南福龍,孟海藍(lán),李紫薇,,沙 洲,尼 博,劉拂曉

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109;2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東 青島 266032)

2007年在加拿大發(fā)現(xiàn)了一種可引起豬水皰性疾病的新發(fā)病毒[1]。該病毒最初被命名為塞內(nèi)卡谷病毒,現(xiàn)重命名為A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A,SVA)。隨后,美國、巴西等多個國家相繼發(fā)現(xiàn)該病毒感染的病例[2]。SVA多感染育肥豬和新生仔豬,無明顯季節(jié)性,臨床癥狀為病豬口鼻部、蹄部和黏膜處出現(xiàn)水皰樣病變,后期發(fā)生潰瘍甚至糜爛[2];病豬出現(xiàn)厭食、發(fā)熱和嘔吐等癥狀,與口蹄疫及其他水皰病癥狀十分相似;感染SVA的新生仔豬死亡率高達(dá)70%,部分痊愈仔豬生長發(fā)育不良,給我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。我國于2015年首次發(fā)現(xiàn)SVA感染病例[3],其傳播十分迅速。自2015年以來,我國湖北、黑龍江等多個省市均成功分離到SVA毒株[2]。2019年,Liu等[4]從廣東省分離出4株SVA,經(jīng)重組分析表明,SVA發(fā)生重組變異,具有遺傳多樣性。SVA較高的變異性和毒株的多樣性是其難以防控的主要原因,目前SVA感染尚沒有針對性的防治方案和有效的商品化疫苗,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來較大的挑戰(zhàn)。因此,本文對 SVA 的基因組結(jié)構(gòu)和功能以及SVA結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié),旨在為進(jìn)一步研究SVA致病機(jī)制、建立新的防控方法提供參考。

1 病原學(xué)

SVA屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞內(nèi)卡病毒屬(Senecavirus),且是該屬唯一的成員[2]。早在2008年就有研究表明,SVA結(jié)構(gòu)與其他小RNA病毒科成員相似[5]。SVA病毒粒子為二十面體對稱的球形顆粒(圖1),直徑大約為27 nm,無囊膜[2]。SVA含有4種結(jié)構(gòu)蛋白,基因組為單股正鏈、不分節(jié)段的RNA,全長約7 300 nt,無5′ 帽子結(jié)構(gòu),但具有3′ 多聚A尾。基因組包含約668 nt的5′ 非編碼區(qū)(Untranslated region,UTR),1個多聚蛋白開放閱讀框(Open reading frame,ORF)和長約68 nt的3′ UTR。

圖1 SVA病毒粒子結(jié)構(gòu)示意圖[2]

2 SVA基因組序列元件

2.1 編碼區(qū)序列 SVA多聚蛋白ORF長度為6 546 nt,可編碼2 181個氨基酸。如圖2所示,該ORF由L序列和中間體P1、P2、P3區(qū)組成。P1區(qū)可分為VP1、VP2、VP3和VP4 四個結(jié)構(gòu)基因,P2區(qū)分為2A、2B和2C三種非結(jié)構(gòu)基因,P3區(qū)分為3A、3B、3C和3D四種非結(jié)構(gòu)基因。SVA基因組與其他小RNA病毒相似,都具有典型的“L-4-3-4”布局[2]。

圖2 SVA基因組示意圖[2]

2.2 5′ UTR序列 SVA基因組的5′ 末端與病毒連接蛋白(Viral genome-linked protein,VPg)共價相連。如圖3所示,SVA 5′ UTR包含1個重要的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(Internal ribosome entry site,IRES)[6],在病毒增殖過程中,該結(jié)構(gòu)可通過與起始因子結(jié)合參與病毒RNA的翻譯。小RNA病毒的

圖3 SVA IRES示意圖[6]

IRES區(qū)域含有多個復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu),其中在起始密碼子AUG上游的假結(jié)(Pseudoknot,PK)結(jié)構(gòu)中,假結(jié)頸部I(Pseudoknot stem I,PKS-I)形成基序的完整性影響著核糖體40S亞基的結(jié)合,而假結(jié)頸部II(PKS-II)形成基序的突變,使IRES在核糖體P位點定位起始密碼子的能力減弱[7]。SVA IRES區(qū)域可以招募核糖體,使病毒以不依賴于5′ 帽子結(jié)構(gòu)的方式啟動蛋白翻譯[8],因此IRES對SVA啟動蛋白翻譯至關(guān)重要。

