萬露露, 王中煊, 沈 軍, 曹澤宇, 陳世品, 蘇小青

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)蘭科植物保護(hù)與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建 福州 350002)

轉(zhuǎn)錄因子一般由4個(gè)區(qū)域,包括DNA結(jié)合基序、轉(zhuǎn)錄激活基序、核定位信號(hào)和寡聚化位點(diǎn),共同調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過程。根據(jù)蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域的不同,可以分為不同的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]。堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中存在的成員最多、最保守的基因家族之一。bZIP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域由堿性氨基酸區(qū)域(basic amino acid region,BR)和亮氨酸拉鏈區(qū)(leucine zipper area,LZ)組成。堿性氨基酸區(qū)域(N-X7-R/K-X9)位于C端,是嚴(yán)格保守的基本DNA結(jié)合區(qū),與DNA啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)特定的序列結(jié)合;亮氨酸拉鏈區(qū)(L-X6-L-X6-L)位于N端,是由亮氨酸或異亮氨酸、纈氨酸組成的七肽重復(fù)序列,形成同源二聚體。植物的bZIP蛋白與ACGT核心順式作用元件如ABRE、G-box、C-box、a-box、AACGTT、GCN4基序的DNA序列結(jié)合,調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá),從而參與包括鹽、干旱、水澇等多種非生物脅迫響應(yīng)過程[2]。目前,已有許多真核生物的bZIP基因家族在全基因組范圍內(nèi)被成功鑒定,在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄(Solanumlycopersicum)、水稻(Oryzasativa)、葡萄(Vitisvinifera)、大豆(Glycinemax)中分別發(fā)現(xiàn)75、69、89、55、131個(gè)bZIP家族成員[1]。研究表明,該轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與非生物脅迫響應(yīng)。例如,在鹽脅迫下,擬南芥AtbZIP17能直接或間接調(diào)控鹽脅迫應(yīng)答基因,從而參與鹽信號(hào)反應(yīng)[3]。在干旱脅迫下,水稻OsbZIP12和OsbZIP46受脫落酸(abscisic acid,ABA)信號(hào)強(qiáng)誘導(dǎo)[4]。而番茄bZIP中的轉(zhuǎn)錄因子SIAREB既參與干旱反應(yīng),又對(duì)鹽脅迫反應(yīng)起作用[1]。在冷脅迫下,水稻OsbZIP52在冷反應(yīng)中表達(dá)量降低,起到了負(fù)調(diào)控作用;大豆GmbZIP1在寒冷、干旱和鹽脅迫下,表達(dá)量增高,使得植物的耐受性增強(qiáng)[5]。因此,bZIP在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中起重要作用。

閩楠(Phoebebournei)是樟科楠屬的常綠高大喬木,其木材芳香耐久,質(zhì)地細(xì)膩,強(qiáng)抗腐蝕,用途廣泛且具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。閩楠生長(zhǎng)較為緩慢,根系的發(fā)育對(duì)于其生長(zhǎng)尤為重要。本研究通過對(duì)閩楠bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因及蛋白理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行系統(tǒng)分析,結(jié)合不同程度水分脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),以及qRT-PCR驗(yàn)證試驗(yàn),探究該家族成員在水分脅迫下的表達(dá)情況,旨在為進(jìn)一步探究閩楠根系抵御逆境脅迫因子的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 bZIP基因家族成員鑒定

從Pfam網(wǎng)站(https://pfam.xfam.org/)下載閩楠PbbZIP(PhoebebourneibZIP)基因家族的HMM模型文件(PF00170、PF07716、PF03131和PF12498)。同時(shí),從TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥bZIP基因家族的蛋白序列。接著,使用HMMER軟件從閩楠蛋白序列中檢索bZIP蛋白,并以擬南芥bZIP蛋白序列為索引在閩楠蛋白文件中進(jìn)行blast分析(E<1e-5)。對(duì)HMM與blast兩種方法鑒定出的蛋白序列取交集,然后使用MEME(https://meme-suite.org/)、CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)進(jìn)一步驗(yàn)證序列是否含有bZIP的保守結(jié)構(gòu)域。最后,使用在線工具ExPASy(https://www.expasy.org/)分析蛋白理化性質(zhì),使用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

