馬 星， 桂 娜， 馬 婷， 王秀玉， 莫廷潤， 張鳴號

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.國家衛(wèi)生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室，銀川 750004； 3.寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點實驗室，銀川 750004； 4.寧夏賀蘭縣人民醫(yī)院，賀蘭 750200）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是引起動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）的獨立危險因素[1]。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖和遷移在Hcy 致As 發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[2]，但Hcy 致VSMC 增殖遷移的發(fā)生機制尚不十分清楚。微小RNA（microRNAs，miRNAs）可以通過影響miRNA 降解或翻譯，調(diào)控蛋白質(zhì)的表達，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起著重要作用[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 參與調(diào)控As發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程[4]。在Hcy 致VSMC 增殖遷移過程中是否受miRNAs 的調(diào)控有待進一步研究。本研究旨在探討Hcy 致VSMC 增殖遷移過程中miRNAs 的差異表達，并分析預(yù)測其下游靶基因，以期為明確Hcy 致VSMC 增殖遷移的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人源VSMC 株（蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司），Hcy（美國Sigma 公司），CCK-8 試劑盒（美國GlpBio 公司）。microRNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司），small RNA-seq 文庫構(gòu)建試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），NovaSeq 6000 S4 測序試劑盒（美國Illumina公司），總RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMC，使用第3～7 代細胞。當VSMC 的融合度達到80%后，將VSMC 分為Control 組和100 μmol·L-1Hcy 組[5-6]。100 μmol·L-1Hcy 刺激VSMC 48 h，采用CCK-8 實驗檢測VSMC 增殖；采用細胞劃痕實驗檢測VSMC 遷移。

1.3 細胞增殖活力測定

VSMC 以100 μL/孔，1×103～1×104個細胞的密度接種于96 孔板24 h，使其附著。然后用含100 μmol·L-1Hcy 的實驗培養(yǎng)基替換生長培養(yǎng)基。細胞孵育48 h。每孔中加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1 h。避光后取出96 孔板水平振蕩30 s。用酶標儀在450 nm 處記錄，各孔光密度=［OD（加藥）-OD（空白）］/［OD（0 加藥）-OD（空白）］×100%。

1.4 細胞劃痕實驗

用馬克筆在6 孔板背后均勻地畫出橫線，作為標記。將VSMC 懸液以100 μL/孔（約5×103個細胞）的體積接種于6 孔板中，待細胞長至90%～95%融合后，用200 μL 的槍頭按照馬克筆畫出的橫線在細胞表面畫線，然后吸去培養(yǎng)基，分別加入含0、100 μmol·L-1Hcy 的培養(yǎng)基培養(yǎng)0 h和48 h。將6 孔板取出，在顯微鏡下觀察劃痕的面積并拍照取樣。采用Image J 軟件測量劃痕面積。

1.5 高通量測序

采用microRNA 快速提取試劑盒/TRIzol 試劑提取Control 組和Hcy 組VSMC 中的核酸，檢測核酸濃度和完整性，構(gòu)建small RNA-seq 文庫，通過Illumina NovaSeq 6000 平臺測序完成6個樣品的small RNA 測序（各樣品Q30≥85%），得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別（base calling）轉(zhuǎn)化為原始測序序列（raw data 或raw reads），結(jié)果以FASTQ 文件格式存儲，其中包含測序序列的序列信息及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。

1.6 生物信息學(xué)分析

1.6.1 miRNAs 鑒定 使用BMKCloud（https://www.biocloud.net/）、miRBase（v22）數(shù)據(jù)庫和miRDeep2軟件包鑒定已知miRNAs 和預(yù)測新miRNAs，并對miRNAs 表達進行定量分析，篩選差異表達miRNAs。

1.6.2 miRNAs 的表達量分析 對各樣本中miRNAs 進行表達量統(tǒng)計，并用TPM 算法[7]對表達量進行歸一化處理。TPM 歸一化處理公式為：TPM={（Readcount*1 000 000）over Mapped Reads}。公式中，Readcount 表示比對到某一miRNA 的reads 數(shù)目；Mapped Reads 表示比對到所有miRNAs 上的reads 數(shù)目。

1.6.3 差異表達miRNAs 的篩選 使用EdgeR軟件[8]進行差異表達分析，獲得兩個樣品之間的差異表達miRNAs。差異分組使用“A_vs_B”的方式命名。根據(jù)兩（組）樣品之間表達水平的相對高低，差異表達miRNAs 可以劃分為上調(diào)miRNAs（Up-regulated miRNA）和下調(diào)miRNAs（Downregulated miRNA），上調(diào)miRNA 在樣品（組）B 中的表達水平高于樣品（組）A 中的表達水平，反之為下調(diào)miRNAs。

