段樹卿,李秀玲,孫利,李云霞
復(fù)方石韋片由黃芪、石韋、苦參、萹蓄4味中藥材組成,處方來源于《證治匯補(bǔ)》中的石韋散[1]。藥效學(xué)試驗表明,復(fù)方石韋片具有利尿、抗菌、抗感染、解痙作用[2-3]。臨床試驗表明,復(fù)方石韋片具有清熱利濕、利尿通淋的功效,對上下尿路感染療效確切,臨床使用安全[4-5]。復(fù)方石韋片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》[6],含量測定項下規(guī)定對黃芪中的黃芪甲苷進(jìn)行檢測,黃芪甲苷一部分為游離黃芪甲苷,一部分為堿性條件下黃芪甲苷衍生物的轉(zhuǎn)化,其總和才是復(fù)方石韋片中黃芪甲苷的總含量[7-9]。因此,黃芪甲苷含量測定的結(jié)果與化學(xué)反應(yīng)過程中其衍生物轉(zhuǎn)化的程度直接相關(guān),復(fù)方石韋片供試品的制備方法是黃芪甲苷測定的關(guān)鍵?;亓鲏A化衍生法具有堿性、強(qiáng)堿化溫度高和堿化時間長的特點,預(yù)測此法可將黃芪甲苷衍生物完全轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷[10-12]。本研究在《中華人民共和國藥典2020年版(一部)》[6](以下簡稱《中國藥典》)方法基礎(chǔ)上采用回流堿化衍生法建立復(fù)方石韋片中黃芪甲苷含量測定方法,以期提供一種更準(zhǔn)確、簡便、高效的黃芪甲苷含量測定方法,同時為復(fù)方石韋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后續(xù)研究提供實驗依據(jù)。
1.1 儀器及試劑 Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀(蒸發(fā)光檢測器,Aglient);DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(泰斯特);XSE205DU十萬分之一電子分析天平(梅特勒—托利多)。乙腈(色譜純,美國Merck公司);甲醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);正丁醇(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);水為三級返滲超純水。
1.2 試藥 黃芪甲苷對照品(批號:110781-202118,濃度:96.8%),購于中國食品藥品檢定研究院;復(fù)方石韋片(批號:730391、830223、830040、830225、030470、030443、030471、030475、030574、030045、030469、030473、130030、130023、130066、130068)為頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。
2.1 色譜條件 色譜柱Agilent 5-HC C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙睛—水(34∶66),流速1.0 ml/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μl;蒸發(fā)光檢測器參數(shù):載氣流速1.6 L/min,漂移管溫度100 ℃,理論板數(shù)按照黃芪甲苷色譜峰計算應(yīng)≥4 000。
2.2 樣品
2.2.1 對照品溶液的制備:精密稱取黃芪甲苷對照品適量,用甲醇作為溶解劑進(jìn)行溶解,制成每1 ml含黃芪甲苷對照品200 μg的溶液,作為對照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備:取復(fù)方石韋片樣品適量,除去包衣,研磨成細(xì)粉,精密稱定2 g,放置于100 ml具塞錐形瓶中,精密加入含0.2%氫氧化鈉溶液的80%甲醇溶液50 ml, 密塞,稱重,加熱回流1 h,放冷,再次稱重,用含0.2%氫氧化鈉溶液的80%甲醇溶液補(bǔ)重,搖勻,濾過,移液管精密吸取續(xù)濾液25 ml,水浴蒸干,殘渣加20 ml的水溶解,再用水飽和的正丁醇萃取4次,每次20 ml,合并正丁醇萃取液,再次蒸干,殘渣用適量的甲醇充分溶解,移至5 ml的容量瓶中,用甲醇溶液定容至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過濾,即為供試品溶液。
2.2.3 陰性樣品溶液的制備:取復(fù)方石韋片組方中其他三味中藥按比例及工藝制備樣品,按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備成不含黃芪的陰性樣品溶液。
2.3 空白試驗 按照“2.1”項下色譜條件,分別精密吸取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項下的對照品、供試品、陰性樣品溶液,進(jìn)行色譜分析檢測,圖譜結(jié)果顯示,在此色譜條件下,黃芪甲苷峰形對稱,與相鄰色譜峰分離良好,陰性樣品對樣品檢測無干擾,見圖1。
A.對照品色譜圖
2.4 線性關(guān)系 取黃芪甲苷對照品適量,加甲醇制成2.043 mg/ml的對照品溶液。采用倍比稀釋法加甲醇分別制成1.021 5、0.510 75、0.204 3、0.051 07、0.020 43 mg/ml對照品溶液,按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣20 μl,以對照品峰面積的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X),以對照品進(jìn)樣質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性回歸方程為Y=0.788 6X-4.920 1,r=0.999 6。結(jié)果表明,黃芪甲苷在0.020 43~2.043 mg/ml范圍內(nèi),黃芪甲苷峰面積與黃芪甲苷進(jìn)樣質(zhì)量的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。
