陳穎聰 屠艷燁 高暉 陳鑫偉 茹雯哲 楊象未 應(yīng)丹央

肺炎克雷伯菌常引起多種機會性感染疾病[1-2]，根據(jù)其毒力特點和拉絲實驗可分為經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella pneumoniae，cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP）。與cKP 相比，hvKP 具有高黏液表型且易引起多部位膿腫[3]，能在免疫功能正?；虻拖碌娜巳褐幸鹎忠u性感染，如社區(qū)獲得性原發(fā)肝膿腫、骨髓炎和壞死性筋膜炎等，致死率達3%～42%[4]；所致的社區(qū)獲得性肺炎合并血流感染病死率高達5%，患者還易出現(xiàn)多個感染部位轉(zhuǎn)移傳播傾向，且發(fā)生多器官功能衰竭的風險明顯高于其他類型社區(qū)獲得性肺炎[5]。目前國內(nèi)hvKP 的檢出率呈逐年上升趨勢[6-7]。因此，本研究收集了96 株對常規(guī)抗菌藥物全敏感的肺炎克雷伯菌，從高黏液表型、莢膜血清分型、毒力基因及ST分型等方面進行分析研究，為臨床及時發(fā)現(xiàn)hvKP、遏制侵襲性感染并給予合理治療提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 菌株來源 收集2022 年1 至12 月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院臨床分離的96 株全敏感肺炎克雷伯菌，采用VITEK-2 Compact 全自動微生物分析儀對收集的菌株進行鑒定和體外藥敏試驗，質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC25922）和陰溝腸桿菌（ATCC700323）購自溫州康泰有限公司。本研究經(jīng)寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過（批準文號：李惠利醫(yī)院倫申2022 研第390 號）。

1.2 儀器及試劑 2×Taq Master Mix 擴增反應(yīng)液、Ultra GelRed 核酸染液購自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂粉購自上海生工生物工程有限公司；哥倫比亞血平板、MH 平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；PCR 儀（型號：MG96G）購自杭州朗基科學儀器有限公司；電泳儀購自美國Bio-Rad 公司；生物光化學成像系統(tǒng)（型號：ChemiQ 3650）購自上海歐翔科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高黏液表型的篩選 將96 株實驗菌株接種于哥倫比亞血平板中，CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)過夜，次日用接種環(huán)挑起單一菌落，重復(fù)牽拉3 次，若2 次挑起形成黏液絲且長度≥5 mm，則判定為高黏液表型陽性，即該株為高黏液表型肺炎克雷伯菌。

1.3.2 細菌DNA 模板的制備 將37 ℃過夜培養(yǎng)的菌株，從哥倫比亞血平板上挑取單個新鮮菌落置于含250 μL 滅菌蒸餾水的EP 管中，震蕩混勻后100 ℃高溫金屬浴加熱煮沸10 min，然后置于4 ℃冰塊中冷凍10 min，反復(fù)3 次，經(jīng)相對離心力13 800 g 低溫高速離心10 min 后吸取上清液至滅菌EP 管中，DNA 模板保存于-20 ℃冰箱。

1.3.3 菌株莢膜血清分型 采用PCR 方法篩選所有肺炎克雷伯菌6 種常見莢膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57）；并對篩選出的肺炎克雷伯菌7 個管家基因（rpoB、gapA、infB、mdh、pgi、phoE、tonB）進行多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）。

1.3.4 菌株毒力基因檢測 用PCR 方法檢測毒力基因包括莢膜生成調(diào)節(jié)基因（rmpA、magA），鐵載體基因（entB、ybtS、kfu、irp-1、fyuA、irp-2、aerobactin、repA），菌毛定值與黏附基因（ycfM、mrkD、fimH、kpn），尿囊素代謝基因（allS、ureA、uge），脂多糖形成相關(guān)基因（wabG、wcaG）及pLVPK-like 毒力質(zhì)粒基因（rmpA2、pagO、iroB、icuA、terB、sills），擴增引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，具體見表1。PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板3 μL，上下游引物各1 μL，Tag 酶10 μL，加ddH2O 至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。

