陳琨 楊慧 劉子嘉 張曉林 徐卓一 劉柄 趙玉寶 丁璐 鄧陽

作者單位：250000 濟(jì)南 1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）公共衛(wèi)生與健康管理學(xué)院；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；271000 泰安 3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染性疾病科；250000 濟(jì)南 4.濟(jì)南市中心醫(yī)院公共衛(wèi)生科

原發(fā)性肝癌居最常見惡性腫瘤的第六位和腫瘤死亡原因的第三位［1］。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌病例的80%以上，是其主要的組織學(xué)亞型［2］。大多數(shù)HCC 患者不具有特異性的臨床表現(xiàn)，且病情進(jìn)展迅速，確診時(shí)往往已進(jìn)展到中晚期，遠(yuǎn)期預(yù)后差［3］。因此，探尋可用于HCC早期診療和預(yù)測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志物極其重要。

人類白細(xì)胞抗原DRA（human leukocyte antigen-DRA，HLA-DRA）屬于HLA-Ⅱ類分子α鏈旁系同源基因，其編碼的α 鏈和HLA-DRB 編碼的β 鏈以非共價(jià)鍵結(jié)合組成異二聚體糖蛋白分子，即HLA-Ⅱ類分子［4-5］。HLA-Ⅱ類分子表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞表面，通過向T 細(xì)胞呈遞外源性抗原肽，在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。在腫瘤中，HLA-DRA呈遞腫瘤相關(guān)抗原被CD4+T 細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），以抑制腫瘤生長(zhǎng)［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)HLA-DRA 蛋白表達(dá)于甲狀腺乳頭狀癌［8］、宮頸癌［9］、膀胱癌［10］、腎透明細(xì)胞癌［11］等腫瘤組織，并發(fā)揮免疫調(diào)控作用。然而，目前HLA-DRA 在HCC 中表達(dá)情況及臨床意義尚不清楚。因此，本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HCC 組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中HLA-DRA 蛋白的表達(dá)情況，分析HLA-DRA 蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征以及術(shù)后預(yù)后之間的關(guān)系，以期為HCC 患者提供新的早期診斷標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016 年7 月至2022 年3 月在山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院和濟(jì)南市中心醫(yī)院接受肝癌根治性切除術(shù)的HCC 患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)病理組織活檢診斷為HCC；⑵術(shù)前未接受過手術(shù)治療、放化療、免疫治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴同時(shí)患有嚴(yán)重影響生存的心臟、腎臟、肺部等疾病或其他類型的惡性腫瘤；⑵臨床資料和隨訪資料不完整。術(shù)中同時(shí)取得原發(fā)灶組織和癌旁組織，其中癌旁組織距離癌灶邊緣2 cm 以上并經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)為正常組織。本研究獲得山東第一醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：倫審20231356號(hào)）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HLA-DRA 蛋白表達(dá)水平 將10%福爾馬林溶液固定的組織進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片（切片厚度為4μm）。采用SP 法對(duì)切片進(jìn)行染色，二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化、3% H2O2溶液處理內(nèi)源性過氧化物酶、熱修復(fù)抗原。加入1∶100 稀釋的HLA-DRA 一抗（AJ1362a，Abgent 公司），4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯洗片透明處理，中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察切片。

1.2.2 結(jié)果判定及評(píng)分 隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍鏡視野（×400）對(duì)每張切片中的陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。HLA-DRA蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，該百分比≤5%、6%～25%、26%～50%和＞50%分別計(jì)為0、1、2、3分。觀察細(xì)胞染色情況，根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分，其中細(xì)胞無染色、淺黃色、棕黃色和棕褐色依次計(jì)為0、1、2、3 分。以陽性細(xì)胞百分比評(píng)分×細(xì)胞染色強(qiáng)度得分計(jì)為總評(píng)分［12］，總評(píng)分0 分判定為陰性（-），1～2 分為弱陽性（+），3～4 分為中度陽性（++），6～9分為強(qiáng)陽性（+++），將（-）或（+）判定為低表達(dá)，將（++）或（+++）判定為高表達(dá)。