Willcocks等[9]研究表明,SVA 5′ UTR下游假結(jié)的PKS-II兩個相鄰位點突變(CC→GG),將嚴(yán)重降低IRES活性。然而,Liu等[10]通過微型基因組轉(zhuǎn)染方法,證明了該結(jié)構(gòu)的任何點突變都不會對IRES啟動蛋白表達(dá)的活性產(chǎn)生顯著影響;同時借助反向遺傳技術(shù),證明了假結(jié)受到破壞的IRES也不會對SVA反基因組復(fù)制產(chǎn)生干擾,但會導(dǎo)致重組SVA拯救失敗。由此得出一種假說,即假結(jié)的破壞可能使SVA基因組的衣殼化信號受到抑制。Liu等[6]還證明,SVA能夠完全耐受PKS-Ia和非配對間隔序列的突變,相比而言,PKS-Ib可能是SVA拯救所必需的保守序列 。

SVA含有1個丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)樣IRES[11],主要包括2個區(qū)域(Domain,D),即DII和DIII,后者包括DIIIa、DIIIb、DIIIc、DIIId1、DIIId2、DIIIe和DIIIf,這是8種不同的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。Liu等[12]構(gòu)建了8個各含有1個莖環(huán)突變的SVA cDNA克隆,結(jié)果顯示,這些突變的cDNA克隆都不能單獨拯救出具有復(fù)制能力的SVA,表明SVA IRES中每個假定的結(jié)構(gòu)域?qū)τ诓《緩?fù)制都是必不可少的,但在成對轉(zhuǎn)染8個cDNA克隆的28個組合中,成功復(fù)活出4個野生型SVA,說明2個復(fù)制缺陷型不同的SVA在胞內(nèi)發(fā)生了RNA重組,即SVA基因組之間存在重組現(xiàn)象,除此之外,該研究還提出了“選擇性復(fù)制(Copy-choice)”的病毒重組模型。

SVA IRES假結(jié)與AUG之間有一段13 nt序列,Liu等[13]將SVA cDNA克隆的13 nt序列進(jìn)行了逐一敲除,試圖拯救核苷酸缺陷型重組病毒,結(jié)果表明,SVA的13 nt序列最多容忍5個核苷酸的缺失,即便如此,由于RNA病毒的不保真特性,只有1 nt和2 nt缺失型SVA可以穩(wěn)定傳代,其他3株拯救的病毒在13 nt序列處皆有核苷酸突變或增加。該研究揭示了1、2和3 nt缺失型SVA的復(fù)制特性,并證明當(dāng)13 nt序列缺失2個核苷酸時,已經(jīng)對病毒的生長造成影響。該研究最終提出假想模型,即SVA IRES-AUG距離影響病毒起始密碼子在核糖體中的準(zhǔn)確定位。

SVA的翻譯起始于IRES近端的起始密碼子,而起始密碼子通過直接定位在核糖體亞基上啟動翻譯。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn),從含有ATG側(cè)翼為3個核苷酸倍數(shù)的外源序列的cDNA克隆中可拯救出具有復(fù)制能力的重組SVA,不是3的倍數(shù)的外源序列則導(dǎo)致病毒拯救失敗,可能是IRES近端的人工AUG取代真正的AUG,進(jìn)而引導(dǎo)多聚蛋白翻譯,最終致使病毒拯救失敗。

小RNA病毒5′ UTR通常有1個二級結(jié)構(gòu)不同的功能結(jié)構(gòu)域,其對病毒的復(fù)制至關(guān)重要。Meng等[15]通過網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對SVA 5′ UTR進(jìn)行分析,建立了其RNA的二級結(jié)構(gòu),并利用反向遺傳技術(shù)對其進(jìn)行基因修飾,以拯救重組病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分基序都不能忍受額外的基因修飾,說明該結(jié)構(gòu)可能是SVA合成RNA等機(jī)制的重要順式作用元件;同時該研究還發(fā)現(xiàn),SVA可以修復(fù)其5′ 末端的核苷酸缺陷,其自我修復(fù)的極限是5個連續(xù)的核苷酸。

