程 序 楊忖卿 龐 博 谷 春 侯雪筠 費(fèi)佳欣 吳 敏 李 軍 劉貴建

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心血管科，北京 100053）

近年來(lái)，隨著居民生活水平的提高和生活方式的改變，代謝危險(xiǎn)因素已成為心血管疾病發(fā)病率逐年上升的重要原因。有學(xué)者采用全球疾病負(fù)擔(dān)研究方法框架分析1990—2019年全球缺血性心臟病疾病負(fù)擔(dān)和15個(gè)相關(guān)的一般危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，代謝危險(xiǎn)因素，尤其是高體重指數(shù)（body mass index，BMI）已成為缺血性心臟病的主要驅(qū)動(dòng)因素[1]。相關(guān)研究已證實(shí)肥胖和嗜酸性粒細(xì)胞增多存在聯(lián)系，較高的BMI與血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加有關(guān)[2]。然而，對(duì)肥胖患者嗜酸性粒細(xì)胞活性表達(dá)情況的研究較少，相關(guān)研究一般通過(guò)嗜酸性粒細(xì)胞的總數(shù)和成熟、黏附、趨化等能力評(píng)價(jià)嗜酸性粒細(xì)胞的功能。本研究擬通過(guò)觀察肥胖患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞激活的細(xì)胞表面標(biāo)志和黏附配體表達(dá)情況，評(píng)價(jià)嗜酸性粒細(xì)胞的免疫功能及其與肥胖的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021年6—9月中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院體檢者41名，年齡>40歲。根據(jù)BMI，分為肥胖組（21名，BMI≥30 kg/m2）和對(duì)照組（20名，18.5 kg/m2

1.2 主要儀器和試劑

日本Sysmex公司XN-3000全自動(dòng)血液分析儀，美國(guó)Beckman Coulter公司AU-5821全自動(dòng)生化分析儀和DxFlex流式細(xì)胞儀，美國(guó)BioTeck公司酶標(biāo)儀，上海碧云天公司紅細(xì)胞裂解液。KO標(biāo)記的CD45（CD45-KO）、PB標(biāo)記的CD16（CD16-Pacific Blue）購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；PERCP-CY5.5標(biāo)記的CCR3（CD193）（CCR3 PERCP-CY5.5）、APC標(biāo)記的CD63（CD63 APC）、APC-CY7標(biāo)記的CD62L（CD62L APC-CY7）購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。人嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP）試劑盒購(gòu)自武漢華美生物公司，檢測(cè)原理為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

1.3 方法

1.3.1 資料收集和樣本采集、處理

收集所有研究對(duì)象的一般資料和血常規(guī)、生化檢測(cè)結(jié)果。采集所有研究對(duì)象靜脈血5 mL，2 mL乙二胺四乙酸抗凝，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；3 mL離心后分離血清，用于檢測(cè)ECP。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞活性

取乙二胺四乙酸抗凝全血50 μL于流式管中，依次加入CD45、CD16、CCR3、CD63、CD62L抗體各2 μL，室溫避光孵育15 min ，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞8 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，采用DxFlex流式細(xì)胞儀檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞CD62L、CD63和中性粒細(xì)胞CD62L表達(dá)情況。利用前向散射光高度和面積（記為FSC-H/FSC-A）去除黏連細(xì)胞后，用側(cè)向散射光面積和前向散射光面積（記為SSC-A/FSC-A）去除細(xì)胞碎片；根據(jù)側(cè)向散射光面積和CD45表達(dá)情況（記為CD45/SSC）劃分單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞[3-4]；在粒細(xì)胞中，根據(jù)CD193（CCR3）和CD16表達(dá)情況清楚劃分嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[5-6]；在嗜酸性粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞中，利用CD62L和CD63熒光強(qiáng)度值表示二者表達(dá)情況。

1.3.3 ELISA檢測(cè)血清ECP表達(dá)采用ELISA檢測(cè)血清ECP水平，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行繪圖。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例/率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman或Pearson相關(guān)分析評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD62L、CD63表達(dá)情況