1.6.4 miRNAs 靶基因預(yù)測 采用miRanda 和TargetScan 軟件進行差異表達miRNAs 的下游靶基因預(yù)測，使用BLAST 軟件將預(yù)測靶基因序列與GO[9]和KEGG 數(shù)據(jù)庫比對[10]，獲得可能的靶基因信息。

1.6.5 RT-qPCR 按照總RNA 提取試劑盒說明書進行VSMC 中的總RNA 提取，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃15 min，37 ℃5 s，4 ℃保存。根據(jù)miRNA39、miRNA206 和miRNA212-5p 的基因序列，由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計引物，PCR 引物序列見表1。RT-qPCR擴增反應(yīng)條件：37 ℃30 s、95 ℃5 min、95 ℃10 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，共45 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線數(shù)據(jù)，對所得的Ct 值進行分析，利用公式2-ΔΔCt計算得到目的基因的相對表達量。ΔΔCt=（Ct 待測樣本目的基因-Ct 待測樣本內(nèi)參基因）-（Ct 校正樣本目的基因-Ct 校正樣本內(nèi)參基因）。

表1 PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，組間兩兩比較采用Stu-dent-Newman-Keuls 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy 促進VSMC 增殖

為了研究Hcy 對VSMC 增殖的影響，采用CCK-8 實驗檢測100 μmol·L-1Hcy 對VSMC 增殖的影響。結(jié)果顯示，與Control 組比較，Hcy 組VSMC 的增殖能力增強（P＜0.01），見圖1。

圖1 Hcy 對VSMC 增殖的影響

2.2 Hcy 促進VSMC 遷移

為了驗證Hcy 對VSMC 遷移能力的影響，本研究使用了細胞劃痕實驗觀察劃傷細胞0 h 和48 h 后的遷移能力變化。與Control 組比較，Hcy組VSMC 的劃痕面積在0 h 無變化，而在48 h時較Control 組減?。≒＜0.05），見圖2。

圖2 Hcy 促進VSMC 遷移

2.3 miRNAs 分析

2.3.1 miRNA 表達量總體分布與鑒定 miRNAs表達量總體分布圖能反映樣品中miRNAs 的整體表達模式，Control 組和Hcy 組VSMC 中共得到576 個miRNAs，其中已知miRNAs 404 個，新預(yù)測miRNAs 172 個，見圖3、表2。

圖3 各組VSMC 中TPM 密度分布圖

表2 各組VSMC 中miRNAs 鑒定結(jié)果（個）

2.3.2 差異表達的miRNAs 與Control 組比較，Hcy 組存在88 個差異表達的miRNAs，其中表達上調(diào)的miRNAs 有20 個，表達下調(diào)的miRNAs 有68 個。通過miRNAs 功能分析，與增殖、遷移相關(guān)的miRNAs 共有20個，其中表達上調(diào)的miRNAs 包括miRNA39、miRNA206 和miRNA212-5p，表達下調(diào)的miRNAs 包括miRNA35 、miRNA25 、miRNA149、miRNA10、miRNA128、miRNA159、miRNA54、miRNA148、miRNA44 、miRNA106 、miRNA146 、miRNA6 、miRNA144、miRNA47、miRNA8、miRNA161 和miRNA90，見圖4、圖5。

圖5 與VSMC 增殖和遷移相關(guān)的miRNAs 的差異表達

2.4 miRNAs 靶基因的預(yù)測分析

采用miRanda 和TargetScan 軟件進行靶基因預(yù)測，顯示576 個miRNAs 共存在9 966 個下游靶基因，見表3，使用BLAST 軟件將預(yù)測靶基因序列與GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫比對，分析靶基因的功能，見圖6，獲得與VSMC 增殖和遷移相關(guān)的差異miRNAs 的靶基因信息，見表4。

圖6 各組VSMC 中差異表達miRNAs 靶基因的GO 分類統(tǒng)計圖和KEGG 分類圖

表4 與VSMC 增殖和遷移相關(guān)的差異miRNAs 的靶基因預(yù)測

2.5 Hcy 上調(diào)VSMC 中miRNA212-5p

為了驗證差異表達miRNAs 預(yù)測的準確性，采用RT-qPCR 法檢測兩組細胞中miRNA39、miRNA206 和miRNA212-5p 的表達。結(jié)果顯示，Hcy 組miRNA212-5p 的表達上調(diào)（P ＜0.05），miRNA206 和miRNA39 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。

