張滌，李慧潔，鄧躍毅

上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200030

IgA 腎病（IgAN）是一種自身免疫性疾病，是腎小球腎炎的最常見原因[1]?？砂l(fā)病于任何年齡，但發(fā)病高峰期為20～30 歲[2]。在IgAN 中，腎小球因腎臟中IgA 復合物的沉積而受損，逐漸損壞腎臟導致慢性腎炎持續(xù)進展，最后進展到需要透析或腎移植的終末期腎病，是非糖尿病成人特發(fā)性腎病綜合征的最常見原因[3]。大多數(shù)患者表現(xiàn)為單發(fā)性或發(fā)作性肉眼血尿，或是在常規(guī)尿液檢查發(fā)現(xiàn)鏡下血尿和（或）蛋白尿。從無癥狀血尿和蛋白尿到肉眼血尿，并迅速進展為腎功能不全。

IgAN 屬于中醫(yī)學尿血、水腫、腎風、虛勞等范疇，病機為本虛標實，本虛多為氣虛、陰虛或陽虛，標實包括風熱、濕熱、熱毒、瘀血等。尿C 方為陳以平教授創(chuàng)立的經(jīng)驗用方——上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院腎內(nèi)科協(xié)定方，廣泛運用于治療IgAN，其由黃芪、川芎、葛根、黃精和杜仲5 味中藥組成，有益氣活血、健脾補腎的功效。本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法確定尿C 方和IgAN 的靶點，構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡，鑒定關(guān)鍵活性化合物，建立PPI網(wǎng)絡，鑒定樞紐基因。并進行了GO 和KEGG 富集分析，以探索共同靶點的信號通路和生物學功能。利用分子對接技術(shù)驗證了所選活性物質(zhì)與靶點的結(jié)合，為后續(xù)尿C 方治療IgAN 的研究提供了依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 尿C 方藥物活性成分篩選利用中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡（TCMSP；https：//www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫篩選尿C 方藥物的活性成分[4]。根據(jù)藥代動力學參數(shù)：吸收、分布、代謝、排泄（ADME）、生物口服利用度（OB）和類藥性指數(shù)（DL），以OB≥30%和DL≥0.18 作為篩選活性成分的閾值[5-6]，篩選尿C 方的化學成分。

1.2 篩選尿C 方可能靶點從TCMSP 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）獲得藥物潛在活性成分的靶標。然后，利用Uniprot（http：//www.uniprot.org/）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的UniProtKB 搜索功能用于標準化相關(guān)靶標的基因，物種設置為“人類”，狀態(tài)設置為“已審查”[7]。在PubChem[8]（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索未找到有效靶點的活性成分的化學結(jié)構(gòu)，選擇Swiss ADEM，以GI absorption 值為HIGH，并且DL 中至少有兩個YES 進行篩選[9-10]，利用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）為篩選后的化學成分預測可能的基因靶點，將標準化后的靶點去重得到最終的藥物靶基因。

1.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建為了構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡，使用Cytoscape 3.9.1 軟件（https：//cytoscape.org/）來連接活性成分及其相關(guān)靶標。然后，使用網(wǎng)絡分析儀進行拓撲分析，以突出尿C 方在IgAN 治療中的關(guān)鍵活性成分和靶點。

1.4 IgAN 靶點篩選IgAN 相關(guān)的靶基因是以“IgA nephropathy”為關(guān)鍵檢索詞從GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫[11]（相關(guān)性得分≥10）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/home/）數(shù)據(jù)庫[12]、人類在線孟德爾遺傳（OMIM，https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫[13]中收集。合并不同數(shù)據(jù)庫的IgAN 相關(guān)靶標并去除重復項，得到IgAN 的潛在靶點。最后將潛在靶點在UniProt 上統(tǒng)一為基因名稱。

1.5 尿C 方與IgAN 交集靶點通過Venn 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得尿C 方和IgAN之間的交叉靶基因并進行鑒定和可視化。得到尿C方治療IgAN 的交集靶點，并繪制韋恩圖。

1.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建利用交互數(shù)據(jù)庫平臺“檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)檢索工具”（STRING）（https：//string-db.org/）[14]搜索藥物-疾病交叉靶點，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡。在數(shù)據(jù)庫檢索中，設置蛋白質(zhì)種類為“Homo sapiens”，去除孤立節(jié)點，置信度設置為0.9 以顯示PPI 網(wǎng)絡。之后，使用Cytoscape 3.9.1 軟件對交互網(wǎng)絡進行可視化[15]。

