蔣 鑫, 陳重先, 劉夢蘭, 黃丹丹, 李 偉, 繆 穎, 張 玉

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建省植物功能生物學(xué)與綠色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350002)

APETALA2/乙烯反應(yīng)因子(AP2/ERF)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子超家族。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白至少含有1個(gè)高度保守的由60～70個(gè)氨基酸殘基組成的AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中,AP2/ERF家族分為AP2(APETALA2)、RAV(related to ABI3/VP1)、脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(dehydration-responsive element binding protein, DREB)、乙烯響應(yīng)因子(ethylene-responsive factor, ERF)和Soloist 5個(gè)亞家族[1]。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育、葉片衰老過程中具有重要作用[2-3]。葉片衰老是葉片發(fā)育的最后一個(gè)過程,能量物質(zhì)從衰老葉片轉(zhuǎn)移到幼嫩葉片或種子中進(jìn)行重新分配,是植物適應(yīng)環(huán)境的過程。然而,在農(nóng)作物中,葉片早衰或晚衰都會影響產(chǎn)量。研究[4-5]表明,水稻(Oryzasativa)劍葉衰老每推遲1 d即可增產(chǎn)2%,因此,精密控制葉片衰老的起始和進(jìn)程非常重要[3]。轉(zhuǎn)錄組分析揭示葉片衰老的轉(zhuǎn)錄調(diào)控由各種轉(zhuǎn)錄因子執(zhí)行,WRKY、NAC和AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控葉片衰老過程中發(fā)揮著重要作用[6-8]。水稻AP2/ERF家族成員SUB1A(SUBMERGENCE1A)通過調(diào)控植物激素途徑來延緩葉片衰老[9]。水稻乙烯響應(yīng)因子OsERF101與葉片衰老相關(guān)基因OsNAP和OsMYC2的啟動子區(qū)域結(jié)合,激活其表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)葉片衰老[10]。Wei et al[11]研究發(fā)現(xiàn):水稻OsDREB1C通過調(diào)節(jié)光合作用和提高氮素的利用率來提高谷物產(chǎn)量,縮短水稻生育周期;OsDREB1C過表達(dá)系植株產(chǎn)量比野生型植株提高41.3%～68.3%。

目前研究大多關(guān)注AP2/ERF單個(gè)基因的功能分析[12],AP2/ERF被調(diào)控的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到miRNA調(diào)控和組蛋白修飾等多種方式調(diào)控[3,13]。miRNA作為一類非編碼RNA分子,通過介導(dǎo)mRNA降解或沉默目標(biāo)基因的翻譯來抑制基因的表達(dá)。Xu et al[14]對抗早衰和衰老敏感水稻品種的miRNA組及其降解組進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)在水稻葉片衰老早中期,osa-miR172a、osa-miR172c和osa-miR172d在抗早衰品種中的表達(dá)量顯著高于衰老敏感品種,推測osa-miR172可能通過降低AP2類基因的表達(dá)量,延緩葉片衰老進(jìn)程。Wu et al[15]發(fā)現(xiàn)在玉米(Zeamays)葉片衰老后期,zma-miR172c在持綠品種中的表達(dá)量高于早衰品種,zma-miR172c負(fù)調(diào)控其編碼AP2蛋白的靶基因,推測玉米中存在一種miRNA介導(dǎo)的葉片衰老機(jī)制。