1.3 資料收集與隨訪

通過查閱病歷資料，收集患者性別、年齡、HBV感染情況、BCLC 分期、肝硬化、Child-Pugh 分級(jí)、腫瘤大小、包膜完整性、微血管侵犯等資料。根據(jù)《原發(fā)性肝癌診療指南（2022 年版）》［13］建議的隨訪方案，在患者出院后采用門診復(fù)查的方式進(jìn)行隨訪，兩年內(nèi)每3 個(gè)月隨訪1次，隨后每6個(gè)月進(jìn)行1次，隨訪截至2023年6月30日?？偵嫫冢╫verall survival，OS）是指從患者進(jìn)行手術(shù)的當(dāng)天開始到因任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間，無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）是指從手術(shù)當(dāng)天開始至腫瘤復(fù)發(fā)或隨訪截止日期或死亡日期（以先發(fā)生者為準(zhǔn)）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 8 軟件分析數(shù)據(jù)以及繪制統(tǒng)計(jì)圖。以例數(shù)（n）表示分類資料，兩組分類資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。利用Kaplan-Meier法描述HLA-DRA 表達(dá)水平與HCC 患者術(shù)后OS 和RFS 的關(guān)系，Log-rank 檢驗(yàn)比較不同HLA-DRA 表達(dá)水平患者OS 和RFS 的差異。應(yīng)用單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析HCC 患者術(shù)后OS 和RFS 的影響因素。以雙側(cè)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的臨床病理特征

本研究共納入273例HCC患者，其中男性235 例，女性38例；50歲及以下患者95例，50歲以上患者178例；HBsAg陽性者224例，陰性者49例；HBV DNA≤103IU/mL者144例，＞103IU/mL者129例；ALT≤40 U/L者104 例，＞40 U/L 者169 例；AST≤40 U/L 者96 例，＞40 U/L 者177 例；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）≤400μg/L 者79 例，＞400μg/L 者194 例；腫瘤直徑≤5 cm 者168 例，＞5 cm 者105 例；161例患者伴有肝硬化，112例患者不伴有肝硬化；Child-Pugh 分級(jí)A 級(jí)248 例，B 級(jí)25 例；BCLC分期0/A期137例，B/C期136例；93例無包膜/包膜不完整，180 例包膜完整；96 例發(fā)生微血管侵犯，177例未發(fā)生微血管侵犯。

2.2 HLA-DRA 蛋白在HCC 組織和癌旁組織中的表達(dá)情況

HLA-DRA 蛋白在HCC 組織中的高表達(dá)率為39.19%（ 107/273），低于癌旁組織的72.89%（ 199/273），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=62.927，P＜0.001）。見圖1。

圖1 HLA-DRA蛋白在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)（SP，×400）Fig.1 Expression of HLA-DRA protein in HCC and paracancerous tissues (SP, ×400)

2.3 HLA-DRA 蛋白表達(dá)與HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系

HCC組織中HLA-DRA蛋白高表達(dá)與AFP＞400μg/L（χ2=8.984，P=0.003）、伴有肝硬化（χ2=6.223，P=0.013）、BCLC B/C 分期（χ2=9.910，P=0.002）、無包膜/包膜不完整（χ2=7.616，P=0.006）以及微血管侵犯（χ2=4.727，P=0.030）有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)與患者性別、年齡、HBsAg、HBV DNA、ALT、AST、腫瘤大小以及Child-Pugh分級(jí)有關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

表1 HLA-DRA蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Association between HLA-DRA protein expression and clinicopathological characteristics of patients with HCC

2.4 HLA-DRA蛋白表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

截至2023 年6 月30 日，273 例HCC患者的中位OS 為45.07（95%CI：34.01～56.13）個(gè)月，1、3 和5年OS率分別為77.4%、55.3%和37.9%。107例HLA-DRA蛋白高表達(dá)者中位OS為55.35（95%CI：48.83～61.87）個(gè)月，1、3和5年OS率分別為86.6%、65.4%和40.1%，而166例低表達(dá)者中位OS為30.58（95%CI：15.45～45.71）個(gè)月，1、3 和5 年OS 率分別為70.8%、47.5%和38.6%。Logrank 檢驗(yàn)顯示，HLA-DRA 高表達(dá)者OS 率高于低表達(dá)者（χ2=4.336，P=0.037），見圖2A。

