郭宇琪， 王亞麗， 張智源， 高玉婧

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，銀川 750004）

轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-2α（transcription factor activating enhancer binding protein 2 alpha，TFAP2A） 是轉(zhuǎn)錄因子AP-2 家族的成員之一。AP-2 家族由AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ 和AP-2ε 組成，通過與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡的眾多基因的轉(zhuǎn)錄，在哺乳動物發(fā)育過程中起到重要作用。TFAP2A 基因缺失可導(dǎo)致鰓裂眼面綜合征（branchio-oculo-facial syndrome，BOFS）。目前已發(fā)現(xiàn)該基因編碼不同亞型的三種轉(zhuǎn)錄變體。TFAP2A與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究[1]發(fā)現(xiàn)，miR-876-5p 通過靶向TFAP2A 抑制乳腺癌發(fā)展；鋅指蛋白ZNF471 通過轉(zhuǎn)錄抑制下游靶點TFAP2A 和PLS3 抑制胃癌發(fā)生[2]；TFAP2A 通過反式激活PSG9 來增強(qiáng)TGF-β 信號傳導(dǎo)，從而促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移[3]；TFAP2A 通過與PDL1 形成的正反饋通路促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生[4]。為深入研究TFAP2A 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制，本研究構(gòu)建了TFAP2A 的真核表達(dá)載體并對其表達(dá)效率進(jìn)行了檢測，為后續(xù)研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)為本實驗室制備。CV702 質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。MDA-MB-231 細(xì)胞為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamH I 和HindIII 購自英國New England Biolabs 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Biological Industries 公司；Lipofectanmine 2000 購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；ClonExpressTMⅡOne Step Cloning Kit 購自Vazyme 公司；GAPDH 抗體購自美國proteintech 公司；Flag 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；TFAP2A 抗體購自美國abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲取 通過PCR 擴(kuò)增制備TFAP2A 的cDNA 片段，設(shè)計引物序列如下：TFAP2A-F：5’-CACACTGGACTAGTGGATCCCGCC ACCATGAAAATGCTTTGGAAATTG-3’；TFAP2AR：5’-CCTTGTAGTCACTTAAGCTCTTTCTGTGCT TCTCCTCTTTGTC-3’。擴(kuò)增引物除含有目的基因5’端部分序列用于PCR 擴(kuò)增目的基因外，還包含BamH I 和Hind III 的酶切位點。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。

1.2.2 目的基因與載體的連接及轉(zhuǎn)化 采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對CV702 質(zhì)粒的多克隆位點進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與載體進(jìn)行連接，于冰上配置反應(yīng)體系，見表1。用移液器輕輕吹打混勻，短暫離心，避免產(chǎn)生氣泡。將反應(yīng)液置于37 ℃反應(yīng)30 min，隨后置于冰上冷卻5 min 后立即轉(zhuǎn)化。將10 μL 反應(yīng)產(chǎn)物加入到100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。42 ℃熱激90 s，冰上放置2 min。加入LB 培養(yǎng)基500 μL，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h。取適量菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。

表1 PCR 產(chǎn)物與載體進(jìn)行連接反應(yīng)體系（μL）

1.2.3 菌落PCR 法鑒定CV702-TFAP2A 重組質(zhì)粒 對菌落進(jìn)行PCR 鑒定，鑒定引物序列為TFAP2A-KL-F：5’-TAACAAGGACAACCTCTTCG-3’；TFAP2A-KL-R：5’-TTATTAGGAAAGGACAGT GGG-3’。在超凈工作臺中，用無菌槍頭挑取單個菌落至20 μL 鑒定體系中，吹打混勻，置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共22 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。將鑒定出的陽性克隆轉(zhuǎn)化子接種于適量含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，取適量菌液進(jìn)行測序。對測序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對分析。

1.2.4 CV702-TFAP2A 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及表達(dá)效率的檢測 將MDA-MB-231 細(xì)胞適量接種于六孔板中，用含有10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率約為60%～70%時，使用Lipofectanmine 2000 將1 μg 的CV702載體和CV702-TFAP2A 重組載體分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231 細(xì)胞中。于轉(zhuǎn)染后48 h 提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，200 mA 濕轉(zhuǎn)150 min 至PVDF 膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，5%脫脂奶粉稀釋兔抗人Flag 抗體、TFAP2A 抗體以及GAPDH 抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育50 min，TBST洗膜3 次，每次5 min，顯影曝光，保存實驗結(jié)果，并用Image J 軟件進(jìn)行灰度值定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件和Graph-Pad Prism 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CV702-TFAP2A 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)CV702 質(zhì)粒圖譜（圖1），采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，以形成相應(yīng)的黏性末端，見圖1。對載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。采用凝膠回收試劑盒回收線性化的載體條帶。TFAP2A cDNA全長為1 320 bp，對TFAP2A 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化表達(dá)載體進(jìn)行連接，得到重組產(chǎn)物，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α 中，獲得重組細(xì)菌克隆。

圖1 CV702 載體結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 CV702 載體酶切結(jié)果

圖3 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 CV702-TFAP2A 重組真核表達(dá)載體的鑒定

挑取8 個轉(zhuǎn)化子克隆，以TFAP2A 基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及鑒定，結(jié)果見圖4，轉(zhuǎn)化子2、3、5、6、7、8 均能夠擴(kuò)增出TFAP2A 基因，提示為陽性克隆。對陽性克隆進(jìn)一步進(jìn)行測序及分析，見圖5，對比結(jié)果表明測序結(jié)果與TFAP2A cDNA序列完全一致，表明CV702-TFAP2A 重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 PCR 鑒定重組克隆

