田文妍， 張曉旭， 張麗娜， 郭米雪， 劉 健， 李 婷， 楊少奇

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，寧夏醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，寧夏醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肝膽外科，寧夏醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 5.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由長期慢性飲酒引起的一系列肝臟疾病的總稱[1]。在重度ALD 中，30 d 病死率接近30%。激素及保肝藥物是主要的治療手段，但其生存獲益是短暫的。在激素?zé)o應(yīng)答者中，早期肝移植仍然受到很大的限制[2]。因此，尋求安全、高效的方法是治療ALD 的必然趨勢。腸道屏障與其微生物群和肝臟的雙向關(guān)系是ALD 致病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。當(dāng)腸道屏障受損時(shí)，腸道內(nèi)微生物群及其產(chǎn)物，如內(nèi)毒素（endotoxin，LPS）可易位經(jīng)門靜脈入肝并加重炎性反應(yīng)[4-5]。并且作為腸道來源病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），是機(jī)體炎性的重要觸發(fā)因素。飲酒可導(dǎo)致腸道微生物的組成發(fā)生顯著變化[6]，增加體循環(huán)及外周血的LPS 水平，但其具體機(jī)制尚不清楚。丁酸是腸道微生物發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的一種，已被證實(shí)在保護(hù)腸道屏障功能、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、改善脂質(zhì)代謝等方面發(fā)揮著重要作用[7-8]。本課題組前期研究[9]表明，給ALD 模型小鼠喂養(yǎng)丁酸鈉（sodium butyrate，NaB），能夠有效抑制ALD 炎性反應(yīng)。但是，NaB 如何通過腸—肝軸改善腸道通透性從而使炎性因子水平降低的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

本研究通過檢測腸道絨毛結(jié)構(gòu)的改變、腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達(dá)及炎性因子的表達(dá)水平，評價(jià)NaB 對ALD 小鼠腸道通透性及炎性因子的影響，以期為臨床防治ALD 提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性8 周齡C57BL/6J 小鼠60 只，體質(zhì)量為（18±2）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，在寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級環(huán)境下飼養(yǎng)。所有動物實(shí)驗(yàn)研究均通過寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會倫理審核（No.2020-053）。NaB（純度為99%）購自美國Sigma 公司；小鼠Lieber-De－Carli 液體飼料及其對照飼料購自南通特洛菲生物科技有限公司；ZO-1（sc-33725）、Occludin（sc-133256）一抗購自美國Santa Cruz 公司，ZO-1 二抗購自美國Abcam 公司（ab6840），Occludin 二抗（BST09K24C01）購自美國Boster 公司，LPS 檢測鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；ELISA 試劑盒購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組 將60 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為陰性對照組、NaB 干預(yù)對照組、ALD 模型組、NaB 干預(yù)模型組，每組15 只。根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]的方法，對照組給予Lieber-DeCarli 對照液體飲食，模型組給予等熱量的Lieber-DeCarli 酒精液體飲食。同時(shí)，NaB 干預(yù)對照組給予含NaB（0.6 g·kg-1）的液體飲食喂養(yǎng)[12-13]。6 周后，麻醉小鼠，抗凝管收集小鼠外周血、肝臟及腸道組織。

1.2.2 腸道病理學(xué)組織的觀察 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色檢測腸道絨毛結(jié)構(gòu)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腸道組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后嵌入石蠟。HE 染色腸道組織切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腸道組織形態(tài)的變化。

1.2.3 免疫熒光染色檢測腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達(dá) 收集小鼠腸道組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后嵌入石蠟進(jìn)行切片。將切片放入烘箱烤片大約1 h，立即放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ及梯度乙醇進(jìn)行脫蠟，脫蠟后放入PBS 中清洗3 次，每次5 min。然后放入檸檬酸鉀修復(fù)抗原，加封閉液，37 ℃孵育1 h，孵育完用PBS 清洗3 次，每次5 min。洗后滴加一抗（ZO-1、Occludin）4 ℃孵育過夜。第2 天從冰箱取出復(fù)溫1 h，回收一抗，PBS 清洗3次，每次5 min。然后滴加熒光二抗，37 ℃避光孵育2 h，甩去二抗，PBS 清洗后加DAPI 封片。

