關寶生,張睿迪,王 賀,閆茹雪,秦振波,于瀚普,趙梓源,尹相林

(1. 佳木斯大學公共衛(wèi)生學院,黑龍江 佳木斯 154007;2. 黑龍江省痛風研究重點實驗室,黑龍江 佳木斯 154007)

嘌呤本身并不是營養(yǎng)素,它是DNA或者RNA的組成部分,是以嘌呤核苷酸的形式存在于真核生物的細胞核、細胞質和線粒體中的一種物質。因此,任何真核細胞的天然食物中都含有大量的嘌呤。攝入體內的嘌呤首先會轉化為次黃嘌呤,次黃嘌呤在黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase, XOR)的作用下轉化為黃嘌呤,最后黃嘌呤在XOR的作用下轉變成尿酸(uric acid, UA),由于人體內缺乏尿酸氧化酶,不能將UA代謝成尿囊素排出體外,因此UA是人體內嘌呤代謝的終產(chǎn)物,最終經(jīng)由腎臟以尿液的形式排出體外[1]。一旦腎臟排泄UA的能力下降或者是UA生成過多,就會發(fā)展成為高尿酸血癥,甚至發(fā)展為痛風。絕大多數(shù)痛風患者都表現(xiàn)為腎臟對尿酸鹽的清除率下降。近年來的研究發(fā)現(xiàn),UA可能通過其抗氧化活性來調節(jié)生殖信號傳導和胰島素/IGF-1信號傳導(IIS)通路[2,3]。在中國成人Ⅱ型糖尿病患者中,UA與IGF-1存在非線性關系,當UA水平達到拐點時,IGF-1水平與UA的增加呈負相關[4]。但UA在生長發(fā)育中的具體機制尚不明確,因此本研究旨在探討高嘌呤飲食對果蠅生長發(fā)育的影響,為今后UA在生長發(fā)育中具體機制的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 果蠅品系及飼養(yǎng)條件

本研究選用W1118野生型黑腹果蠅,由佳木斯大學尿酸生理功能研究團隊自有,均使用標準玉米粉培養(yǎng)基飼養(yǎng)。在溫度(25±0.5)℃、濕度(40±0.5)%、光照周期為12h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實驗試劑

腺嘌呤購于北京索萊寶生物科技有限公司,酵母購于英聯(lián)馬利(英國聯(lián)合食品集團),丙酸購于美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

分別稱取表1中的試劑(除丙酸以外)于燒杯中攪拌均勻,置于高壓鍋中蒸煮25min,待冷卻至60～70℃時加入丙酸以及相對應的腺嘌呤粉末(對照組為0%;低濃度干預組為0.05%;高濃度干預組為0.1%),攪拌均勻后倒至準備好的各實驗組果蠅管中備用,見表1。

表1 培養(yǎng)基配方

1.3.2 果蠅成蟲壽命的檢測

取新產(chǎn)出的果蠅卵若干,分別置于對照組、低濃度干預組、高濃度干預組3組培養(yǎng)基中培養(yǎng),取羽化后8h以內的果蠅,每組200只(雌雄各100只),按性別隨機分到8個管中,雌雄各4管、每管25只,分別在各實驗組對應培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每天同一時間觀察果蠅的死亡情況,實驗重復3次取平均值。

1.3.3 果蠅成蟲攀爬能力的檢測

各實驗組取羽化后8h以內的果蠅,每組150只(雌雄各75只),按性別隨機分到6個管,雌雄各3管、每管25只,分別在各實驗組對應培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)課題組前期預實驗,設定本次實驗周期為15d,在培養(yǎng)至第15d后進行攀爬能力的檢測,爬行能力測試標準線為8cm、時間5s。

1.3.4 果蠅成蟲產(chǎn)卵量的檢測

取各實驗組羽化后8h以內的果蠅,在各實驗組對應培養(yǎng)基中培養(yǎng),15d后進行產(chǎn)卵量的檢測。將各組果蠅以雌:雄=1:3的比例放入灑滿酵母的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,然后收集并記錄瓊脂培養(yǎng)基中果蠅卵的數(shù)量,每組設10個平行對照。

1.3.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各實驗組果蠅成蟲的生存情況

與對照組相比,在雌果蠅中,各干預組果蠅的生存率無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在雄果蠅中,低濃度干預組果蠅的生存率明顯降低,而高濃度干預組果蠅的生存率明顯上升,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2、3,圖1。