2.3 3′ UTR序列 SVA的3′ UTR高度結(jié)構(gòu)化,下游連接多聚A尾結(jié)構(gòu),長度較短。多聚A尾可以避免病毒在細(xì)胞中被核酶降解,并且對病毒的感染起著非常關(guān)鍵的作用。結(jié)構(gòu)分析表明,腸道病毒的3′ UTR吻環(huán)結(jié)構(gòu)具有1個同軸螺旋結(jié)構(gòu)域,該螺旋結(jié)構(gòu)域與其他各個結(jié)構(gòu)域形成復(fù)制原點的整體結(jié)構(gòu),啟動負(fù)鏈RNA的合成,若將相關(guān)基序突變,則會擾亂吻環(huán)間的相互作用,從而抑制腸道病毒合成RNA[16]。SVA 3′ UTR具有2種高級RNA結(jié)構(gòu):吻環(huán)和H型假結(jié),但這2種結(jié)構(gòu)不能在3′ UTR共存。Liu等[17]利用反向遺傳技術(shù)對SVA 3′ UTR中的吻環(huán)或假結(jié)基序進(jìn)行一個或多個點突變,結(jié)果表明,若在3′ UTR中存在假定的吻環(huán)結(jié)構(gòu),其對于SVA的復(fù)制是非必要的;若存在假結(jié)結(jié)構(gòu),其突變將對SVA的復(fù)制產(chǎn)生“致命”影響。

3 SVA蛋白

3.1 結(jié)構(gòu)蛋白 SVA的結(jié)構(gòu)蛋白,也稱為衣殼蛋白,由VP1、VP2、VP3和VP4 四種蛋白組成,對應(yīng)的基因分布見圖2,結(jié)構(gòu)蛋白的功能見表1。4種結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒粒子的包裝,結(jié)構(gòu)蛋白是SVA主要的保護(hù)性抗原,存在中和表位,可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,常作為血清學(xué)檢測方法和疫苗研發(fā)的靶蛋白;此外,結(jié)構(gòu)蛋白還可以與細(xì)胞受體結(jié)合,介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞,使病毒對某些有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生選擇性細(xì)胞毒性[18]。

表1 SVA結(jié)構(gòu)蛋白的功能

VP1、VP2和VP3蛋白分布在病毒顆粒的最外層,其中,VP1蛋白具有最強(qiáng)的免疫原性,可用于病毒血清學(xué)鑒定[5,18]。此外,VP1蛋白含有潛在的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位,且高抗原指數(shù)的21GELAAP26完全暴露在VP1蛋白表面,可能是B細(xì)胞重要的線性表位[19]。Zhao等[20]通過SVA的VP1蛋白對其遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析,鑒定出4個核苷酸突變(A65T、N94S、A114P和S229G),并假設(shè)其與當(dāng)前我國發(fā)現(xiàn)的SVA致病性的改變有關(guān)。研究表明,SVA的非結(jié)構(gòu)蛋白參與細(xì)胞自噬,并利用自噬機(jī)制促進(jìn)病毒感染[21]。但最近的一項研究表明,SVA的結(jié)構(gòu)蛋白VP1同樣參與激活信號通路以誘導(dǎo)自噬[22]。

VP2蛋白與血清中的抗體具有較高的結(jié)合反應(yīng)性[23]。有研究評估了豬對SVA感染的細(xì)胞免疫反應(yīng),發(fā)現(xiàn)相比于VP1和VP3蛋白,VP2蛋白可引起更高的T細(xì)胞反應(yīng),表明VP2蛋白含有免疫顯性T細(xì)胞表位[24]。炭疽毒素受體1(Anthrax toxin receptor 1,ANXTR1)是SVA的高親和力細(xì)胞受體,可與衣殼表面的關(guān)鍵殘基相互作用,研究發(fā)現(xiàn),大部分ANXTR1分布于VP2蛋白表面[25]。

VP3蛋白可以在SVA感染的早期階段誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[24]。VP3蛋白表面具有線性表位,但迄今為止只報道過其B細(xì)胞表位[26]。研究表明,VP3蛋白還可與其他蛋白協(xié)同作用以參與細(xì)胞自噬[22,27]。