圖7 Hcy 對VSMC 中miRNA39、miRNA206 和miRNA212-5p 的表達的影響

3 討論

As 是一個涉及復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)和多種效應(yīng)分子的慢性炎癥過程[11]，As 的形成是致病因素和血管壁中的多種細胞，包括血管內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、單核/巨噬細胞、VSMC 等相互作用的結(jié)果[12]，具體表現(xiàn)為血管內(nèi)膜損傷、趨化因子和炎性因子激活、脂質(zhì)浸潤，內(nèi)皮細胞功能紊亂，VSMC 增殖、遷移，巨噬細胞形成、遷移，泡沫細胞形成和粥樣斑塊形成等病理過程[13]。其中，VSMC 作為As斑塊增殖體系中的活躍細胞之一[2]，位于動脈管壁的中層，是As 斑塊中巨噬細胞樣細胞和泡沫細胞的主要來源[14]。當血管壁受到內(nèi)外環(huán)境因素刺激，或VSMC 受到炎性因子、氧化應(yīng)激、細胞因子、血管活性肽、藥物損傷、機械作用等病理因素刺激后，可引起VSMC 增殖和凋亡平衡失調(diào)，出現(xiàn)VSMC 增殖和遷移。VSMC 的增殖和遷移與血管內(nèi)皮細胞的損傷被認為是As 形成過程中的主要始動環(huán)節(jié)[15-16]。VSMC 過度增殖并穿過基底膜向血管內(nèi)皮下遷移，通過吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)變成泡沫細胞，最終發(fā)展為纖維斑塊[17]。目前雖然對于As已有較多研究，但對VSMC 增殖和遷移的發(fā)生機制尚不十分清楚。

Hcy 是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸（蛋氨酸）代謝的中間產(chǎn)物。Hcy 誘發(fā)As 是經(jīng)多種通路相互作用、相互關(guān)聯(lián)的，血漿Hcy 每增加5 μmol·L-1，相當于膽固醇升高0.5 mmol·L-1，而血管危險性約增加1/3[1]。Hcy 可以通過影響內(nèi)皮細胞和VSMC 功能，參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，以及PI3K、p53、PTEN、MFN2、PDG 等改變基因表達活性等多種機制，促進As 的發(fā)生發(fā)展[6]。在本研究中，100 μmol·L-1Hcy 干預(yù)促進了VSMC 的增殖和遷移，這與既往的研究結(jié)果一致[2，6，17]。然而Hcy 引起VSMC 增殖和遷移的機制尚不十分明確。

miRNAs 為內(nèi)源性非編碼的短鏈RNA，是一種高效且特異的基因表達調(diào)控因子，通過與特定靶基因（miRNA）的3’UTR（非翻譯區(qū)）結(jié)合致miRNA 降解或翻譯抑制，進而影響蛋白質(zhì)的表達，調(diào)節(jié)靶蛋白參與細胞分化、增殖、凋亡和細胞信號傳導(dǎo)等基本生物過程，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起重要作用[18]。目前正在進行臨床前開發(fā)的miRNAs 模擬物和miRNAs 抑制劑已顯示出作為新型治療藥物的前景。多種技術(shù)平臺已被開發(fā)用于miRNAs 分離、miRNAs 定量、miRNAs 譜分析、miRNAs 靶點檢測和調(diào)節(jié)體內(nèi)外miRNAs 水平[19]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，miRNAs 參與調(diào)控As 形成、發(fā)展的病理生理過程，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及平滑肌細胞等多種細胞的生物學(xué)功能。但是在Hcy 誘導(dǎo)VSMC 增殖和遷移的過程中，Hcy 是否通過差異表達的miRNAs 影響VSMC 的增殖和遷移，尚需要進一步研究。

本研究在Hcy 誘導(dǎo)VSMC 增殖和遷移的基礎(chǔ)上，通過高通量測序分析各組VSMC 中差異化表達的miRNAs，并對差異表達的miRNAs 進行功能分析和靶基因預(yù)測。但Hcy 是否通過上述差異表達的miRNAs 及其下游靶基因發(fā)揮誘導(dǎo)VSMC 增殖和遷移的作用，還需要進一步的實驗驗證。