對(duì)擬南芥的bZIP蛋白序列使用MEGA11軟件(https://megasoftware.net/)中CLustalX程序默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行多序列比對(duì),采用鄰近法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。參數(shù)設(shè)定為1 000 bootstrap、p-distance模型和pairwise deletion。然后將其保存為Newick格式,并使用evolview(https://www.evolgenius.info/)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用MEME軟件對(duì)PbbZIP蛋白序列進(jìn)行20個(gè)motif分析,再使用TBtools軟件的gene structure view(advanced)功能進(jìn)行進(jìn)化樹、保守基序和基因結(jié)構(gòu)三合一可視化。將PbbZIP蛋白作為研究對(duì)象,選定模式植物擬南芥作為物種參數(shù),在STRING(https://cn.string-db.org/)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。然后使用TBtools提取PbbZIP基因轉(zhuǎn)錄起始上游2 000 bp的序列作為基因的啟動(dòng)子,使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)其順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。最后,對(duì)結(jié)果進(jìn)行整理,使用TBtools軟件繪制熱圖。

1.4 基因表達(dá)分析

試驗(yàn)材料從福建省林業(yè)科學(xué)研究院移植到福建農(nóng)林大學(xué)下安圖書館旁大棚內(nèi),選取3年生健康閩楠幼苗300株(均為優(yōu)良家系),經(jīng)過半年的緩苗期后,在2021年7月29日至2021年8月25日期間進(jìn)行干旱和水澇處理。干旱處理分別進(jìn)行了0、3、6、9 d,復(fù)水后第3天采集根樣本。水澇處理分別進(jìn)行了0、7、14、21、28 d,對(duì)根系和植株進(jìn)行取樣。所有樣品均保存在-80 ℃冰箱內(nèi)。隨后,由深圳華大基因科技有限公司采用基于第2代測(cè)序技術(shù)的Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲取PbbZIP的表達(dá)豐度值FPKM(fragments per kilobase per million),并通過log2(FPKM+1)計(jì)算表達(dá)差異程度。最后,使用TBtools軟件繪制基因表達(dá)量熱圖。

1.5 RNA提取、cDNA合成以及qRT-PCR驗(yàn)證

閩楠根系7個(gè)時(shí)期(干旱脅迫下處理0、3、6、9 d及復(fù)水后第3天, 水澇脅迫下處理7、14 d)的樣品各稱取0.1～0.2 g,在液氮中快速研磨,使用天根試劑盒提取閩楠根部總RNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性,并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度,合格的RNA用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用TAKARA試劑盒合成cDNA,并將所得的cDNA標(biāo)本儲(chǔ)存在-20 ℃的冰箱內(nèi)。選用RG6(maker00023565)作為內(nèi)參基因[6]。挑選PbbZIP15(maker00019047)和PbbZIP40(maker00043020)基因做qRT-PCR驗(yàn)證(表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 bZIP基因家族鑒定與理化性質(zhì)

在閩楠全基因組數(shù)據(jù)中共鑒定52個(gè)bZIP基因,分別命名為PbbZIP01-PbbZIP52。這些PbbZIP基因編碼的氨基酸數(shù)量差異較顯著,范圍從133個(gè)(PbbZIP43)到839個(gè)(PbbZIP15),平均蛋白長(zhǎng)度為336個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量15 275.22 u(PbbZIP43)～88 925.04 u(PbbZIP15),理論等電點(diǎn)4.78(PbbZIP40)～11.45(PbbZIP12)。在這52個(gè)成員中,19個(gè)蛋白為堿性蛋白,其余為酸性蛋白。所有蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40,因此均為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為47.35(PbbZIP38)～94.87(PbbZIP12)。親水性-0.964(PbbZIP21)～-0.391(PbbZIP01),均為親水蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明:有50個(gè)基因被定位在細(xì)胞核中,僅1個(gè)(PbbZIP20)定位在細(xì)胞質(zhì)中,1個(gè)(PbbZIP30)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(表2)。

表2 PbbZIP蛋白理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of PbbZIP protein