2.5 穩(wěn)定性試驗 取適量的復(fù)方石韋片樣品,按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,分別于0、2、4、6、8、10、12 h時進(jìn)樣分析測定,記錄圖譜并計算RSD值。結(jié)果顯示,黃芪甲苷峰面積的RSD值為2.7%,提示復(fù)方石韋片供試品溶液在12 h內(nèi)能保持穩(wěn)定。
2.6 重復(fù)性試驗 取適量同批次復(fù)方石韋片樣品(批號:730391),按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,記錄圖譜,計算樣品中黃芪甲苷含量及RSD值。結(jié)果顯示,本批復(fù)方石韋片黃芪甲苷的平均含量為704.8 μg/g,RSD值為1.7%,提示該方法重復(fù)性良好。
2.7 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下黃芪甲苷(0.202 4 mg/ml)對照品溶液,按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,記錄圖譜并計算RSD值。結(jié)果顯示,黃芪甲苷峰面積的RSD值為1.2%,提示儀器精密度符合要求。
2.8 加樣回收試驗 稱取9份已知含量的復(fù)方石韋片樣品(批號:730391),均分為3組,分別加入3組不同濃度的黃芪甲苷對照品溶液,按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,記錄圖譜,計算加樣回收率及RSD值,結(jié)果顯示,黃芪甲苷的平均加樣回收率為97.3%,RSD值為2.4%,回收率良好,見表1。
表1 加樣回收率試驗結(jié)果
2.9 檢測限 取標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗工作液中最低濃度的對照品溶液稀釋,按上述色譜條件進(jìn)樣,然后按倍數(shù)稀釋對照品溶液,測得信噪比為3∶1時,黃芪甲苷對照品溶液濃度為0.002 553 5 mg/ml,確定檢測限為0.051 07 μg。
2.10 定量限 取標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗工作液中最低濃度的對照品溶液稀釋,按上述色譜條件進(jìn)樣,然后按倍數(shù)稀釋對照品溶液,測得信噪比為10∶1時,黃芪甲苷對照品溶液濃度為0.001 02 mg/ml,確定定量限為0.020 43 μg。
2.11 樣品測定 取待測的16批復(fù)方石韋片樣品,按照上述方法制備供試品溶液,并按照上述色譜條件,按《中國藥典》[6]復(fù)方石韋片項下黃芪甲苷含量測定方法檢測,分別計算樣品含量。結(jié)果,采用回流堿化衍生法測得的16批復(fù)方石韋片樣品中黃芪甲苷含量為0.60~0.98 mg/g,平均值0.75 mg/g,采用藥典方法測得的16批復(fù)方石韋片樣品中黃芪甲苷含量為0.55~0.93 mg/g,平均值0.67 mg/g,同批次復(fù)方石韋片樣品采用回流衍生法的含量測定結(jié)果均略高于采用藥典方法的含量測定結(jié)果,見表2。
表2 復(fù)方石韋片樣品含量測定結(jié)果
3.1 色譜條件的優(yōu)化 參照相關(guān)文獻(xiàn)[13-15],考察不同的流動相體系及不同的流動相比例(乙腈—水、甲醇—水、乙腈—0.2%甲酸水溶液、甲醇—0.2%甲酸水溶液),經(jīng)比較采用結(jié)果顯示選用乙腈—水(34∶66)等度洗脫時,基線平穩(wěn),黃芪甲苷分離效果好。同時考察了不同的漂移管溫度(80、90、100 ℃)和不同的載氣體積流量(1.6、2.0、2.6 L/min),結(jié)果當(dāng)漂移管溫度100 ℃,載氣體積流量1.6 L/min時,待測色譜峰達(dá)到基線分離,色譜圖較理想。
3.2 采用不同提取溶劑進(jìn)行比較 參照相關(guān)文獻(xiàn)[16-20],本研究考察了不同提取液:80%甲醇溶液(含4%濃氨試液)、80%甲醇溶液(含10%濃氨試液)、80%甲醇溶液(含0.1%氫氧化鈉溶液)、80%甲醇溶液(含0.2%氫氧化鈉溶液)、80%甲醇溶液(含0.4%氫氧化鈉溶液),結(jié)果顯示采用80%甲醇溶液(含0.2%氫氧化鈉溶液)提取液可以把樣品提取完全。
3.3 采用不同量的提取溶劑進(jìn)行比較 本研究考察了不同提取液(含0.2%氫氧化鈉溶液的80%甲醇溶液)體積:25、50、100 ml,結(jié)果顯示提取液體積為50 ml與100 ml時測得樣品黃芪甲苷含量無明顯差別,且均高于提取液體積為25 ml時,說明加入50 ml的提取液已把樣品提取完全。
3.4 采用不同提取時間進(jìn)行比較 本研究考察了不同加熱回流時間:30、60、90 min,結(jié)果顯示加熱回流60 min與90 min時測得樣品黃芪甲苷含量無明顯差別,且均高于加熱回流30 min,說明提取時間為60 min時已把樣品提取完全。
綜上所述,本研究以藥典法測定復(fù)方石韋片中黃芪甲苷的原理為基礎(chǔ), 采用回流堿化衍生法建立的方法操作更加簡便、結(jié)果穩(wěn)定、黃芪甲苷衍生物轉(zhuǎn)化效率高、可重復(fù)性好,可用于測定復(fù)方石韋片中黃芪甲苷的含量,同時也為其他含黃芪制劑的質(zhì)量控制提供參考。
利益沖突所有作者聲明無利益沖突