VP4蛋白位于蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)部,在4種結(jié)構(gòu)蛋白中相對保守。小RNA病毒科的一些成員在感染期間會形成天然的空顆粒,但由于VP0蛋白無法正確切割或VP4蛋白可能與衣殼解離等原因,這些空顆粒穩(wěn)定性較差。相反,SVA VP4蛋白的終端特異性β鏈部分附著在VP2蛋白上穩(wěn)定其結(jié)構(gòu),并裂解VP0蛋白產(chǎn)生VP2和VP4蛋白,進(jìn)而組裝成穩(wěn)定的前體衣殼,表明SVA前體衣殼可作為病毒樣顆?；虬┌Y靶向藥物遞送的工具[8]。SVA是一種無囊膜病毒,其感染細(xì)胞不依賴于膜融合,而是通過其他機(jī)制將其基因組運送到細(xì)胞中,VP4蛋白在此過程中起著主要作用。現(xiàn)已證明,同屬小RNA病毒科的人鼻病毒,其小豆蔻?；職さ鞍譜P4從病毒中釋放出來并與細(xì)胞膜相互作用,導(dǎo)致細(xì)胞膜上形成孔隙,提高了細(xì)胞膜的通透性,進(jìn)而將病毒RNA基因組遞送到細(xì)胞質(zhì)中以啟動病毒復(fù)制[28]。

3.2 非結(jié)構(gòu)蛋白 SVA的非結(jié)構(gòu)蛋白有L蛋白、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D 八種,對應(yīng)的基因分布見圖2。非結(jié)構(gòu)蛋白比結(jié)構(gòu)蛋白更保守,不與病毒粒子結(jié)合,主要參與病毒復(fù)制、基因表達(dá)調(diào)控和與宿主之間的相互作用[5],不同非結(jié)構(gòu)蛋白的功能見表2。

表2 SVA非結(jié)構(gòu)蛋白的功能

L蛋白是小RNA病毒最先表達(dá)的蛋白。在口蹄疫病毒和心病毒等小RNA病毒中,L蛋白被證明是具有特殊“鋅指”構(gòu)象的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶,主要參與抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,切割真核起始因子,調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程[29-30]。SVA L蛋白的不同之處在于其缺乏蛋白水解活性所需的催化殘基,且沒有“鋅指”構(gòu)象或酪氨酸磷酸化基序,表明其功能可能與口蹄疫病毒和心病毒不同,確切功能仍需進(jìn)一步研究[5]。

SVA 2A蛋白是只有9個氨基酸的短肽,其末端存在NPG/P保守基序,具有核糖體跳躍功能,即多肽合成的中斷發(fā)生在P1-2A和2BC-P3之間。若2A蛋白附著在VP1蛋白的羧基末端或與VP1蛋白分離,可能會導(dǎo)致多聚蛋白合成中斷,但尚未有研究證明2A蛋白是否附著在VP1蛋白的羧基末端或與VP1蛋白分離[5]。

小RNA病毒2B蛋白具有在細(xì)胞感染過程中增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性的能力,SVA 2B蛋白的一級結(jié)構(gòu)與其他已知的小RNA病毒的一級結(jié)構(gòu)不同,但其二級結(jié)構(gòu)與其他小RNA病毒2B蛋白的二級結(jié)構(gòu)非常相似,因此推測SVA 2B蛋白可作為病毒孔蛋白,在增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性方面發(fā)揮重要作用。除此之外,2B蛋白不切割線粒體抗病毒信號蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS),也不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但可與MAVS相互作用以降低MAVS的表達(dá),導(dǎo)致I型干擾素的表達(dá)量降低[31]。

2C蛋白是最保守的病毒非結(jié)構(gòu)蛋白之一,在病毒生命周期和免疫逃逸中起著不可或缺的作用[32]。2C蛋白可以靶向定位于線粒體,使細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中,從而在一系列信號級聯(lián)反應(yīng)中激活半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[33]。2C蛋白還可以借助半胱天冬酶介導(dǎo)的蛋白降解,靶向作用于視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I),并阻斷干擾素誘導(dǎo)基因56(Interferon-stimulated gene 56,ISG56)和干擾素β(Interferon-β,IFN-β)的轉(zhuǎn)錄以削弱宿主先天免疫反應(yīng)[34]。

小RNA病毒的3A蛋白高度分化,在不同屬的小RNA病毒復(fù)制周期中發(fā)揮不同的功能[35]。關(guān)于SVA 3A蛋白的確切功能尚不清楚,但最近有研究表明,口蹄疫病毒的3A蛋白可以通過自噬抑制IFN信號傳導(dǎo)并抑制宿主先天性抗病毒反應(yīng)[36]。