CD45+/SSChi/CD193+/CD16-鑒定為嗜酸性粒細(xì)胞，CD45+/SSChi/CD193-/CD16+鑒定為中性粒細(xì)胞，利用CD62L和CD63熒光強(qiáng)度值表示二者表達(dá)情況。見(jiàn)圖1。

圖1 嗜酸性粒細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果

2.2 肥胖組和對(duì)照組一般資料比較

肥胖組21例患者中，有17例為中度肥胖（BMI<35 kg/m2）。肥胖組與對(duì)照組性別、年齡和其他（血常規(guī)和生化檢測(cè)）相關(guān)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 肥胖組和對(duì)照組間一般資料比較

2.3 肥胖組和對(duì)照組嗜酸性粒細(xì)胞CD62L和CD63水平比較

肥胖組外周血嗜酸性粒細(xì)胞的CD62L水平[16 425（12 916，27 741）]顯著低于對(duì)照組[46 489（40 753，57 476）]（P<0.05）；CD62L與BMI呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.332，P=0.034）；CD63水平（33 838±14 696）顯著高于對(duì)照組（27 207±8 374）（P<0.01）；中性粒細(xì)胞CD62L水平（28 332±15 672）顯著低于對(duì)照組（42 186±16 853）（P<0.01）。肥胖組血清ECP水平[（17.3±10.8）ng/mL]稍高于對(duì)照組[（16.7±6.2）ng/mL]，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 肥胖組和對(duì)照組外周血嗜酸性粒細(xì)胞CD62L、CD63、ECP和中性粒細(xì)胞CD62L的表達(dá)比較

3 討論

嗜酸性粒細(xì)胞在過(guò)敏性炎癥和宿主防御蠕蟲感染中起重要作用，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)了其作為脂肪組織穩(wěn)態(tài)的主要參與者所起的作用，認(rèn)為肥胖和嗜酸性粒細(xì)胞之間的關(guān)系可能不是單向的。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)肥胖具有保護(hù)作用[7-8]，但未得到其他研究驗(yàn)證。流行病學(xué)研究結(jié)果表明，血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與BMI或代謝綜合征呈正相關(guān)（r=1.43，P<0.001）[9]。SUNADOME等[10]認(rèn)為，當(dāng)BMI達(dá)到40 kg/m2時(shí)，血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與BMI有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖組嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和百分比均稍高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這可能與納入的肥胖患者中有85%為中度肥胖（BMI<35 kg/m2）有關(guān)。COTTAM等[11]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，病態(tài)肥胖（BMI>40 kg/m2）患者嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著升高，中性粒細(xì)胞CD62L表達(dá)顯著降低，CD11b表達(dá)不變，且隨著手術(shù)后的體重減輕而迅速逆轉(zhuǎn)，提示肥胖患者存在低度慢性炎癥狀態(tài)；慢性炎癥導(dǎo)致L-選擇素表達(dá)降低可能是肥胖者傷口感染發(fā)生率較高的一個(gè)因素。在L-選擇素缺乏的小鼠中，中性粒細(xì)胞遷移到炎癥部位的能力急劇下降[12]，為淋巴細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)和其他免疫器官創(chuàng)造了條件[13]。