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

構(gòu)建閩楠(52個(gè))與擬南芥(75個(gè))之間bZIP基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(圖1),基于前人在擬南芥中75個(gè)AtbZIP成員分類關(guān)系的研究[7],將閩楠與擬南芥聚類,52個(gè)PbbZIP被分為10個(gè)亞家族(A-I, K和S),分別為A(8)、B(1)、C(4)、D(8)、E(2)、F(2)、G(5)、H(3)、I(10)、K(1)、S(8)。其中,I組的數(shù)量最多,A組、D組和S組的數(shù)量次之,B組和K組僅含有1個(gè)基因。進(jìn)化樹顯示閩楠和擬南芥基因在各個(gè)分支分布均勻,表明它們具有相似的進(jìn)化方式。在擬南芥種子發(fā)育后期,A組基因成員大多在ABA或應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)中起作用;D組基因成員參與抵御病原體和發(fā)育兩個(gè)不同過程,如AtbZIP46參與調(diào)控?cái)M南芥的花器官數(shù)量;G組成員主要與光響應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控有關(guān),也可能在種子成熟過程中發(fā)揮作用;H組成員較少,主要參與光形態(tài)建成;I組成員可能在韌皮部和維管組織中發(fā)揮作用;S組成員廣泛參與寒冷、干旱脅迫等響應(yīng)機(jī)制;其他組成員的主要功能還有待進(jìn)一步探究[1,3-4,8]。

PbbZIP01、11、20、24、34、36、41、47歸為A族;PbbZIP15歸為B族;PbbZIP33、37、50、52歸為C族;PbbZIP02、04、05、09、14、17、23、44 歸為D族;PbbZIP38、46歸為E族;PbbZIP29、31歸為F族;PbbZIP07、10、13、21、25歸為G族;PbbZIP03、18、22歸為H族; PbbZIP06、08、16、19、28、30、32、42、45、61歸為I族;PbbZIP40歸為K族;PbbZIP12、26、27、39、43、48、49、51歸為S族。 在內(nèi)圈里綠色三角形代表閩楠,紅色五角星代表擬南芥。

2.3 保守基序及基因結(jié)構(gòu)

利用TBtools軟件對(duì)52個(gè)PbbZIP基因的系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結(jié)構(gòu)和保守基序進(jìn)行分析。結(jié)果表明,同一分支或同一亞科具有相同的基序和基因結(jié)構(gòu)。所有成員均含有Motif1,表明Motif1對(duì)應(yīng)典型的堿性氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。PbbZIP的外顯子數(shù)為1～10個(gè)。PbbZIP05的外顯子最多(10個(gè)),PbbZIP32、PbbZIP29以及S亞家族的成員中外顯子數(shù)都只有1個(gè)。S組成員無內(nèi)含子,這表明PbbZIP基因功能具有多樣性。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明,PbbZIP轉(zhuǎn)錄因子之間具有緊密的聯(lián)系,PbbZIP49、PbbZIP22、PbbZIP10處于互作網(wǎng)絡(luò)的中心,是聯(lián)系各個(gè)蛋白的關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)。這些關(guān)鍵的PbbZIP轉(zhuǎn)錄因子主要與ABI3(abscisic acid insensitive 3)、氣孔調(diào)節(jié)因子1(stomatal opening factor 1, OST1)、病程相關(guān)基因非表達(dá)子1(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1, NPR1)、BBX21(B-box基因家族成員,B-box21)、COP1(constitutive photomorphogenic 1)相互作用。ABI3是擬南芥ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,參與植物的多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程。OST1屬于植物特有的SnRK2激酶家族,對(duì)于非生物的逆境響應(yīng)有著重要作用。NPR1參與多個(gè)抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)植物整體的抗病性。BBX21是一種B-box鋅指轉(zhuǎn)錄因子,能夠促進(jìn)植物光形態(tài)建成。COP1屬于保守的RING 型E3泛素連接酶,參與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物節(jié)律等過程。這些蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子相互作用,在閩楠根系的水分脅迫響應(yīng)中起到了關(guān)鍵作用。