1.2.4 肝臟、腸道及血漿LPS 的測定 按照鱟試劑盒說明書步驟檢測肝臟、腸道及血漿中LPS 的表達(dá)水平。

1.2.5 肝臟、腸道及血漿炎性因子水平的測定 按照ELISA 試劑盒說明書的操作步驟，檢測小鼠組織及外周血的白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、IL-17A的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)分析法分析腸道通透性與血漿炎性因子的相關(guān)性。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸道病理組織學(xué)形態(tài)

HE 染色結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，ALD模型組結(jié)腸組織可見腸道絨毛結(jié)構(gòu)明顯紊亂，固有層可見單個(gè)核細(xì)胞浸潤。與ALD 模型組相比，NaB 干預(yù)模型組腸絨毛結(jié)構(gòu)有所改善，見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織HE 染色結(jié)果（HE×40）

2.2 NaB 干預(yù)增強(qiáng)ALD 小鼠腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達(dá)水平

采用免疫熒光染色檢測結(jié)腸組織緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，ALD 模型組小鼠結(jié)腸組織中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的表達(dá)降低（P ＜0.05）；與ALD 模型組相比，NaB 干預(yù)模型組緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，NaB 通過增加腸道緊密連接蛋白表達(dá)來改善ALD 小鼠腸屏障的完整性，見圖2。

圖2 NaB 對小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達(dá)水平的影響

2.3 NaB 干預(yù)減少ALD 小鼠血漿、肝臟及腸道的LPS 水平

與陰性對照組相比，ALD 模型組小鼠血漿、肝臟及腸道LPS 水平均升高（P 均＜0.05）；與ALD 模型組相比，NaB 干預(yù)模型組小鼠血漿、肝臟及腸道LPS 水平均降低（P 均＜0.05），見圖3。

圖3 NaB 干預(yù)對ALD 小鼠血漿、肝臟及腸道LPS 表達(dá)水平的影響

2.4 NaB 干預(yù)抑制ALD 小鼠血漿、肝臟及腸道炎性因子

與陰性對照組相比，ALD 模型組小鼠血漿、肝臟、腸道的IL-6、IL-1β、IL-17A 升高（P 均＜0.05）；與ALD 模型組相比，NaB 干預(yù)模型組小鼠血漿、肝臟、腸道的IL-6、IL-1β、IL-17A 均下降（P 均＜0.05），見圖4。

圖4 NaB 干預(yù)對小鼠血漿、肝臟及腸道炎性因子表達(dá)水平的影響

2.5 炎性因子水平與腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的Pearson 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在ALD 模型小鼠中，腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的降低與腸道炎性因子的水平存在負(fù)相關(guān)性，隨著緊密連接蛋白表達(dá)的降低，炎性因子水平升高。NaB 干預(yù)模型組小鼠中炎性因子的水平隨著腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達(dá)升高而降低（P 均＜0.05），見圖5。

圖5 腸道緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 與腸道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A、LPS 的相關(guān)性分析

3 討論

ALD 是一種代謝性肝病，其病理進(jìn)展主要由慢性炎癥反應(yīng)驅(qū)動，來自腸道微生物群及其產(chǎn)物的病原體相關(guān)分子模式LPS 易位到腸系膜淋巴系統(tǒng)和門靜脈循環(huán)，構(gòu)成了一種感染的中心機(jī)制[14]。腸道微生態(tài)失調(diào)和腸道屏障完整性的受損是ALD 發(fā)病機(jī)制的重要因素，腸道通過膽道和門靜脈與肝臟連接，PAMPs 可直接通過腸—肝軸進(jìn)入肝臟，激活促炎信號通路TLR4，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18 等釋放，從而加重ALD 小鼠的炎癥反應(yīng)[15-16]。