組蛋白乙?；揎検且环N重要的表觀調(diào)控方式,它是通過改變?nèi)旧|(zhì)空間狀態(tài)以激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄,在植物葉片衰老過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。在擬南芥中,大多數(shù)葉片衰老上調(diào)基因預(yù)先標(biāo)記了染色質(zhì)激活標(biāo)志H3K4me3和H3K9ac,而染色質(zhì)抑制標(biāo)志H3K27me3的基因在較老的葉片組織中表達(dá)[16-17]。Zhang et al[8]研究發(fā)現(xiàn),H3K9ac水平隨著水稻葉齡的增加而升高,并鑒定出一系列受H3K9ac調(diào)控的葉片衰老基因。擬南芥組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶HAC1通過提高ERF022基因座的H3K9ac富集水平,上調(diào)ERF022轉(zhuǎn)錄表達(dá),促進(jìn)葉片衰老[18]。然而,水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄和表觀調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究在全基因組水平對水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子成員進(jìn)行鑒定,對其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和順式作用元件進(jìn)行分析,并鑒定隨葉齡的增加持續(xù)上調(diào)或下調(diào)的水稻葉片衰老的相關(guān)候選基因。基于small RNA-seq數(shù)據(jù),通過表達(dá)量模式相關(guān)性分析,鑒定呈顯著負(fù)相關(guān)的miRNA-AP2/ERF靶基因?qū)?并進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證?；贑hIP-seq數(shù)據(jù)[8]探究與表達(dá)模式和H3K9ac富集水平呈正相關(guān)的一系列基因,為深入研究水稻AP2/ERF基因家族的功能及其受miRNA和組蛋白修飾調(diào)控的轉(zhuǎn)錄機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻是在人工氣候室培養(yǎng)的日本晴品種(OryzasativaL. cv. Nipponbare),生長條件:溫度28～32 ℃,光照時(shí)間16 h,黑暗時(shí)間8 h。水稻主穗完全從葉鞘中抽出時(shí)取其劍葉作為起始供試材料,每隔7 d取材1次,共6次(0～35 d)。液氮速凍后儲存在-80 ℃,備用。

1.2 水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定及生物信息學(xué)分析

水稻(Oryzasativa)基因組序列和注釋文件來源于Phytozome V 13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/),使用HMMER 3.0軟件(http://hmmer.janelia.org/) 和Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.sanger.ac.uk/)中的AP2隱馬爾科夫模型文件(PF00847)預(yù)測水稻AP2/ERF基因家族成員,并以PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中的擬南芥AP2/ERF蛋白作為檢索序列,利用BLAST工具對候選水稻AP2/ERF家族成員進(jìn)行比對,利用結(jié)構(gòu)域預(yù)測工具NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和SMART(https://smart.embl.de/)驗(yàn)證候選水稻AP2/ERF蛋白是否含有AP2結(jié)構(gòu)域,參數(shù)為默認(rèn)值。通過MEGA 7.0軟件的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,設(shè)置1 000次重復(fù),其他為默認(rèn)參數(shù)。從基因組中提取AP2/ERF基因起始密碼子上游2 000 bp處的序列作為基因啟動子序列,利用PlantCARE在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測順式作用元件。

1.3 水稻葉片衰老過程中AP2/ERF家族基因及其相應(yīng)的miRNAs表達(dá)譜分析

水稻劍葉衰老過程的轉(zhuǎn)錄組和ChIP-seq數(shù)據(jù)見文獻(xiàn)[8],登錄號SRP331485。分別利用TopHat2.0.11[19]和Bowtie[20]軟件將RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)與日本晴水稻參考基因組(MSU_v7.0)進(jìn)行比對。利用edgeR軟件[21]將差異倍數(shù)≥2或≤0.05且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.01的基因定義為差異表達(dá)基因。

1.3.1 靶向水稻AP2/ERF基因miRNA的鑒定 利用同批次水稻劍葉的small RNA-seq數(shù)據(jù)比對參考基因組的reads與miRBase(v22)數(shù)據(jù)庫中的已知miRNA成熟序列及其上游2 nt與下游5 nt的范圍,鑒定已知miRNA。采用miRDeep2軟件[22]預(yù)測新miRNA。利用TargetFinder軟件[23]預(yù)測miRNA的靶基因。使用Cyctoscape軟件探究可視化miRNA與水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因之間的靶標(biāo)關(guān)系。

1.3.2 miRNA與靶基因表達(dá)模式的相關(guān)性分析 使用R語言cor()函數(shù),將水稻劍葉衰老過程中差異表達(dá)的AP2/ERF基因表達(dá)量和miRNA表達(dá)量進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)性分析(Spearman correlation)。miRNA通常負(fù)調(diào)控其靶標(biāo)基因,因此以相關(guān)性<-0.6為標(biāo)準(zhǔn),鑒定出與表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān)的miRNA-靶基因?qū)Α?/p>