1.7 GO 分析和KEGG 通路富集分析DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫是一種全面的功能注釋工具，它由一個全面的知識庫和一組功能分析工具組成。不僅可以用于基因差異分析，還可以用于途徑富集[16-17]。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫，對用于治療IgAN 的尿C 方潛在靶標進行GO 和KEGG 富集分析，分析尿C 方治療IgAN 的主要生物學功能。GO 分析包括生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF），根據(jù)P值大小，各取前10 位條目。KEGG 富集分析根據(jù)P值取前20 位富集結(jié)果。獲得的數(shù)據(jù)由生物信息學（http：//www.bioinformatics.com.cn/）組織和可視化。結(jié)果以條形圖和氣泡圖表示。

1.8 分子對接選取復方PPI 網(wǎng)絡前15 個基因蛋白和“復方-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖前10 的活性成分，使用中藥網(wǎng)絡藥理學分析系統(tǒng)TCMNPAS 以PSOVina 算法進行分子對接，計算蛋白與藥物化學成分之間結(jié)合的親和力及活性口袋位點。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得分子結(jié)構(gòu)，從PDB 數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 采用Autodock Vina V1.1.2 軟件（https：//vina.scripps.edu/）進行分子對接[18]，評估化合物與靶蛋白的親和力。進一步利用PyMOL3.8 分析了對接結(jié)果的交互模式。

2 結(jié)果

2.1 尿C 方中藥活性成分及靶點確定見表1。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索到70 種尿C 方組成中藥的潛在活性成分，篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18。使用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫進行成分補充。尿C 方一共含有5 種中藥，其中黃芪、葛根、川芎、黃精和杜仲分別篩選出了20、4、6、12 和28 個成分。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫獲取尿C 方中藥活性成分1 363 個靶點，其中黃芪533 個靶點、葛根87 個靶點、川芎37 個靶點、黃精135 個靶點、杜仲571 個靶點，通過刪除重復靶點和消除非活性靶點，最終獲得該藥物383 個潛在靶點。將其導入UniProt 數(shù)據(jù)庫進行基因名稱標準化。

表1 尿C 方藥物有效成分

2.2 復方-成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建見圖1。為了更好地觀察藥物、成分和靶點之間的關(guān)系，使用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建“復方-成分-靶點”網(wǎng)絡圖（圖1），更直觀地顯示它們之間的關(guān)系。該網(wǎng)絡圖包含436 個節(jié)點和1 428 條邊。通過Degree 值篩選出了其中前11 個關(guān)鍵成分，分別是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、異黃烷酮、脫氫二芷醇、類黃酮植物化學物、7-O-甲基異粘核醇、（-）-塔伯尼蒙坦寧、辛可南-9-醛，6′-甲氧基-（9R）-、黃芩素。

2.3 IgAN 相關(guān)目標預測結(jié)果以“IgA 腎病”為關(guān)鍵檢索詞，檢索OMIM、DrugBank、GeneCards、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫。GeneCards 數(shù)據(jù)庫一共找到1 593 個靶基因，排除Relevance score 小于2.4 的基因，得到796 個靶基因；DrugBank 數(shù)據(jù)庫篩選出30 個靶基因；OMIM 數(shù)據(jù)庫篩選出21 個靶基因；DisGeNET 數(shù)據(jù)庫篩選出17 個靶基因。合并4 個數(shù)據(jù)庫篩選得到的靶基因并進行重復數(shù)據(jù)刪除，獲得了823 個靶基因。

2.4 藥物-疾病交集靶點見表2、圖2。對383 個藥物活性成分靶點和823 個IgAN 相關(guān)靶點進行維恩分析。兩者相交后，得到111 個藥物-疾病交叉靶點，繪制維恩圖。

表2 藥物與疾病交集靶點

2.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建和可視化分析見表3、圖3。共將111 個常見藥物疾病靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫進行檢索，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用的PPI 網(wǎng)絡。網(wǎng)絡有111 個節(jié)點和431 條邊，平均節(jié)點度數(shù)為7.77，平均局部聚類系數(shù)為0.463，PPI富集P值為＜1.0e-16。STRING 分析的結(jié)果被導入到Cytoscape 3.9.1 軟件中，并使用網(wǎng)絡分析儀進行拓撲分析。節(jié)點大小與度值呈正相關(guān)，節(jié)點度數(shù)越大，節(jié)點在網(wǎng)絡中具有的生物學功能越多。根據(jù)Degree 值大小，連接最多的十個靶點是JUN、TP53、 AKT1、 MAPK1、 IL6、 PIK3CA、 TNF、CREBBP、MAPK14、CTNNB1。