2.5 啟動(dòng)子順式調(diào)控元件

對(duì)52個(gè)PbbZIP基因上游的2 000個(gè)堿基對(duì)的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了啟動(dòng)子元件的鑒定,共鑒定出36種順式元件,其功能注釋分為光響應(yīng)(15種)、植物生長(zhǎng)(4種)、脅迫響應(yīng)(4種)、激素反應(yīng)元件(9種)和其他(3種)。在PbbZIP的啟動(dòng)子區(qū)域共鑒定出413個(gè)光響應(yīng)元件,G-box元件最多(112個(gè)),其中,PbbZIP10有10個(gè)。鑒定出69個(gè)植物生長(zhǎng)響應(yīng)因子,CAT-box元件最多(27個(gè))。鑒定出230個(gè)脅迫響應(yīng)元件,其中包含129個(gè)用于厭氧誘導(dǎo)(119個(gè)ARE和10個(gè)GC-motif),22個(gè)參與防御和壓力反應(yīng)的順式作用元件(TC-rich repeats),41個(gè)干旱脅迫響應(yīng)元件(MBS),38個(gè)低溫響應(yīng)元件(LTR)。此外,還鑒定出328個(gè)植物激素反應(yīng)元件,如105個(gè)參與ABA反應(yīng)的元件(ABRE),98個(gè)參與茉莉酸甲酯反應(yīng)的元件(TGACG-motif有48個(gè),CGTCA-motif有50個(gè)),51個(gè)赤霉素反應(yīng)元件(22個(gè)P-box、16個(gè)GARE-motif和13個(gè)TATC-box),48個(gè)水楊酸反應(yīng)相關(guān)元件(TCA-element)和23個(gè)生長(zhǎng)素相關(guān)元件(11個(gè)TGA-element和12個(gè)AuxRR-core)。其他元件共鑒定出43個(gè)(15個(gè)A-box、20個(gè)CCAAT-box、8個(gè)AT-rich element)。表明PbbZIP基因不僅在光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)中起作用,對(duì)于閩楠的生長(zhǎng)發(fā)育也至關(guān)重要。

2.6 水分脅迫下的表達(dá)

在不同的水分脅迫條件下,閩楠根系中的bZIP基因家族的表達(dá)模式呈現(xiàn)出明顯的變化(圖2)。在干旱脅迫下的D1時(shí)期,PbbZIP14、PbbZIP17、PbbZIP24、PbbZIP50、PbbZIP36、PbbZIP15、PbbZIP40、PbbZIP08、PbbZIP32的表達(dá)量較高;D2時(shí)期,PbbZIP14、PbbZIP17、PbbZIP24、PbbZIP36、PbbZIP15、PbbZIP40、PbbZIP08的表達(dá)量較高;D3時(shí)期,PbbZIP14、PbbZIP17、PbbZIP24、PbbZIP49、PbbZIP15、PbbZIP40的表達(dá)量較高;D4時(shí)期,PbbZIP17、PbbZIP15、PbbZIP40的表達(dá)量較高。而在水澇脅迫下,大部分基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)模式,但也有少數(shù)基因的表達(dá)量較高,例如W1時(shí)期的PbbZIP14、PbbZIP21、PbbZIP33、PbbZIP49、PbbZIP15基因和W2時(shí)期的PbbZIP21、PbbZIP33、PbbZIP39、PbbZIP49、PbbZIP15基因。因此,在干旱脅迫下應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注PbbZIP17、PbbZIP15、PbbZIP40基因;在水澇脅迫下應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注PbbZIP15基因。在整個(gè)水分脅迫過程中,PbbZIP15基因均保持較高的表達(dá)量。

D1:干旱3 d;D2:干旱6 d;D3:干旱9 d;D4:復(fù)水后3 d; W1:水澇7 d;W2:水澇14 d。

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證

挑選2個(gè)有代表性的基因(PbbZIP15和PbbZIP40),利用qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證基因的表達(dá)水平。結(jié)果(圖3)表明:PbbZIP15在干旱和水澇的脅迫下均有較高的表達(dá)量;而PbbZIP40在干旱脅迫下的表達(dá)量較高。qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了這2個(gè)基因在閩楠根系水分脅迫條件下的相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì),與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的FPKM表達(dá)模式一致。這表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的。

