涂永元

（國(guó)家燃香類產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（福建）永春縣產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建省香產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，福建 泉州 362600）

藏香是特產(chǎn)于我國(guó)藏族地區(qū)的燃香類產(chǎn)品，以其配料考究、工藝精良、歷史悠久，被列為“藏域三寶”之一。傳統(tǒng)制作的藏香是以柏木為主要原料，遵循藏醫(yī)理論，選用一定比例的檀香、麝香、木香、豆蔻、藏紅花等多種香藥與之混合后，再依特定制香工序，制成線香、末香、塔香等不同外形的藏香產(chǎn)品[1]。前期研究表明，藏香含有較多萜、烯、醇、酚類等多種揮發(fā)性化學(xué)成分，具備抗菌、抗病毒、驅(qū)蟲、調(diào)節(jié)免疫等潛在藥用價(jià)值，燃香使用時(shí)可用于安神助眠、預(yù)防疾病、凈化空氣[2]，是一種市場(chǎng)潛力廣闊的日用養(yǎng)生型產(chǎn)品。

然而，藏香這類燃香產(chǎn)品配料信息復(fù)雜且多由十幾味貴細(xì)藥材組成，其原材料市場(chǎng)混淆品眾多、魚龍混雜。一些制香生產(chǎn)者為攫取利潤(rùn)，會(huì)使用低廉化學(xué)合成類香精替代昂貴傳統(tǒng)植物源香料，化學(xué)成分信息尚不明確，技術(shù)上也長(zhǎng)期缺少有針對(duì)性的檢測(cè)手段和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，為遏制藏香產(chǎn)品低端化趨勢(shì)，避免藏香行業(yè)失范和監(jiān)管缺失，亟需開發(fā)一種適用于藏香產(chǎn)品鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法，以保證藏香產(chǎn)品品質(zhì)和監(jiān)管科學(xué)性，促使傳統(tǒng)藏香產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

目前，關(guān)于藏香的研究文獻(xiàn)主要集中于藏香中苯系物、甲醛、多環(huán)芳烴、重金屬元素等有毒有害物質(zhì)的分析評(píng)價(jià)[3-9]，而關(guān)于藏香原料中常見的特征性、功能性成分研究卻鮮有報(bào)道?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅地方標(biāo)準(zhǔn)DB54/T 0080-2014《藏香》規(guī)定[10]，樟腦、丁香酚、雪松醇、表木栓醇和木栓酮這5 種共有成分可用于鑒別藏香產(chǎn)品真?zhèn)危摲ň窒抻诓叵闾崛∥镏袔追N成分的定性分析，卻未能建立多種特征成分含量的測(cè)定方法。筆者經(jīng)前期多批次樣品研究，發(fā)現(xiàn)除上述共有成分外，藏香中還含有其他檢出頻率高、含量較多的成分，如土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯等可作為藏香特征成分研究使用?；谏鲜鲅芯?，本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助溶劑優(yōu)化提取藏香產(chǎn)品中樟腦、丁香酚、雪松醇、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、表木栓醇、木栓酮8 種化學(xué)成分，經(jīng)GC-MS 定性后，建立起GC-FID 定量測(cè)定的分析方法，以期為今后藏香產(chǎn)品品質(zhì)保證及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供有益借鑒和技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

7890B 型氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測(cè)器美國(guó)安捷倫公司）；7890B-5977B 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器 美國(guó)安捷倫公司）；CPA225D 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

樟腦、丁香酚、雪松醇、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、表木栓醇、木栓酮，純度均不小于96%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙醇，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；藏香樣品為產(chǎn)自西藏各地區(qū)的代表性產(chǎn)品，且均由西藏自治區(qū)標(biāo)準(zhǔn)化研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 稱取適量的8 種化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)品于20mL 容量瓶，用正己烷-丙酮混合溶液（V/V，1∶1，下同）稀釋、定容成含有以下8 種化學(xué)成分和濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：5mg·mL-1樟 腦、8.4mg·mL-1丁香酚、6.2mg·mL-1雪松醇、4.6mg·mL-1土木香內(nèi)酯、4.9mg·mL-1異土木香內(nèi)酯、4.05mg·mL-1去氫木香內(nèi)酯、2.2mg·mL-1表木栓醇、2.1mg·mL-1木栓酮。