圖3 尿C 方與IgAN 交集靶點的PPI 網(wǎng)絡

表3 尿C 方主要有效活性成分與IgAN主要靶點分子對接活性口袋定位

表3 PPI 網(wǎng)絡中Degree 值前20 的靶點

2.6 GO 富集分析見圖4、圖5。利用DAVID 數(shù)據(jù)庫和R 語言對111 個交集靶點進行GO 富集分析，共獲得706 個生物過程（BP）、63 個細胞成分（CC）和123 個分子功能（MF）。圖4 和圖5 展示了GO 功能富集分析在生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）方面最顯著的10 個結(jié)果?？梢园l(fā)現(xiàn)BP 涉及到細胞凋亡、炎癥反應基因表達等；CC 涉及到細胞外空間、分子復合物等；MF 涉及到相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、酶活性等。

圖4 尿C 方治療IgAN 的GO 富集分析氣泡圖

圖5 尿C 方治療IgAN 的GO 富集分析條形圖

2.7 KEGG 富集分析見圖6、圖7。111 種蛋白質(zhì)進一步產(chǎn)生了161 條KEGG 通路，前20 條關(guān)鍵信號通路如圖6、圖7 所示，KEGG 通路富集分析確定了這些與機制相關(guān)的通路。結(jié)果顯示尿C 方治療IgAN主要與糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、TNF 信號通路等密切相關(guān)。

圖6 尿C 方治療IgAN 的KEGG 富集分析條形圖

2.8 分子對接見表3、圖8、圖9。分子對接是通過幾何和能量匹配使分子與目標相互識別的過程?？梢愿鶕?jù)結(jié)合能值評估化合物和靶蛋白的結(jié)合強度和活性。負結(jié)合能值表明配體和受體可以自發(fā)結(jié)合。結(jié)合能值＜-5 kcal/mol 表明良好的結(jié)合活性，結(jié)合能值越低，對接效果越好。組分與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域稱為活性口袋，IgAN 主要靶點與尿C 方主要有效分子對接的活性口袋定位見表3。表中x、y、z 代表IgAN 主要靶點與尿C 方主要有效分子對接的活性口袋定位參數(shù)，分子對接的過程涉及分子之間的空間形狀互補和能量匹配，通過分子對接確定復合物中兩個分子正確的相對位置和取向，研究兩個分子的構(gòu)象。在TCMNPAS 中進行分子對接親和力分析，PPI 網(wǎng)絡排名前15 的靶蛋白與尿C 方中前10 的有效活性成分分子對接結(jié)果表明槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、類黃酮植物化學物、黃芩素與MAPK1、MAPK14 結(jié)合較好，具有良好的結(jié)合親和力。

圖8 PPI 前15 個靶點與排名前10 的有效活性成分分子對接親和力結(jié)果

圖9 分子對接結(jié)果可視化

3 討論

IgAN 其特征在于腎臟系膜區(qū)域的IgA、C3 或IgA 沉積[1，19]。根據(jù)牛津分類模型，其他病理類型的IgAN 特征包括系膜細胞增殖（M）、腎小球節(jié)段性硬化癥（S）、毛細血管增生性病變、間質(zhì)纖維化/腎小管萎縮（T）和新月體（C）的存在[20]。目前對IgAN 的治療還是以優(yōu)化支持治療為基礎，支持治療包括優(yōu)化生活方式、血壓管理、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷、評估并干預心血管事件風險[21]。對于腎功能迅速惡化的新月體IgAN 患者，可能需要口服皮質(zhì)類固醇和環(huán)磷酰胺進行治療[22]。

中藥通常含有多種生物活性物質(zhì)，具有多分子多靶點的優(yōu)點，還可以根據(jù)患者的具體情況改變相容性，從而達到不同的治療效果。這些特性使中藥在治療IgAN 方面具有巨大潛力。在IgAN 的臨床治療中，中藥的活性成分通常作用于多種信號通路，主要具有抗氧化、抗炎和抗纖維化作用，以及調(diào)節(jié)自噬[23]。