圖2 HLA-DRA蛋白表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Association between HLA-DRA protein expression and prognosis of patients with HCC

HCC 患者的中位RFS 為15.60（95%CI：11.27～19.94）個(gè)月，1、3和5年RFS率分別為56.4%、31.3%和18.7%。107 例HLA-DRA 蛋白高表達(dá)者中位RFS 為33.05（95%CI：24.03～42.07）個(gè)月，1、3 和5 年RFS 率分別為70.2%、41.6%和22.0%，而166 例低表達(dá)者中位RFS為11.40（95%CI：9.41～13.39）個(gè)月，1、3和5年RFS率分別為46.1%、22.9%和17.5%。Log-rank檢驗(yàn)顯示，HLA-DRA 高表達(dá)者RFS率高于低表達(dá)者（χ2=13.396，P＜0.001），見圖2B。

2.5 影響HCC 患者預(yù)后的單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

單因素分析發(fā)現(xiàn)AFP、伴有肝硬化、BCLC 分期、無包膜/包膜不完整、微血管侵犯、HLA-DRA 表達(dá)水平與HCC患者OS相關(guān)（均P＜0.05）。多因素分析結(jié)果顯示，AFP＞400μg/L、伴有肝硬化、BCLC B/C 分期、無包膜/包膜不完整、微血管侵犯是HCC 患者術(shù)后OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），而HLA-DRA 蛋白高表達(dá)是HCC 患者術(shù)后OS 的獨(dú)立保護(hù)因素（HR=0.657，95%CI：0.492～0.898，P=0.021）。見表2。

表2 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析影響HCC患者OS的因素Tab.2 Cox proportional hazards regression analysis of factors affecting OS in patients with HCC

單因素分析顯示，AFP、伴有肝硬化、BCLC 分期、無包膜/包膜不完整、微血管侵犯、HLA-DRA表達(dá)水平與HCC 患者RFS 相關(guān)（均P＜0.05）。多因素分析結(jié)果顯示，AFP＞400 μg/L、BCLC B/C 分期、無包膜/包膜不完整、微血管侵犯是HCC 患者術(shù)后RFS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），HLA-DRA 蛋白高表達(dá)是HCC 患者術(shù)后RFS 的獨(dú)立保護(hù)因素（HR=0.668，95%CI：0.549～0.857，P=0.008）。見表3。

表3 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析影響HCC患者RFS的因素Tab.3 Cox proportional hazards regression analysis of factors affecting RFS in patients with HCC

3 討論

正常情況下HLA-DRA 僅表達(dá)于幾種免疫活性細(xì)胞中，但是在病理狀態(tài)下如病毒感染、自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)生時(shí)，HLA-DRA 蛋白表達(dá)增加，主要發(fā)揮抗原呈遞和T 細(xì)胞激活調(diào)控，將腫瘤抗原性多肽呈遞給CD4+T 細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞被免疫細(xì)胞識(shí)別并殺傷，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展［14-15］。然而，腫瘤組織中HLA-DRA 蛋白表達(dá)水平下降，誘導(dǎo)HLA-DRA基因啟動(dòng)子區(qū)和/或Ⅱ類反式激活因子的高甲基化或低乙酰化，使Th1 細(xì)胞因子如IFN-γ 和TNF-α 分泌減少，進(jìn)而抑制CD8+T 細(xì)胞的激活，最終導(dǎo)致腫瘤免疫監(jiān)視缺失［7，16］。