分析前移取2mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液于10mL 容量瓶，以正己烷-丙酮混合溶液為稀釋溶劑定容，再分6 次逐級(jí)稀釋，每次稀釋2 倍，即取5mL的該濃度級(jí)別對(duì)照品溶液于另一10mL 容量瓶繼續(xù)稀釋定容，同法重復(fù)操作數(shù)次，稀釋后各目標(biāo)成分濃度為：樟腦的質(zhì)量濃度為15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1000.00μg·mL-1；丁香酚的質(zhì)量濃度為26.25、52.50、105.00、210.00、420.00、840.00、1680.00μg·mL-1；雪松醇的質(zhì)量濃度為19.38、38.75、77.50、155.00、310.00、620.00、1240.00μg·mL-1；土木香內(nèi)酯的質(zhì)量濃度為14.38、28.75、57.50、115.00、230.00、460.00、920.00μg·mL-1；異土木香內(nèi)酯的質(zhì)量濃度為15.31、30.63、61.25、122.50、245.00、490.00、980.00μg·mL-1；去氫木香內(nèi)酯的質(zhì)量濃度為12.66、25.31、50.63、101.25、202.50、405.00、810.00μg·mL-1；表木栓醇的質(zhì)量濃度為6.88、13.75、27.50、55.00、110.00、220.00、440.00μg·mL-1以及木栓酮的質(zhì)量濃度為6.56、13.13、26.25、52.50、105.00、210.00、420.00μg·mL-1。

1.2.2 樣品預(yù)處理及試樣溶液的制備 取20g 藏香樣品分別經(jīng)粉碎、過(guò)80 目篩處理后，稱取上述均勻樣品1g 于20mL 具塞刻度試管中，加入10mL 正己烷-丙酮混合溶液，設(shè)置超聲提取溫度為35℃，超聲功率為300W，超聲提取45min，再用0.22μm 尼龍有機(jī)濾膜過(guò)濾，取濾液5mL 并氮吹至溶液消失，精密量取1mL 正己烷-丙酮混合溶液再次溶解，試液供分析儀器檢測(cè)使用。

1.3 藏香產(chǎn)品中8 種化學(xué)成分定性分析

取10 批次藏香樣品，按1.2.2 項(xiàng)樣品預(yù)處理后的試樣溶液進(jìn)樣至GC-MS 儀器中，按文獻(xiàn)分析條件分析[7]，獲得各樣品總離子流色譜圖，所得質(zhì)譜圖經(jīng)與NIST 17.L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索、對(duì)照品保留時(shí)間比對(duì)，樣品中樟腦、丁香酚、雪松醇、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、表木栓醇、木栓酮檢出情況詳見表1，混標(biāo)對(duì)照溶液及典型藏香樣品總離子流色譜圖見圖1。

圖1 混標(biāo)對(duì)照溶液（A）及典型藏香樣品（B）總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of mixed standard reference solution（A）and typical Tibetan incense samples（B）

表1 樣品檢出目標(biāo)成分情況Tab.1 Detection of target compounds in samples

1.4 藏香產(chǎn)品中8 種化學(xué)成分含量的測(cè)定

1.4.1 GC-FID 分析條件

色譜條件 色譜柱為HP-5 型毛細(xì)管柱（30m×0.32mm，0.25μm），載氣為 N2（純度不小于99.999%），柱流量1.3mL·min-1；進(jìn)樣量1μL；進(jìn)樣口溫度260℃；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比為20∶1。

柱溫箱升溫程序 初始溫度40℃，保持3min，以20℃·min-1的速率升溫至250℃，保持5min，再以20℃·min-1的速率升溫至290℃，保持25min。FID 檢測(cè)器溫度290℃；尾吹氣流量25mL·min-1；H2流量30mL·min-1；空氣流量400mL·min-1。