1.4 葉片衰老過程中水稻AP2/ERF基因及其相應(yīng)miRNAs表達(dá)的RT-qPCR驗(yàn)證

使用TransZol Up RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司,ET111-01)提取總RNA,再進(jìn)行DNase Ⅰ消化(普洛麥格生物技術(shù)有限公司,美國)。使用Nano Drop 2000 超微量分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司,美國)和2100生物分析儀(安捷倫科技有限公司,美國)檢測總RNA質(zhì)量。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(福建佰孟醫(yī)學(xué)科技有限公司,BM60501S)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)水稻AP2/ERF基因的特異性擴(kuò)增引物。

miRNA提取和反轉(zhuǎn)錄參照miRNA逆轉(zhuǎn)錄專用試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,MR101-01)使用說明書,用帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物將目的miRNA從總RNA中反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄引物由通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列(gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac)和目的miRNA 3′端6～8個(gè)反向互補(bǔ)的堿基組成。miRNA實(shí)時(shí)熒光定量的正向引物由通用序列(GCCGCT)和miRNA 5′端12～16個(gè)堿基組成,反向通用引物由莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的一段堿基序列組成。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR試驗(yàn)參照TansStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司,AQ131-01)說明書,PCR儀為CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司,美國)。以O(shè)sActin(LOC_Os11g06390)為AP2/ERF基因RT-qPCR的內(nèi)參基因,U6為miRNA RT-qPCR的內(nèi)參基因(表1),采用2-ΔΔCT計(jì)算基因表達(dá)量。利用GraphPad Prism 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。使用Studentt檢驗(yàn)方法計(jì)算樣本之間的差異顯著性。所有試驗(yàn)均有3次生物學(xué)重復(fù)、3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析及順式作用元件預(yù)測

共鑒定到155個(gè)水稻AP2/ERF基因,基于序列相似性及AP2結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)將其劃分為AP2、RAV、DREB和ERF 4個(gè)亞家族(圖1)。由圖1可知:21個(gè)基因歸屬于AP2亞家族,該家族具有2個(gè)完整的AP2結(jié)構(gòu)域;4個(gè)基因歸屬于RAV亞家族,該家族具有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域。DREB和ERF亞家族分別有57和73個(gè)成員,都編碼1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域,但是兩個(gè)亞家族AP2結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)保守氨基酸存在差異。在DREB蛋白中,第14個(gè)纈氨酸(V14)和第19個(gè)谷氨酸(E19)保守,而丙氨酸和天冬氨酸在ERF蛋白的相應(yīng)位置保守,這是區(qū)分兩個(gè)亞家族的重要依據(jù)。此外,發(fā)現(xiàn)DREB和ERF亞家族的所有基因在A37位均含有丙氨酸,ERF和DREB亞家族的基因數(shù)量遠(yuǎn)多于其他亞家族。值得注意的是,LOC_Os01g59780、LOC_Os08g34360和LOC_Os06g44750(HL6)雖僅含有一個(gè)完整的AP2結(jié)構(gòu)域,但這些基因與AP2亞家族序列的相似性更高,因此這3個(gè)基因被歸入AP2亞家族。

圖1 水稻AP2/ERF基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of AP2/ERF gene family in rice

為了研究水稻AP2/ERF家族基因可能存在的調(diào)控機(jī)制,對其成員啟動子區(qū)域(-2 kb)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測。水稻AP2/ERF家族基因啟動子區(qū)域共鑒定出19種有功能的順式作用元件,其中:光響應(yīng)元件(G-Box、GT1-motif、GATA-motif、Sp1和TCT-motif)分布最多,每個(gè)AP2/ERF基因均含有1個(gè)或多個(gè)光響應(yīng)元件;脫落酸(abscisic acid,ABA)響應(yīng)元件(ABRE)數(shù)量次之;大多數(shù)基因具有茉莉酸(jasmonic acid,JA)響應(yīng)元件(TGACC-motif和CGTCA-motif)、水楊酸(salicylic acid,SA)響應(yīng)元件(TCA-element)和厭氧誘導(dǎo)順式作用元件(GC-motif)。暗示水稻AP2/ERF基因可能在光響應(yīng),植物衰老,ABA、JA、SA植物激素響應(yīng)以及脅迫響應(yīng)等過程發(fā)揮重要作用。