腸道屏障是機(jī)體防止病原微生物及其產(chǎn)物進(jìn)入體循環(huán)的第一道防線，而酗酒可破壞腸屏障完整性[17]。超過一半的酗酒者已被證實(shí)有腸道屏障功能障礙和腸道生態(tài)失調(diào)[18]，從而導(dǎo)致微生物進(jìn)入體循環(huán)，這可能使ALD 小鼠的炎性反應(yīng)進(jìn)一步加重。本研究在經(jīng)典的動物ALD 模型中，采用HE 染色及免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸絨毛結(jié)構(gòu)明顯紊亂，腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達(dá)減少，與上述研究結(jié)果一致，表明保持腸道屏障的完整性在預(yù)防ALD 中發(fā)揮重要作用。并且本實(shí)驗(yàn)采用NaB 干預(yù)ALD 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)腸道絨毛結(jié)構(gòu)較ALD 模型組明顯改善，腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達(dá)也有所升高，表明NaB 具有改善腸道屏障功能的能力，腸源性LPS 易位在乙醇引起的肝臟慢性炎癥中起著重要作用。有研究[19]表明，體外濃度在1～10 mmol·L-1的NaB 可改善E12 人結(jié)腸細(xì)胞功能。本研究發(fā)現(xiàn)，NaB 干預(yù)能夠減少ALD 小鼠腸道、肝臟及血漿中LPS 的含量，提示NaB 通過改善腸道屏障的通透性進(jìn)而減少腸源性LPS 經(jīng)過腸—肝軸進(jìn)入肝臟，從而抑制ALD 小鼠的炎性反應(yīng)。

在腸道炎性過程中產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，具有重要的腸道緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)作用。有研究[20]表明，IL-1β 誘導(dǎo)腸上皮緊密連接（intestinal epithelial tight junction，IETJ）的通透性增加是腸道炎癥的一個(gè)重要促進(jìn)因素。腸道炎癥的加重會導(dǎo)致腸道微生物群的改變及腸道細(xì)菌的增加，而腸道微生物群的改變及其細(xì)菌產(chǎn)物可以激活免疫細(xì)胞來調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-1β 和IL-6，這些促炎細(xì)胞因子反過來作用于緊密連接蛋白，增加屏障通透性[21]。前期研究[9]顯示，在ALD 模型組小鼠的血漿及肝臟中，IL-1β 及IL-6 升高，而給予NaB 后炎性因子表達(dá)顯著下降，改善了ALD 小鼠的炎癥反應(yīng)。也有研究[22]證明干擾素（IFN-γ）、IL-17A在體外可迅速增加血腦屏障和腸上皮屏障的通透性。本研究檢測了血漿、肝臟及腸道IL-6、IL-1β、IL-17A，結(jié)果表明，ALD 模型組小鼠的腸道、肝臟及血漿IL-6、IL-1β、IL-17A 升高，而NaB干預(yù)模型組的IL-6、IL-1β、IL-17A 有所下降，與前期研究[9]結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上，對各組中的緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達(dá)水平與腸道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A 的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白的表達(dá)水平與腸道炎性因子IL-1β、IL-6、IL-17A 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明腸道通透性的增加導(dǎo)致腸道炎性反應(yīng)加重，進(jìn)而使腸道內(nèi)有害物質(zhì)經(jīng)過腸—肝軸進(jìn)入肝臟，導(dǎo)致ALD小鼠炎性反應(yīng)進(jìn)一步加重。給予NaB 后，ALD 模型組小鼠緊密連接蛋白表達(dá)升高，炎性因子水平表達(dá)降低，提示NaB 可通過增加緊密連接蛋白的表達(dá)來改善ALD 小鼠的炎癥反應(yīng)[15]。

綜上所述，本研究在證實(shí)NaB 可改善ALD小鼠肝臟炎癥的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其對腸道黏膜通透性的影響。NaB 通過增加腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin 的表達(dá)來改善腸道通透性，從而減少腸源性LPS 經(jīng)過腸—肝軸進(jìn)入肝臟介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，抑制ALD 的炎癥反應(yīng)。NaB 作為一種潛在的安全、價(jià)格低廉、有效的干預(yù)劑，可能為臨床ALD 防治提供新的選擇。