，且在纖維素酶添加量為0.5%時達(dá)到頂點，分別為（44.6±8.1）%和（58±7.5）g/L，但同時濁度值高達(dá)（68.65±4.9）NTU。當(dāng)纖維素酶含量為0.3%時，其出汁率和可溶性固形物含量相對0.1%纖維素酶較高，而濁度值相對0.5%添加量較低。因此，選擇纖維素酶添加量為0.3%和0.5%進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖3 纖維素酶對紫馬鈴薯出汁率、可溶性固形物及其濁度的影響Fig.3 Effect of cellulase addition on juice yield, soluble solid content and turbidity in purple potato

總體來說，單獨使用三種酶，都能夠有利于改善紫馬鈴薯部分品質(zhì)，但并不能直接確定酶含量，缺乏判定依據(jù)。因此，結(jié)合實際添加情況（考慮外部因素的影響）以及酶含量的影響，設(shè)計同時添加三種酶，進(jìn)一步研究確定高溫α-淀粉酶、果膠酶和纖維素酶的使用量，從而達(dá)到最佳添加量以提升紫馬鈴薯出汁率、可溶性固形物的目的。

2.1.2 紫馬鈴薯酶解工藝優(yōu)化田口試驗設(shè)計

按表1設(shè)計16種酶解組合進(jìn)行試驗，分別測定可溶性固形物含量。計算信噪比（S/N），以其作為評價指標(biāo)，優(yōu)選制備工藝，結(jié)果見表3。

表3 紫馬鈴薯酶解工藝優(yōu)化田口試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of taguchi experiments for enzymatic process optimization of purple potato

由于田口方法中，S/N值越大表明其效果越理想，求出各個因在不同水平上的S/N值，并以圖形式給出了各個因素隨不同水平的變化趨勢（圖4）。由圖4可知，A因素（高溫α-淀粉酶）的水平1，B因素（果膠酶）的水平2，C因素（纖維素酶）水平2為各因素的最佳水平。

圖4 不同因素在不同水平的S/N變化趨勢圖Fig.4 S/N change trends map of different factors at different levels

通過圖4預(yù)測，A1B2C2各因素水平上最優(yōu)水平條件下信噪比為16.81 dB，帶入S/N計算，可以得出紫馬鈴薯固形物含量最佳預(yù)測值為69.3 g/L。

所選方案是正交表中存在方案，需做試驗加以驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。按方案A1B2C2進(jìn)行酶解，共3組，其余操作不變。結(jié)果表明，紫馬鈴薯可溶性固形物含量均值為70.3 g/L，相對偏差在2.4%以內(nèi)，與預(yù)測值比較相差不大，結(jié)果較為滿意。

2.2 紫馬鈴薯汁護色工藝優(yōu)化

2.2.1 紫馬鈴薯汁護色工藝優(yōu)化單因素試驗

不同檸檬酸和乳清蛋白添加量對紫馬鈴薯汁的總花青素含量及其保留率的影響見圖5。由圖5可知，紫馬鈴薯汁的總花青素含量平均值和保留率隨著檸檬酸添加量的增加而增加，并且當(dāng)檸檬酸添加量為1.6%時，花青素保留率為81.40%，總花青素含量為91.20 mg/L，說明檸檬酸對穩(wěn)定花青素有積極影響。隨著乳清蛋白添加量的增加，總花青素含量也略有增加，并且當(dāng)添加量為0.3%時，花青素保留率為22.06%，總花青素含量為24.71 mg/L，說明乳清蛋白對穩(wěn)定花青素也有一定積極作用。

圖5 檸檬酸和乳清蛋白添加量對紫馬鈴薯汁的總花青素含量及保留率影響Fig.5 Effect of citric acid and whey protein addition on total anthocyanin content and retention rate of purple potato juice

檸檬酸改變了花青素環(huán)境的pH值，而花青素在不同的pH條件下顏色不同，此現(xiàn)象與其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有關(guān)，并且酸類物質(zhì)與花青素在加熱時發(fā)生了分子間的輔色效應(yīng)，能夠提高花青素耐熱性，且保留率會上升[7]。另一方面，檸檬酸濃度過高會影響紫馬鈴薯汁飲用，添加糖類物質(zhì)會影響花青素穩(wěn)定性[8]。而乳清蛋白能夠提高花青素耐熱性，并且花青素會影響乳清蛋白的極性和疏水性，兩者存在相互作用[16]。

因此，為了更好穩(wěn)定紫馬鈴薯汁中的花青素，同時使用不同含量檸檬酸和乳清蛋白對花青素的影響有了實際意義，進(jìn)一步分析探究檸檬酸和乳清蛋白在穩(wěn)定紫馬鈴薯汁中花青素是否存在相互作用。

2.2.2 紫馬鈴薯汁護色工藝優(yōu)化雙因素方差分析試驗

由表4～表6可知，添加1.6%檸檬酸和0.3%乳清蛋白護色效果最佳，在此條件下，紫馬鈴薯汁總花青素含量最高為102.4 g/L，平均含量為99.06 g/L。因素A（檸檬酸）和因素B（乳清蛋白）的P值都遠(yuǎn)大于0.05的顯著性水平，不能拒絕原假設(shè)，說明因素A和因素B各水平是滿足方差齊性。通過雙因素方差分析，結(jié)果說明因素A和因素B的P值均小于0.001，表示兩種因素分組的試驗下，花青素含量明顯不同，即兩種因素都對結(jié)果產(chǎn)生影響，卻無交互作用。

表4 紫馬鈴薯汁護色工藝優(yōu)化雙因素試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of two-factor experiments for color protection process optimization of purple potato juice

表5 方差齊性檢驗結(jié)果Table 5 Test results of homogeneity of variance

表6 雙因素試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of two-factor experiments results

2.3 紫馬鈴薯汁花青素種類及其含量分析

通過HPLC分析經(jīng)過酶解優(yōu)化工藝制備的紫馬鈴薯汁，其花青素含量及其種類如圖6。由圖6可知，紫馬鈴薯汁中總花青素含量為150.81 mg/L，其中含量最高為矮牽牛色素（69.21 mg/L），錦葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素占比相對較少，此外含有微量的天竺葵色素。

圖6 紫馬鈴薯汁中花青素種類及其含量Fig.6 Anthocyanin species and contents in purple potato juice

3 結(jié)論

本試驗通過單因素及田口試驗設(shè)計對紫馬鈴薯酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素及雙因素試驗對紫馬鈴薯汁護色條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，添加0.2%高溫α-淀粉酶、0.3%果膠酶和0.5%纖維素酶時，紫馬鈴薯汁可溶性固形物含量最高為70.3 g/L；添加1.6%檸檬酸和0.3%乳清蛋白護色效果最佳，紫馬鈴薯汁總花青素含量最高為102.4 g/L，平均含量為99.06 g/L。