2.2 水稻AP2/ERF基因在劍葉衰老中的表達(dá)模式

基于完全抽穗后0～35 d 6個(gè)發(fā)育期水稻葉片的RNA-seq數(shù)據(jù)[8],共鑒定到38個(gè)水稻AP2/ERF差異表達(dá)基因(圖2),其中:11個(gè)基因的表達(dá)量較高,且隨著葉片衰老呈上調(diào)趨勢[例如:水稻淀粉調(diào)節(jié)因子RSR1(LOC_Os05g03040)、乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因OsBIERF1(LOC_Os05g03040)和OsBIERF3(LOC_Os02g43790)在葉片6個(gè)發(fā)育期均高量表達(dá)];14個(gè)基因表達(dá)量較低,隨葉片衰老呈上調(diào)趨勢,部分基因在葉片衰老后期出現(xiàn)較高水平表達(dá)(例如:LOC_Os09g28440、LOC_Os08g36920和LOC_Os03g09170表達(dá)量在初期比較低,但隨著葉片衰老表達(dá)量上調(diào);LOC_Os03g08470和LOC_Os07g42510在水稻葉片衰老過程中上調(diào)表達(dá));13個(gè)基因表達(dá)量低,且在水稻葉片衰老過程中下調(diào)表達(dá)[例如:鹽應(yīng)答基因SERF1(LOC_Os05g34730)、LOC_Os11g03540、LOC_Os10g22600、LOC_Os08g34360和LOC_Os09g39850基因在葉片衰老過程中的表達(dá)量呈整體下調(diào)趨勢;LOC_Os11g03540基因隨葉齡的增加持續(xù)下調(diào)表達(dá)]。OsERF101(LOC_Os04g32620)是水稻葉片衰老正向調(diào)控因子[10],結(jié)果顯示OsERF101隨葉齡的增加上調(diào)表達(dá)。在水稻葉片衰老過程中,持續(xù)上調(diào)或者下調(diào)表達(dá),以及與水稻葉片衰老已知基因表達(dá)模式相似的基因,可能在水稻葉片衰老中起重要作用,其功能有待進(jìn)一步研究。

t表示完全抽穗后的時(shí)間。

2.3 水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的miRNAs靶位點(diǎn)預(yù)測

結(jié)果(圖3)顯示,共預(yù)測到58個(gè)AP2/ERF基因受45個(gè)miRNAs調(diào)控,其中:LOC_Os02g13710受到10個(gè)miRNAs調(diào)控;不確定性小穗基因OsIDS1(LOC_Os03g60430)受到6個(gè)miRNAs調(diào)控;LOC_Os04g43220受到5個(gè)miRNAs調(diào)控;落粒性基因OsSNB(LOC_Os07g13170)、SHAT1(LOC_Os04g55560),淀粉調(diào)節(jié)因子RSR1、LOC_Os11g03540、LOC_Os12g03290受到了4個(gè)miRNAs調(diào)控;LOC_Os02g42585和LOC_Os11g06770受到3個(gè)miRNAs調(diào)控;LOC_Os03g60120、LOC_Os04g32790、LOC_Os02g51670、LOC_Os06g11860、BBM2(LOC_Os02g40070)、LOC_Os06g42990和LOC_Os12g41060,以及 乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子OsERF1(LOC_Os04g46220)和BBM4(LOC_Os04g42570)受到2個(gè)miRNAs調(diào)控;剩余39個(gè)AP2/ERF基因受到1個(gè)miRNA調(diào)控。

藍(lán)色多邊形代表AP2/ERF基因,紅色三角形代表miRNAs。

2.4 水稻劍葉衰老過程中靶向水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的miRNAs表達(dá)譜及RT-qPCR分析

為了明確靶向差異表達(dá)AP2/ERF基因的miRNA在劍葉衰老中的表達(dá)特征,對17個(gè)差異表達(dá)的AP2/ERF家族成員對應(yīng)的18個(gè)miRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果(圖4)顯示:在水稻劍葉衰老進(jìn)程中有5個(gè)miRNAs持續(xù)上調(diào)表達(dá),包括osa-miR1846c-5p、osa-miR2096-5p、osa-miR1848、osa-miR1846a-5p和osa-miR1846b-5p;有10個(gè)miRNAs持續(xù)下調(diào)表達(dá),包括osa-miR5809、osa-miR396e-5p、osa-miR396d、osa-miR396g、osa-miR396h、osa-miR172c、osa-miR172a、osa-miR172d-3p、osa-miR171e-5p和osa-miR172b。由此推測在葉片生長過程中持續(xù)上(下)調(diào)的miRNAs可能在葉片衰老過程中起到重要的調(diào)控作用。