圖5 陽性克隆測序峰圖

2.3 CV702-TFAP2A 在MDA-MB-231 中的表達(dá)鑒定

分別采用TFAP2A 抗體和Flag 抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖6，與CV702 對照載體相比較，轉(zhuǎn)染CV702-TFAP2A 重組質(zhì)粒的MDA-MB-231 細(xì)胞中的Flag-TFAP2A 的表達(dá)水平升高（P 均<0.05），表明所構(gòu)建的CV702-TFAP2A 重組載體能夠在真核細(xì)胞中高效表達(dá)。

圖6 CV702-TFAP2A 在MDA-MB-231 中的表達(dá)鑒定

3 討論

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020 年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，女性乳腺癌現(xiàn)在已經(jīng)超過肺癌成為2020 年全球癌癥發(fā)病率的主要原因[5]。在所有乳腺癌病理類型中，三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）僅占10%～20.8%，患者預(yù)后極差。三陰性乳腺癌是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子（HER-2）均表達(dá)為陰性的乳腺癌[6]。TNBC 患者的發(fā)病年齡比其他類型乳腺癌患者更年輕，通過117 例TNBC 患者的分析，結(jié)果顯示63%的TNBC 患者年齡小于50 歲[7]。目前TNBC 的主要治療方法是腫瘤切除和化療，但由于其分子異質(zhì)性、細(xì)胞分化差、惡性程度高、缺乏分子靶點、轉(zhuǎn)移速率快，目前尚無預(yù)防TNBC 復(fù)發(fā)的靶向治療方法[8]。因此還需要更多的基礎(chǔ)研究和臨床研究來改善TNBC 的治療。

TFAP2A 基因定位于6 號染色體短臂，包含7 個外顯子，大部分變異位點位于4 號外顯子上，占82%。轉(zhuǎn)錄因子TFAP2A 作為AP-2 家族成員，參與細(xì)胞生長、增殖和分化的調(diào)控，參與胚胎形成過程中的程序性死亡[9]；增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對靶向藥物的敏感性[10]；在腫瘤中發(fā)揮雙向調(diào)控作用：在乳腺癌、肺癌、胃癌等中發(fā)揮促癌作用[11-13]，在黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肝癌中發(fā)揮抑癌作用[14-16]。近年來，有研究[17-18]表明，轉(zhuǎn)錄因子TFAP2A 可以促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，過表達(dá)TFAP2A 可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[1]。敲低長鏈非編碼RNA MAFG-AS1 通過miR-3196/TFAP2A軸使JAK2/STAT3 信號通路失活，阻斷乳腺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展[19]。TFAP2A 過表達(dá)可能是乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的重要因素之一。另有研究[20]發(fā)現(xiàn)，與化療敏感患者相比，化療耐藥的TNBC 患者中TFAP2A，TFAP2C 的表達(dá)更高，這意味著這些轉(zhuǎn)錄因子是TNBC 患者化療耐藥的關(guān)鍵貢獻(xiàn)因子。但TFAP2A 在TNBC 遷移和侵襲中的具體機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)行深入研究。

本研究采用載體所帶的Flag 融合標(biāo)簽進(jìn)行了重組質(zhì)粒表達(dá)效率的檢測。融合標(biāo)簽是指利用DNA 體外重組技術(shù)，在目的蛋白N 端或C 端進(jìn)行融合表達(dá)的特定蛋白、多肽或寡肽標(biāo)簽[21]。重組蛋白通過融合標(biāo)簽可與包被在固相基質(zhì)上的特異配基結(jié)合，使重組蛋白定向固定并得以純化，簡化重組蛋白的檢測[22-23]。同時，既能保留天然蛋白的大部分結(jié)構(gòu)，又能實現(xiàn)增加溶解度、防降解、便于純化等功能。常用的融合標(biāo)簽有Flag、HA、c-myc 等。其中Flag 融合標(biāo)簽是具有8 個氨基酸的短序列標(biāo)簽，大小為1.01 kDa。Flag 融合標(biāo)簽序列短，只用一條人工合成的寡核苷酸鏈就可以編碼通常不會影響目的蛋白的功能和性質(zhì)[21，24]。Flag 標(biāo)簽融合蛋白可以直接通過非變性親和層析純化，從而得到有活性的融合蛋白?？笷lag 的抗體可以有效識別Flag 標(biāo)簽，可以通過ELISA、Western blot 等方法對含有Flag 的融合蛋白進(jìn)行檢測[21]。

綜上所述，本研究采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在回收線性化載體條帶后，PCR擴(kuò)增TFAP2A，將擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化載體連接后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，完成真核表達(dá)載體的構(gòu)建。再繼續(xù)對重組真核表達(dá)載體CV702-TFAP2A進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)8 個轉(zhuǎn)化子克隆中有6 個為可以擴(kuò)增出TFAP2A 的陽性克隆，進(jìn)一步測序及分析證明了重組真核表達(dá)載體CV702-TFAP2A 構(gòu)建成功。通過在MDA-MB-231 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CV702-TFAP2A 及其對照質(zhì)粒，進(jìn)行Western blot 實驗，證實轉(zhuǎn)染CV702-TFAP2A 的細(xì)胞中Flag -TFAP2A 的表達(dá)水平升高，為后續(xù)深入研究TFAP2A 在TNBC 發(fā)生和發(fā)展過程中尤其是侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。