表1 hvKP常見的毒力基因引物

1.3.5 PCR 擴增產(chǎn)物電泳 電壓110 V，電泳時間20 min。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀拍攝電泳圖，并將目的條帶送至上海生工生物工程股份有限公司測序驗證。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件及Graphpad Prism 8.0 作圖軟件。計量資料以表示；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株來源以及患者基本臨床資料 收集的96 株全敏感肺炎克雷伯菌來自男性患者65 例，女性患者31例，年齡24～87（64.0±14.5）歲。標本類型分別為痰液65 株（占67.71%）、尿液7 株（占7.29%）、膽汁6 株（占6.25%）、血液5 株（占5.21%）、穿刺液5 株（占5.21%）、引流液3 株（占3.13%）、肺泡灌洗液2 株（占2.08%）、糞便1 株（占1.04%）、靜脈導(dǎo)管1 株（占1.04%）及其他類型1 株（占1.04%）。標本來源的病區(qū)分布以ICU 為主25 株（占26.08%），其次為呼吸內(nèi)科12株（占12.50%）、神經(jīng)外科11 株（占11.46%）、肝膽外科10 株（占10.42%）、胸外科9 株（占9.38%）、放療科5 株（占5.21%）、感染科4 株（占4.17%），此外風濕免疫科、急診科、血管介入科、門診、腎內(nèi)科均檢出3 株（占3.13%）以及其他科室5 株（占5.21%）。

2.2 肺炎克雷伯菌的莢膜血清型 96 株全敏感肺炎克雷伯菌中莢膜型K1（14 株，占14.58%）、K2（23 株，占23.96%）、K5（14 株，占14.58%）、K57（12 株，占12.50%）、K20（1 株，占0.01%）、K54（2 株，占0.02%）、未分型（30 株，占31.25%）。高黏液表型組中以K2 莢膜血清型為主（χ2=7.923，P=0.005），非高黏液表型組以未分型血清型為主（χ2=20.570，P＜0.001）。此外，痰液作為臨床主要的樣本來源，肺炎克雷伯菌的莢膜血清型在痰液與非痰液標本中的分布差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 菌株的莢膜血清型分析（株）

2.3 肺炎克雷伯菌的毒力基因攜帶情況 高黏液表型組肺炎克雷伯菌的鐵載體基因ybtS、菌毛定值與黏附基因ycfM 以及pLVPK-like 毒力質(zhì)粒pagO 基因的攜帶率均為100.00%，同時常見的毒力基因莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因（rmpA），鐵載體基因（irp-1、fyuA、irp-2、aerobactin、repA），菌毛定值與黏附基因（mrkD），脂多糖形成相關(guān)基因（wabG）及pLVPK-like 毒力質(zhì)?；颍╮mpA2、iroB、icuA、terB、sills）的攜帶率均高于非高黏液表型組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。且發(fā)現(xiàn)96 株中攜帶pLVPK-like 毒力質(zhì)粒（rampA2、pagO、iroB、icuA、terB、sills 基因均陽性）33 株，占34.38%，莢膜血清型以K1、K2、K57 為主，占比為87.88%（29/33）；其中高黏液表型27 株，非高黏液表型6 株，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.361，P＜0.001）。

表3 肺炎克雷伯菌株的毒力基因攜帶情況

2.4 肺炎克雷伯菌管家基因的MLST 96 株肺炎克雷伯菌MLST 包括25 種ST 型別，其中ST23 47 株（占48.96%），ST25 9 株（占9.38%），ST65、ST412、ST1049 均5 株（各占5.21%），ST86 3 株（占3.12%），其余19 種ST型別均≤2 株；高黏液表型組中檢出16 種ST 型別，其中ST23 22 株（占40.00%），ST25 7 株（占12.73%），ST65、ST1049 各5 株（各占9.09%），ST412 有4 株（占7.27%），其余11 種ST 型別均≤2 株；非高黏液表型組中檢出15種ST 型別，其中ST23 25 株（占60.98%），ST25、ST86 均2 株（各占4.88%），其余11 種ST 型別均≤1 株，見圖1（插頁）。統(tǒng)計顯示，兩組均以ST23 型為主要MLST 分型，但非高黏液表型組的ST23 型檢出率高于高黏液表型組，兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.136，P=0.042）。