CD62L即L-選擇素，是一類表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板表面的黏附分子，其水平在各種介質(zhì)的響應(yīng)中通過(guò)金屬蛋白酶介導(dǎo)的脫落機(jī)制被下調(diào)[14]，介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的最初滯留和滾動(dòng)。被過(guò)敏原刺激后，支氣管肺泡灌洗液和痰液中嗜酸性粒細(xì)胞CD62L的表達(dá)明顯下調(diào)[15-16]。盡管有研究結(jié)果顯示患有嚴(yán)重或輕度哮喘的受試者與正常受試者比較，血液嗜酸性粒細(xì)胞CD62L表達(dá)無(wú)差異，但其下調(diào)始終被認(rèn)為是粒細(xì)胞活化的“第一步”[17-18]。CD63即溶酶體相關(guān)膜蛋白-3，屬于四跨膜蛋白超家族的成員，人體內(nèi)的多種細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞均可表達(dá)。CD63在靜息狀態(tài)下主要表達(dá)于核內(nèi)體和溶酶體，受刺激后移行至細(xì)胞表面，主導(dǎo)脫顆粒作用，因此被認(rèn)為是粒細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志，且和過(guò)敏的發(fā)生有關(guān)。嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒可使許多細(xì)胞因子、溶酶體水解酶、ECP和主要堿性蛋白被釋放出來(lái)，在許多疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。ECP是一種強(qiáng)堿性顆粒蛋白，是反映嗜酸性粒細(xì)胞活化程度的炎癥標(biāo)志物，可抑制T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放組胺，并刺激黏液分泌，與哮喘、鼻竇病變的發(fā)生率和嚴(yán)重程度等密切相關(guān)[19]。此外，ECP通過(guò)抑制血栓調(diào)節(jié)蛋白的功能來(lái)激活血小板，促進(jìn)血栓形成，參與冠狀動(dòng)脈病變的發(fā)生、發(fā)展[20-21]。本研究中，外周血嗜酸性粒細(xì)胞CD62L表達(dá)量與BMI呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.332，P=0.034）；與對(duì)照組比較，肥胖組外周血嗜酸性粒細(xì)胞CD62L表達(dá)顯著降低，CD63表達(dá)顯著升高，ECP水平無(wú)顯著變化。提示肥胖患者體內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞處于激活狀態(tài)，但中度肥胖的低度慢性炎癥狀態(tài)可能不足以引起ECP的表達(dá)和釋放顯著增加。病態(tài)肥胖（BMI>40 kg/m2）是否會(huì)引起ECP或其他顆粒蛋白水平的改變尚需要進(jìn)一步研究。

脂肪組織是人體的主要能量存儲(chǔ)位點(diǎn)，體重增加和肥胖可導(dǎo)致白色脂肪組織的表型轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)功能失調(diào)的脂肪細(xì)胞[22-23]。炎癥細(xì)胞由骨髓脂肪組織釋放，脂肪組織中巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)抗原，啟動(dòng)其他免疫細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等）的招募，分泌炎癥細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致脂肪細(xì)胞功能障礙和代謝功能障礙[24]。功能失調(diào)的脂肪細(xì)胞也分泌炎癥細(xì)胞因子，同時(shí)也產(chǎn)生保護(hù)性脂肪因子和抗炎介質(zhì)，如脂聯(lián)素[25]、白細(xì)胞介素10、白細(xì)胞介素19[24，26]。脂肪組織駐留的嗜酸性粒細(xì)胞是脂肪組織中白細(xì)胞介素4的主要來(lái)源。嗜酸性粒細(xì)胞通過(guò)白細(xì)胞介素4與M?s通信在白色脂肪組織中觸發(fā)解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)，變?yōu)槊咨静⒃黾赢a(chǎn)熱，這被認(rèn)為可能是嗜酸性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的肥胖保護(hù)機(jī)制[27]。然而，直接增加脂肪組織中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量并不足以改善代謝障礙和肥胖[28]，還需要更多的研究探索肥胖條件下嗜酸性粒細(xì)胞的功能活性和表型，以尋找更好的治療策略來(lái)解決肥胖。

本研究的局限性在于樣本量尚小，在研究人群中沒(méi)有按照肥胖的程度進(jìn)一步進(jìn)行分組，且可能存在難以去除的混雜因素，因此需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)本研究的發(fā)現(xiàn)，并調(diào)查這些關(guān)聯(lián)的可能潛在機(jī)制。

綜上所述，肥胖者外周血嗜酸性粒細(xì)胞的活性顯著增強(qiáng)，但血清ECP水平無(wú)明顯升高。同時(shí)，肥胖可能對(duì)中性粒細(xì)胞的黏附和滾動(dòng)有一定影響。尚需更大樣本量的研究來(lái)評(píng)估肥胖與嗜酸性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量和功能之間的關(guān)系。