由IFN-γ 誘導(dǎo)的HLA-DRA 是CD4+T 細(xì)胞識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原所必需的。有研究報(bào)道，在癌旁的正常結(jié)直腸上皮中HLA-DRA 呈高表達(dá)，而結(jié)直腸癌組織中HLA-DRA 表達(dá)水平較低，且HLA-DRA mRNA 表達(dá)與組織中的IFN-γ mRNA 水平相關(guān)，IFN-γ 則通過stat1依賴性機(jī)制抑制體內(nèi)c-myc 的表達(dá)，這種非免疫機(jī)制使患者預(yù)后更好［17］。YAN 等［18］對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的HLA-DRA基因進(jìn)行GSEA 富集分析，發(fā)現(xiàn)其主要富集于免疫或腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，包括PD-1 檢查點(diǎn)通路、PD-L1表達(dá)、腫瘤T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th1/Th2細(xì)胞分化途徑、NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)、抗原處理呈遞、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路和Th17 細(xì)胞分化等。本研究發(fā)現(xiàn)在HCC 組織中HLA-DRA 蛋白高表達(dá)率低于癌旁組織，且與多個(gè)因素相關(guān)，包括AFP＞400μg/L、伴有肝硬化、BCLC B/C 分期、無包膜/包膜不完整以及微血管侵犯等。

HLA-DRA 與多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和B 細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān)，因此檢測(cè)HLA-DRA 表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化有助于反映患者的免疫狀態(tài)，且HLA-DRA 表達(dá)降低是T 細(xì)胞分化異常的重要原因之一［18］。在腫瘤中，HLA-DRA 高表達(dá)常與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、瘤周淋巴細(xì)胞相關(guān)，也與多種腫瘤患者預(yù)后良好相關(guān)［19］。例如，在結(jié)直腸癌組織中HLA-DRA 高表達(dá)與患者預(yù)后良好相關(guān)［17］。安雯等［20］對(duì)105 例胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HLA-DRA 高表達(dá)患者相比低表達(dá)患者的生存優(yōu)勢(shì)更加明顯，HLA-DRA 高表達(dá)是患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。MATOBA 等［21］發(fā)現(xiàn)HCC 組織中HLA-DRA 蛋白低表達(dá)與早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，是HCC 早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。還有研究報(bào)道，HLA-DRA 在基因和蛋白質(zhì)水平上的低表達(dá)與兒童腎上腺皮質(zhì)瘤患者OS 降低相關(guān)［19］。HLA-DRA 蛋白低表達(dá)也可預(yù)測(cè)骨肉瘤的不良OS 和RFS［22］。HLA-DRA 蛋白高表達(dá)的腎透明細(xì)胞癌患者OS 較好，且是患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素［11］。本研究也發(fā)現(xiàn)HLA-DRA 蛋白高表達(dá)者1、3 和5 年OS 率和RFS 率均高于低表達(dá)者，且HLA-DRA 高表達(dá)是患者術(shù)后OS 和RFS 的獨(dú)立保護(hù)因素。然而，HLA-DRA 蛋白低表達(dá)的非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌患者無進(jìn)展生存率高于高表達(dá)者（P=0.004）［10］。可見，HLA-DRA 表達(dá)水平與不同類型的腫瘤患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系存在一定的差異，這可能與HLA-DRA 等免疫相關(guān)分子在不同類型腫瘤的免疫應(yīng)答和進(jìn)展中發(fā)揮促癌或抑癌作用的差異性有關(guān)。

本研究也存在以下局限性：⑴未開展功能實(shí)驗(yàn)探索HLA-DRA 蛋白在HCC 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制；⑵本研究屬于單中心研究，需要多中心大樣本臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，HCC 組織中HLA-DRA 蛋白的高表達(dá)率低于癌旁組織，其表達(dá)水平與AFP、肝硬化、BCLC分期、無包膜/包膜不完整以及微血管侵犯相關(guān)。HLA-DRA 蛋白高表達(dá)是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。因此，識(shí)別HLA-DRA 蛋白的高表達(dá)水平可能有助于早期發(fā)現(xiàn)HCC病變，從而提供更有效的治療方案和改善患者預(yù)后機(jī)會(huì)。