t表示完全抽穗后的時(shí)間。

對具有顯著負(fù)相關(guān)的miRNA-靶基因?qū)M(jìn)行RT-qPCR共表達(dá)分析,結(jié)果表明:在水稻葉片衰老過程中,3個(gè)水稻AP2/ERF基因在抽穗后第7天表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào);而靶向這3個(gè)基因的osa-miR172b、osa-miR172d-3p和novel_miR_348的表達(dá)量都呈下降趨勢。與葉片衰老相關(guān)的novel_miR_348與LOC_Os02g51670呈顯著負(fù)相關(guān), 相關(guān)系數(shù)(R)=-0.608 5(圖5A);在水稻劍葉衰老期,osa-miR172b和osa-miR172d-3p與SHAT1呈負(fù)相關(guān),R分別為-0.534 4和-0.791 0(圖5B、5C);osa-miR172b與OsIDS1呈負(fù)相關(guān),R=-0.465 7(圖5D)。上述結(jié)果進(jìn)一步表明,水稻miRNAs對其靶向的AP2/ERF基因有負(fù)調(diào)控作用。

t表示完全抽穗后的時(shí)間,*、**與***分別代表與試驗(yàn)起始的差異顯著(P<0.05、P<0.01與P<0.001)。

2.5 水稻葉片衰老過程中受組蛋白乙酰化修飾調(diào)控的AP2/ERF基因的表達(dá)分析

ChIP-seq IGV可視化結(jié)果顯示:OsBIERF3基因座H3K9ac的富集水平從第7天開始提高,在第35天達(dá)到最高值(圖6A);該基因的表達(dá)量隨著水稻葉片的衰老而增加,在第35天達(dá)到峰值(圖6B),其H3K9ac富集水平和基因表達(dá)量的變化趨勢一致。OsEBP89的H3K9ac富集水平隨著水稻葉片的衰老持續(xù)升高,在第35天達(dá)到最高值(圖6C),其基因表達(dá)量也隨葉齡的增加持續(xù)上調(diào)(圖6D)。OsERF101的H3K9ac富集水平在水稻葉片衰老過程中持續(xù)升高,第35天顯著升高(圖6E),其表達(dá)量在第14天顯著上調(diào),第35天達(dá)到峰值(圖6F)。LOC_Os01g66270基因座的H3K9ac富集水平在第21天和第35天升高(圖6G),其基因表達(dá)水平在相同時(shí)期也更高(圖6H)。表明OsBIERF3、OsEBP89、OsERF101和LOC_Os01g66270的H3K9ac富集水平和表達(dá)模式呈正相關(guān),這4個(gè)AP2/ERF基因可能通過H3K9ac修飾來調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而參與調(diào)控水稻葉片的衰老過程。

3 討論與小結(jié)

3.1 水稻AP2/ERF基因家族協(xié)同調(diào)控植物生長發(fā)育和葉片衰老

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中廣泛分布,是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子超家族,含有AP2結(jié)構(gòu)域,高度保守,具有DNA結(jié)合功能,并能參與調(diào)控花發(fā)育、果實(shí)成熟、衰老等植物生長發(fā)育進(jìn)程和應(yīng)對脅迫反應(yīng)[3,24-25]。順式作用元件分析結(jié)果顯示,該家族所有AP2/ERF基因的啟動子均含有光響應(yīng)元件,大多數(shù)基因具有ABA、JA和SA等植物激素和脅迫響應(yīng)順式作用元件,說明該家族成員可能在調(diào)控光響應(yīng)、植物衰老、植物激素響應(yīng)及脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。OsERF101參與茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),激活與葉綠素降解和JA信號介導(dǎo)的葉片衰老相關(guān)基因的表達(dá),加速水稻葉片的衰老[10]。OsEREBP1過表達(dá)會激活JA和ABA合成通路相關(guān)基因以及防衛(wèi)反應(yīng)信號,減輕白葉枯病害,提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱性和耐淹性[26]。本研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)已知的水稻葉片衰老基因OsERF101和OsEREBP1的啟動子區(qū)存在多個(gè)光響應(yīng)元件和JA、ABA植物激素響應(yīng)順式作用元件,這與其功能相一致。OsERF101和OsEREBP1隨水稻葉片的衰老持續(xù)上調(diào)表達(dá),在劍葉衰老后期表達(dá)量增大。LOC_Os03g08460、LOC_Os07g42510、落粒性基因SHAT1和LOC_Os10g41330基因在葉片衰老過程中整體上呈上調(diào)表達(dá),乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因OsBIERF3、LOC_Os02g54050和LOC_Os01g66270與兩個(gè)已知的AP2/ERF葉片衰老基因的表達(dá)模式相似。同時(shí),這7個(gè)基因含有多個(gè)光響應(yīng)和ABA響應(yīng)元件。因此,本研究鑒定出的7個(gè)基因可能是重要的候選水稻葉片衰老基因。