本研究應用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)，探討尿C 方治療IgAN 的作用機制。通過“復方-活性成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建，分析得出前11 個關(guān)鍵成分是槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、異黃烷酮、脫氫二芷醇、類黃酮植物化學物、甲基異粘核醇、（-）-塔伯尼蒙坦寧、辛可南-9-醛，6′-甲氧基-（9R）-、黃芩素。槲皮素是一種廣泛分布的生物活性類黃酮化合物，具有抑制多種疾病纖維化的潛力，研究表明[24]槲皮素減少了纖維化、炎癥、氧化應激和細胞凋亡的面積，顯著改善了HK-2 細胞中TGF-β1 誘導的EMT，增加雙調(diào)蛋白（AREG）的表達。此外，槲皮素能抑制AREG 與EGFR 受體的結(jié)合，從而進一步影響其他下游途徑，通過抑制AREG/EGFR 信號的激活來緩解體外和體內(nèi)纖維化。在另外的一項研究中[25]，證實了槲皮素通過調(diào)節(jié)阻塞性腎病中的NLRP3 來改善腎小管間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎纖維化。Sheng H 等[26]研究表明山奈酚（KPF）在腎病的發(fā)展中具有促進自噬和抑制細胞凋亡的特性。山奈酚通過抑制NF-κB p65 和反式激活Nrf2 介導的抗炎和抗氧化作用來預防氯化鎘（CdCl2）誘導的腎病[27]。除此之外山奈酚還有抗炎和抗動脈粥樣硬化作用[28-29]。已有的臨床和實驗研究報道，β-谷甾醇（24-乙基膽甾烯-3-醇）是一種天然存在的植物甾醇，具有抗高血脂和抗高血糖特性[30]。類黃酮類化合物主要通過調(diào)節(jié)氧化應激反應和炎癥反應來發(fā)揮治療作用[31]。黃芩素與槲皮素均能減輕相關(guān)的氧化應激反應。由免疫復合物沉積引起的炎癥反應發(fā)生在整個IgAN 過程中，各種炎癥損傷引起防御反應，引發(fā)體內(nèi)氧化應激，氧化應激引起細胞死亡可以激活炎癥細胞[32-33]，腎損傷越來越嚴重最后導致腎衰竭。因此，抑制炎癥反應和氧化應激是治療IgAN 的重要因素。尿C 方中排在前幾的有效活性成分大部分均有抗炎和抗氧化作用。

通過PPI 網(wǎng)絡分析，JUN、TP53、AKT1、MAPK1、IL-6、PIK3CA、TNF、CREBBP、MAPK14 和CTNNB1可能是尿C 方治療IgAN 的關(guān)鍵靶點。這些蛋白質(zhì)被認為是核心蛋白質(zhì)。而這些蛋白主要參與炎癥、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、癌癥的通路、氧化應激、細胞凋亡等。

MAPK14 調(diào)節(jié)AGE-RAGE 和癌癥信號通路[34]。AKT1 參與炎癥反應，有研究表示AKT1 缺失，會增加腎小管細胞凋亡和腎臟缺血再灌注損傷（IRI）期間的炎癥反應，加劇腎臟損傷[35-36]。IL-6 和TNF 具有免疫調(diào)節(jié)和促炎作用[37]。IL-1、IL-6 和TNF-α 可誘導Th22 細胞分化和增殖，這些產(chǎn)生Th22 的TGF-β細胞被系膜細胞分泌的CCL20、CCL22 和CCL27 募集，促成腎纖維化[38]。結(jié)合KEGG 富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些核心蛋白質(zhì)大多富集在AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等等。TNF 信號通路主要在于TNF-α，是IgAN 患者足細胞凋亡與蛋白尿相關(guān)的狹縫膈?。⊿D）紊亂的主要參與者[39-40]，在IgAN的發(fā)病機制中起作用。AGE-RAGE 信號通路與自身免疫性疾病、炎癥和組織損傷有關(guān)，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）抑制可減少腎病的炎癥反應和氧化病變[41]。免疫復合物沉積、系膜細胞的活化和足細胞形態(tài)變化導致腎臟炎癥反應[38]。尿C 方可以通過調(diào)控免疫相關(guān)細胞和炎癥介質(zhì)從而表現(xiàn)出對IgAN 的治療作用。因此，尿C 方在治療IgAN 方面具有巨大潛力。

為了更進一步驗證核心蛋白能否與小分子穩(wěn)定結(jié)合，筆者對前幾個與IgAN 密切相關(guān)的關(guān)鍵靶點蛋白進行了分子對接研究。結(jié)果表明，MAPK1 和MAPK14 具有良好的結(jié)合尿C 方活性化合物的能力。

近些年來，網(wǎng)絡藥理學在中醫(yī)領(lǐng)域得到了廣泛的應用，從綜合和系統(tǒng)的角度體現(xiàn)了中藥復方對IgAN 治療的多靶點、多途徑、協(xié)同作用。本研究基于網(wǎng)絡分析和分子對接技術(shù)，以尿C 方為研究對象，分析其化學成分、核心靶點和關(guān)鍵藥效學成分的結(jié)合能力。初步探討尿C 方治療IgAN 可能產(chǎn)生的物質(zhì)基礎和作用機制。