D1:干旱3 d;D2:干旱6 d;D3:干旱9 d;D4:復(fù)水后3 d;W1:水澇7 d;W2:水澇14 d。

3 討論與結(jié)論

閩楠全基因組的測(cè)序已經(jīng)完成[9],但目前關(guān)于閩楠基因家族的研究較少,僅有TPS、PLR、NF-Y和WRKY基因家族有相關(guān)報(bào)道[10-13]。本研究利用生物信息學(xué)方法,基于閩楠全基因組數(shù)據(jù),共鑒定出了52個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子,鑒定出的基因數(shù)量與其他的木本植物不同。在油桐(Verniciafordii)、白燁(Betulapendula)、銀杏(Ginkgobiloba)、楊樹(Populus)中分別鑒定出50、47、40、86個(gè)[14-16]。表明閩楠與其他植物之間的差異。

在閩楠中鑒定出的52個(gè)PbbZIP基因被劃分為10個(gè)亞家族,這些基因在系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于同一亞科,基因關(guān)系相對(duì)保守,與擬南芥的劃分一致[7]。同類的亞家族基因成員也具有相似的功能。擬南芥中的一些bZIP基因家族成員已經(jīng)被證實(shí)在干旱、高鹽脅迫下發(fā)揮重要作用[17-18],因此可以推測(cè)閩楠中同類的基因可能具有相似的功能。D組成員主要在抵抗病原體和植物發(fā)育中起作用。S組中的基因在蔗糖代謝中起作用,在花的特定部位特異性表達(dá),在脅迫處理下,bZIP同源基因也能被激活轉(zhuǎn)錄。因此可以推測(cè)閩楠中的直系同源基因也可能參與相似的調(diào)控途徑。閩楠bZIP基因家族序列長(zhǎng)度差異顯著,在同一個(gè)組內(nèi)長(zhǎng)度相對(duì)保守。內(nèi)含子與外顯子個(gè)數(shù)均有差異,結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜性,存在沒有內(nèi)含子的bZIP基因,在其他植物中也發(fā)現(xiàn)有同樣的情況[19]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明,PbbZIP與OST1、NPR1、ABI3等互作,暗示其共同參與根系的水分脅迫響應(yīng)。研究表明,植物bZIP基因家族可與ABRE元件、G-box元件結(jié)合,通過ABRE表達(dá)的基因受bZIP類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[8]。如在擬南芥中部分bZIP轉(zhuǎn)錄因子可與ABRE元件結(jié)合,激活A(yù)BRE元件驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá),提高對(duì)于各種非生物脅迫的抗性。本試驗(yàn)在閩楠中也鑒定出大量的ABRE元件和G-box元件,推測(cè)PbbZIP轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動(dòng)子區(qū)域的G-box元件結(jié)合,調(diào)控目的基因的表達(dá)。

PbbZIP基因在6個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)量熱圖表明,在水分脅迫下,大部分基因隨著干旱或水澇天數(shù)的增加,表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。但仍有基因在水分脅迫下表現(xiàn)出一定的抗性。例如,PbbZIP40基因在干旱脅迫下表達(dá)量較高,說明它可能是重要的抗旱基因。從系統(tǒng)發(fā)育樹可知AtbZIP60與PbbZIP40在同一分支上,屬于K組。在其他植物中,K組基因的數(shù)量也相對(duì)較少,這表明K組基因可能在植物的抗逆境過程中發(fā)揮著重要的作用[18,20]。此外,PbbZIP15在干旱和水澇脅迫下均表現(xiàn)出較高的表達(dá)量,表明它在閩楠根系水分脅迫中也可能是一個(gè)重要的抗性基因。在棗的研究中,ZjbZIP11已被證實(shí)是抗性基因[18],PbbZIP15與ZjbZIP11屬于同源基因,因此推測(cè)PbbZIP15也可能具有類似的功能。在蘿卜的研究中,RsbZIP059基因同屬B組基因,該基因被證實(shí)在蘿卜主根的熱脅迫和鹽脅迫響應(yīng)中起關(guān)鍵作用[20]。因此,推測(cè)bZIP的B組基因在果實(shí)發(fā)育以及外界非生物脅迫中具有重要的調(diào)控作用。

本研究首次基于全基因組數(shù)據(jù)對(duì)閩楠的bZIP基因家族進(jìn)行了篩選與分析,探究了該基因家族在水分脅迫下的響應(yīng)機(jī)制,同時(shí)篩選出了2個(gè)重要的抗性基因。這可為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。