圖1 各實驗組果蠅生存率的變化情況

表2 各實驗組雌果蠅成蟲的生存率(n, %)

表3 各實驗組雄果蠅成蟲的生存率(n, %)

2.2 各實驗組果蠅成蟲的平均壽命

與對照組比較,隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的升高,各干預組果蠅平均壽命明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01);雌果蠅的平均壽命明顯高于雄果蠅,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表4,圖2～4。

圖2 各實驗組果蠅的平均壽命

圖3 各實驗組雌果蠅的生存分析

圖4 各實驗組雄果蠅的生存分析

表4 各實驗組果蠅的平均壽命

2.3 各實驗組果蠅成蟲攀爬能力的變化情況

與對照組相比,低濃度干預組果蠅的攀爬能力有所降低,但其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),高濃度干預組果蠅的攀爬能力明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表5、6,圖5。

圖5 各實驗組果蠅攀爬能力的變化情況

表5 各實驗組雌果蠅成蟲的攀爬情況

表6 各實驗組雄果蠅成蟲的攀爬情況

2.4 各實驗組果蠅成蟲產(chǎn)卵量的變化情況

與對照組比較,隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的升高,各干預組果蠅的產(chǎn)卵量明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表7,圖6。

圖6 各實驗組果蠅產(chǎn)卵量的變化情況

表7 各實驗組果蠅產(chǎn)卵量的變化情況

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn),UA與生長發(fā)育有一定的相關性[5]。UA作為人體內嘌呤核苷酸代謝的終產(chǎn)物,當體內血清UA水平維持在正常偏低的水平時,UA可能會發(fā)揮其抗氧化的作用,延緩認知衰退,改善神經(jīng)退行性疾病[6,7],而過高濃度的血清UA水平可能會發(fā)揮其促氧化的作用,進而誘發(fā)糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)生發(fā)展[8-10]。目前研究發(fā)現(xiàn),活性氧(ROS)可能通過直接破壞線粒體DNA(mtDNA)或者導致線粒體功能障礙,進而誘發(fā)細胞衰老[11,12]。但UA是否能通過刺激ROS的產(chǎn)生從而影響生長發(fā)育及其具體機制尚未明確。

本研究結果顯示,在高嘌呤飲食的干預下,各干預組果蠅羽化后的平均壽命明顯縮短,提示高嘌呤飲食干預可能誘導果蠅體內UA生成過多以至于超過自身的代償能力,從而影響機體內的正常代謝,縮短果蠅的壽命。在同一濃度腺嘌呤干預下,雌果蠅的平均壽命明顯高于雄果蠅,提示在果蠅體內雌激素可能抵消掉了一部分UA產(chǎn)生的不利影響。此前的流行病學數(shù)據(jù)也驗證了這一現(xiàn)象,絕經(jīng)前期的女性與男性比較,更不容易罹患高尿酸血癥以及腎臟疾病,這可能與17β-雌二醇(E2)密切相關[13]。研究發(fā)現(xiàn)ROS可能通過直接調節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元的興奮性來影響生育能力[14]。而本研究結果顯示,高嘌呤飲食對果蠅的產(chǎn)卵量有明顯的抑制作用。提示可能是果蠅體內生成過多的UA誘導ROS調節(jié)GnRH來影響生育能力。根據(jù)以往研究顯示,高水平的血清UA可能會誘發(fā)炎癥反應,導致炎癥因子生成過多,刺激中性粒細胞誘導氧化應激損傷,影響肌腱等組織,從而導致果蠅的運動能力的下降[15]。本研究結果顯示,隨著培養(yǎng)基中腺嘌呤濃度的升高,各實驗組果蠅攀爬能力逐漸下降。也有研究顯示,長期雌激素剝奪會導致大鼠的運動障礙[16],而本次研究中高嘌呤飲食誘導的果蠅運動能力減弱是否與雌激素有關還需進一步研究。

綜上所述,本次研究結果顯示,高嘌呤飲食能明顯抑制果蠅的生長發(fā)育,為研究UA與衰老之間的相關關系提供了理論依據(jù)。接下來我們將進一步探討UA影響果蠅生長發(fā)育的具體機制,以及雌激素在其中發(fā)揮了何種作用,為揭示尿酸的生理功能提供新的方向。