3.2 水稻AP2/ERF基因通過miRNA和組蛋白H3K9ac修飾來調(diào)控水稻葉片的衰老過程

miRNA通過抑制基因翻譯或降解靶基因mRNA調(diào)節(jié)AP2/ERF基因的表達(dá),參與植物葉片衰老進(jìn)程的調(diào)控[14]。osa-miR172a、osa-miR172c和osa-miR172d-3p在水稻抗早衰品種中的表達(dá)量顯著高于衰老敏感品種;zma-miR172c在玉米持綠品種中的表達(dá)量高于早衰品種,說明miR172可能通過降低AP2類基因的表達(dá)量,延緩抗早衰品種植株葉片的衰老進(jìn)程[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)osa-miR172a、osa-miR172c和osa-miR172d-3p在水稻葉片衰老早期的表達(dá)量最高,隨著葉齡的增加持續(xù)下調(diào),與前人研究結(jié)果[14-15]一致。表明osa-miR172a、osa-miR172c和osa-miR172d-3p通過調(diào)控AP2/ERF基因參與調(diào)控水稻葉片的衰老過程。

Xu et al[14]發(fā)現(xiàn)6個(gè)miRNAs家族osa-miR159、osa-miR160、osa-miR164、osa-miR167、osa-miR172和osa-miR1848通過靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子參與植物激素對葉片衰老過程的調(diào)控。本研究還發(fā)現(xiàn)一些新的miRNAs可能與葉片衰老有關(guān),例如:持續(xù)上調(diào)的osa-miR1846c-5p、osa-miR2096-5p、osa-miR1846a-5p和osa-miR1846b-5p,以及持續(xù)下調(diào)的osa-miR5809、osa-miR396e-5p、osa-miR396d、osa-miR396g、osa-miR396h和osa-miR171e-5p。通過對miRNA-靶基因?qū)Φ腞T-qPCR共表達(dá)分析,進(jìn)一步驗(yàn)證水稻miRNAs與其靶向的AP2/ERF基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān),證實(shí)LOC_Os02g51670、落粒性基因SHAT1和不確定性小穗基因OsIDS1受到noval-miR348、osa-miR172b和osa-miR172d-3p的調(diào)控。本研究篩選出顯著負(fù)相關(guān)的miRNA-靶基因?qū)?為進(jìn)一步研究水稻AP2/ERF基因在葉片衰老中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

研究[8]發(fā)現(xiàn),大多數(shù)NAC、WRKY和AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在葉片衰老過程中伴隨著H3K9ac標(biāo)記和mRNA水平的提升。本研究基于ChIP-seq數(shù)據(jù)通過RT-qPCR分析,驗(yàn)證了4個(gè)在葉片衰老過程中受組蛋白乙?；揎椪{(diào)控的AP2/ERF基因的表達(dá)模式和H3K9ac模式的相似性,包括乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因OsBIERF3、OsEBP89和水稻葉片衰老已知基因OsERF101、LOC_Os01g66270。結(jié)果顯示其基因表達(dá)量和H3K9ac富集水平在劍葉衰老過程中都呈上調(diào)趨勢,推測這4個(gè)基因可能通過H3K9ac富集促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而參與調(diào)控葉片的衰老進(jìn)程。本研究鑒定了水稻AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員和相應(yīng)的miRNAs,發(fā)現(xiàn)了一系列在水稻葉片衰老過程中呈顯著負(fù)相關(guān)的miRNA-AP2/ERF靶基因?qū)?并驗(yàn)證了組蛋白H3K9ac修飾與基因表達(dá)模式的正相關(guān)性。