1.4.2 校準(zhǔn)曲線的建立 分別取1.2.1 逐級(jí)稀釋后的混合對(duì)照品溶液，按1.4.1 分析條件分別進(jìn)樣至GC 儀器中分析，各對(duì)照品保留時(shí)間及色譜圖見圖2。以目標(biāo)成分質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。

圖2 對(duì)照品混合溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed solution of reference substance

1.4.3 測(cè)定成分的含量 取藏香樣品，按1.2.2 項(xiàng)樣品預(yù)處理后的試樣溶液，進(jìn)樣至GC 儀器中分析，測(cè)得各目標(biāo)成分的峰面積，代入相應(yīng)校準(zhǔn)曲線公式，得到待測(cè)樣品中各目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度，再根據(jù)公式（1）計(jì)算待測(cè)樣品中8 種目標(biāo)成分的含量Xi（μg·g-1）。

式中 f：稀釋倍數(shù)；Ci：校準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中目標(biāo)成分質(zhì)量濃度，μg·mL-1；V：1.2.2 步驟中最終樣品溶液體積數(shù)值，mL；mi：樣品重量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)器的使用

藏香成分多為揮發(fā)性有機(jī)物，目前，揮發(fā)有機(jī)物的研究多采用氣相色譜儀和氣相色譜質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，配置的檢測(cè)器分別為氫火焰離子化和質(zhì)譜檢測(cè)器兩種。本研究考察了氫火焰離子化和質(zhì)譜檢測(cè)器定量測(cè)定樟腦、丁香酚、雪松醇、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、表木栓醇、木栓酮8 種成分的差異，二者均可實(shí)現(xiàn)藏香中8 種成分的準(zhǔn)確定量分析。相比氫火焰離子化檢測(cè)器，質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度高但濃度范圍較窄，當(dāng)樣品濃度過(guò)高時(shí)易產(chǎn)生信號(hào)飽和、色譜峰峰形不佳、樣品數(shù)據(jù)交叉污染現(xiàn)象，這將影響定量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，因而選用質(zhì)譜檢測(cè)器用于定性特征成分的分析更有優(yōu)勢(shì)?？紤]到藏香原料基質(zhì)成分較為復(fù)雜，目標(biāo)成分在天然產(chǎn)物中同分異構(gòu)體眾多，且目標(biāo)成分在實(shí)際樣品中含量差異較大，為提高對(duì)藏香中8 種化學(xué)成分定性定量結(jié)果的準(zhǔn)確性、適用性及針對(duì)性，因而采用以質(zhì)譜檢測(cè)器定性、氫火焰離子化檢測(cè)器定量相結(jié)合的方法進(jìn)行分析。

2.2 超聲萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 向空白的藏香樣品基質(zhì)中加入含有8 種成分的混合對(duì)照液，以該加標(biāo)樣品為研究對(duì)象，分別以正己烷-丙酮混合液、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、乙醇6 種有機(jī)溶劑為提取溶劑，固定其他條件不變，考察不同有機(jī)溶劑對(duì)上述目標(biāo)成分的提取效果，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溶劑對(duì)8 種目標(biāo)成分回收率的影響Fig.3 Effect of extraction solvent on recovery rate of 8 target compounds

由圖3 可見，采用正己烷-丙酮混合液提取8 種化合物回收率最優(yōu)，為94.0%～104.3%，提取力較強(qiáng)。因此，選擇正己烷-丙酮混合溶液為提取溶劑。

2.2.2 超聲提取時(shí)間的優(yōu)化 固定其他條件不變，以加標(biāo)樣為研究對(duì)象，分別考察5、15、30、45、60min超聲提取時(shí)間對(duì)回收率的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著超聲時(shí)間的增加，8 種化合物回收率趨于增加，其中樟腦、丁香酚、雪松醇、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯6 種化合物回收率在30min 后趨于穩(wěn)定，而表木栓醇、木栓酮2 種化合物回收率則在超聲45min 時(shí)達(dá)到最大，此時(shí)8 種化合物回收率為95.3%～108.0%，但當(dāng)超聲時(shí)間為60min 時(shí)，8 種化合物回收率均出現(xiàn)下降，因此，選擇超聲時(shí)間為45min 最適宜。