SVA 3B區(qū)域編碼一種VPg蛋白,其經(jīng)尿苷?；罂勺鳛椴《綬NA合成的引物[37]。先前的研究證實,小RNA病毒基因組的ORF中存在順式作用復(fù)制元件(cis-acting replication element,cre),而口蹄疫病毒的cre位于5′ UTR[38]。cre是一種莖環(huán)結(jié)構(gòu),在環(huán)結(jié)構(gòu)靠近5′末端的那一半環(huán)序列中具有保守的 AAACA(或 AAACG)基序,AAACA基序可作為將U殘基添加到VPg的模板,從而產(chǎn)生VPg-pUpU,其將作為小RNA病毒合成RNA的引物[39]。Meng等[40]研究發(fā)現(xiàn),SVA的VP2 ORF中存在1個含有AAACA的莖環(huán),且結(jié)構(gòu)上與腦心肌炎病毒的cre高度相似,通過試驗證明此莖環(huán)在功能上與其他小RNA病毒的cre相似。

3C蛋白是一種多功能半胱氨酸蛋白酶,含有半胱氨酸-組氨酸-天冬氨酸催化三聯(lián)體,其與蛋白酶和RNA結(jié)合活性相關(guān)的結(jié)構(gòu)是保守的,有助于病毒多聚蛋白的切割和SVA復(fù)制過程中RNA復(fù)制復(fù)合物的組裝[41]。此外,SVA 3C蛋白對抑制宿主先天免疫至關(guān)重要,可調(diào)節(jié)宿主不同的信號通路和細(xì)胞死亡形式[33,42],抑制先天免疫信號級聯(lián)反應(yīng)[34]和宿主翻譯機(jī)制[43]等多種途徑,進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制。

3D蛋白相對保守,可以與3A、3B和3C蛋白相互作用,調(diào)節(jié)病毒復(fù)制和尿苷?；?。3D蛋白本質(zhì)是病毒的RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),在病毒復(fù)制和mRNA合成中發(fā)揮重要作用[44]。RdRp的保真性較差,缺乏校對活性,使得病毒在復(fù)制過程中較易發(fā)生突變和重組,這反而有助于SVA快速適應(yīng)不斷變化的環(huán)境[45]。功能上,3D蛋白與VPg結(jié)合形成3Dpol-VPg復(fù)合物,促使VPg 尿苷?；纬蒝Pg-pUpU,隨后作為觸發(fā)全長基因組或反義基因組合成的引物[46]。

4 小結(jié)與展望

位于SVA 5′ UTR的IRES和順式作用元件對病毒啟動蛋白翻譯和基因組復(fù)制至關(guān)重要,3′ UTR中的多聚A尾對病毒感染起著關(guān)鍵作用,且其中存在的二級結(jié)構(gòu)對病毒的復(fù)制有“致命”影響。SVA蛋白在病毒增殖過程中的功能不同,結(jié)構(gòu)蛋白除了形成病毒衣殼和保護(hù)病毒基因組免受惡劣環(huán)境的影響外,對粘附和侵襲宿主細(xì)胞也是必不可少的;非結(jié)構(gòu)蛋白參與調(diào)節(jié)病毒復(fù)制,并通過不同途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,抑制宿主的免疫應(yīng)答,還可與其他蛋白協(xié)同調(diào)控信號通路。識別和理解SVA蛋白及其基因組元件的功能對研究病毒的復(fù)制、免疫逃避和致病性的分子機(jī)制十分必要,可為進(jìn)一步了解SVA基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能與病毒感染和發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供理論依據(jù)。

目前,對SVA蛋白及其基因組元件的功能有了初步了解,但仍有許多蛋白的功能仍需進(jìn)一步闡明,例如:(1)系統(tǒng)分析SVA蛋白與宿主細(xì)胞之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以發(fā)現(xiàn)新的信號通路;(2)研究結(jié)構(gòu)蛋白在病毒組裝和釋放中的作用并揭示它們與細(xì)胞膜和囊泡運輸系統(tǒng)的相互作用;(3)解析非結(jié)構(gòu)蛋白的晶體結(jié)構(gòu),特別是2C和3D蛋白,其關(guān)鍵催化基序的鑒定有助于闡明非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的機(jī)制;(4)鑒定SVA的其他受體,已知SVA具有多種組織嗜性,但除了ANTXR1之外,病毒進(jìn)入細(xì)胞的其他受體尚未明確,鑒定SVA感染的靶細(xì)胞和受體對于理解其多組織嗜性至關(guān)重要。這些機(jī)制的闡明將為SVA抗病毒制劑的開發(fā)提供理論支持。