2.2.3 超聲提取溫度的優(yōu)化 固定其他條件不變，以加標(biāo)樣為研究對(duì)象，分別考察25、35、40、45℃超聲溫度對(duì)回收率的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著超聲溫度的增加，8 種化合物回收率趨于增加，其中樟腦、丁香酚、雪松醇、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯6 種化合物在45℃時(shí)回收率達(dá)到最大，表木栓醇、木栓酮兩種化合物回收率則隨著溫度的升高先升后降，在35℃時(shí)，表木栓酮回收率達(dá)到最大，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，各目標(biāo)成分回收率趨于穩(wěn)定，此時(shí)各化合物回收率在97.5%～104.0%之間，考慮溫度升高可能對(duì)表木栓醇、木栓酮兩種萜類化合物影響較大，且長(zhǎng)時(shí)間加熱容易導(dǎo)致丙酮、正己烷有機(jī)溶劑揮發(fā)，因此，選擇超聲溫度為35℃。

2.2.4 提取功率的優(yōu)化 固定其他條件不變，以加標(biāo)樣為研究對(duì)象，分別考察超聲功率為200、300、400、500W 對(duì)回收率的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超聲功率為200～400W 時(shí)，8 種化合物回收率趨于相同，超聲功率為500W 時(shí)，8 種化合物回收率均較低，為保證8 種化合物穩(wěn)定提取，選擇超聲功率為300W 較為適宜，此時(shí)各化合物回收率在95.9%～105.3%之間。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系和檢出限 分別以目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2），以3倍信噪比（S/N）計(jì)算各成分檢出限（3S/N），以10 倍信噪比計(jì)算方法各成分定量限（10S/N），結(jié)果見表2。

表2 藏香中8 種化合物的線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限Tab.2 Linear relationship,limit of detection（LOD）and limit of quantification（LOQ）of eight kinds of compounds in Tibetan incense

由表2 可見，校準(zhǔn)工作曲線線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9981，檢出限在0.53～15.75μg·mL-1之間，定量限為1.76～52.50μg·mL-1，表明本測(cè)定方法在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)靈敏度較高。

2.3.2 精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 按照上述方法在空白樣品中添加4 個(gè)濃度水平，分別對(duì)其進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平重復(fù)進(jìn)樣7 次，計(jì)算回收率和實(shí)際測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=7）Tab.3 Results of tests for precision and recovery（n=7）

由表3 可見，8 種目標(biāo)物的回收率為96.3%～107.5%，測(cè)定值的RSD 為0.32%～5.2%，滿足實(shí)際分析要求。

2.3.3 實(shí)際樣品測(cè)定 取10 批藏香樣品，按照1.2.2 項(xiàng)方法提取并獲得試樣溶液，依1.4.1 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，采用1.4.3 項(xiàng)中式（1）分別計(jì)算藏香8 種目標(biāo)成分含量，結(jié)果見表4。

表4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of actual samples

由表4 可見，10 批樣品中樟腦僅一批次檢出，其余物質(zhì)均不同程度地被檢出，檢出情況與表1 氣相色譜-質(zhì)譜法定性結(jié)果基本一致；其中，平均檢出含量較高的物質(zhì)為表木栓醇、丁香酚和土木香內(nèi)酯，其平均含量分別可達(dá)455.60μg·g-1、450.71μg·g-1和322.48μg·g-1。

典型樣品（S07）的色譜圖見圖4。

圖4 典型樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of typical sample

3 結(jié)語(yǔ)

建立了同時(shí)分析藏香中8 種化學(xué)成分的GCFID 定量方法。通過(guò)優(yōu)化樣品預(yù)處理方法、超聲條件及儀器方法，使其前處理操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，定性定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠、適用性強(qiáng)，方法具有良好的回收率、精密度。該方法可以用于實(shí)際藏香樣品中特征成分的測(cè)定和快速分析。