圖1 肺炎克雷伯菌管家基因的MLST 分型結(jié)果分析

3 討論

本研究96 例全敏感肺炎克雷伯菌感染患者中，標本以痰液為主且多發(fā)于ICU 科室，這與國內(nèi)Li 等[8]文獻報道結(jié)果類似，可能與醫(yī)院ICU 危重患者多、有創(chuàng)性操作多及抗生素長期使用有關(guān)。在莢膜多糖血清分型上，相比較于cKP，hvKP 菌體莢膜明顯增厚并形成保護屏障，導(dǎo)致其對宿主免疫效應(yīng)的抵抗能力增加，致病性增強，也是造成該菌高毒力特征的重要原因[9]。根據(jù)莢膜多糖K 抗原的不同，本研究檢測了常見的莢膜血清型，統(tǒng)計顯示K1、K2、K5、K20、K54、K57型陽性的高毒力莢膜血清型肺炎克雷伯菌的檢出率為68.75%，其中K1、K2 和K57 是主要的莢膜型，相比于其他莢膜血清型，K1、K2 型肺炎克雷伯菌對中性粒細胞的抗吞噬和細胞內(nèi)抗殺傷作用明顯強于非K1、K2 型[10-11]，因此寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院院內(nèi)K1、K2 莢膜血清型肺炎克雷伯菌的流行率較高且毒性較強。此外，本研究中高黏液表型肺炎克雷伯菌以K2 莢膜血清型為主，大部分研究表明高黏液表型的肺炎克雷伯菌更易引起侵襲性感染且病情嚴重，這對臨床治療來說是極大的挑戰(zhàn)[12-13]。本研究還篩選出K57 血清莢膜型肺炎克雷伯菌的促莢膜形成相關(guān)rmpA 基因均為陽性且均顯示高黏液表型，這與沈定霞等[14]研究結(jié)果一致。在MLST 分型上，本研究中非高黏液表型肺炎克雷伯菌ST23 型的檢出率高于高黏液表型，但均以ST23 為主要流行表型，其次為ST25 型、ST86 型，雖然ST 分布存在地域差別，其中ST23 型得益于其強毒力及致病特點，已成為全球較為常見的流行型別[15]，本研究也同樣證實ST23 為我國東部地區(qū)肺炎克雷伯菌的流行表型[16]。

肺炎克雷伯菌均攜帶多種毒力基因，其中高黏液表型肺炎克雷伯菌的鐵載體基因ybtS、菌毛定值與黏附基因ycfM 以及pLVPK-like 毒力質(zhì)粒pagO 基因的攜帶率均為100.00%，同時莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因（rmpA）、鐵載體基因（irp-1、fyuA、irp-2、aerobactin、repA）、菌毛定值與黏附基因（mrkD）、脂多糖形成相關(guān)基因（wabG）及pLVPK-like 毒力質(zhì)?；颍╮mpA2、iroB、icuA、terB、sills）的攜帶率均高于非高黏液表型。Bakhtiari 等[17]研究證明rmpA 基因的高表達不僅可促進細菌生物膜形成，還與抗菌藥物耐藥性密切相關(guān)；Huang 等[18]和藍嵐等[19]研究證明鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)基因irp-1、irp-2 可促進細菌與宿主競爭性利用鐵；杜玲等[20]發(fā)現(xiàn)作為耶爾森菌素的受體的fyuA 基因是強毒力島HPI 基因簇的核心基因之一，可提高細菌致病性；另外還有相關(guān)文獻報道fyuA 基因與腸桿菌屬細菌毒力相關(guān)[21]；Li 等[22]還證實aerobactin 基因介導(dǎo)的鐵獲取有助于鐵限制條件下的細菌生長，此外aerobactin 基因還在生物膜形成、抗氧化應(yīng)激、活性氧去除和Y 毒力中也起重要作用；而wabG 的突變?nèi)笔?，使細菌失去保留囊膜結(jié)構(gòu)的能力，會降低細菌致病力[23]。此外，研究中統(tǒng)計顯示全敏感高黏液表型的肺炎克雷伯菌毒力質(zhì)粒pLVPK-like 攜帶量較高，占比達34.38%，隨著pLVPK-like 毒力質(zhì)粒的不斷進化，其在高毒力肺炎克雷伯菌的致病中發(fā)揮重要作用并能直接增強肺炎克雷伯菌的毒力[24-25]，這將為后期著重探索pLVPK-like 毒力質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移機制，研究高毒力耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌獲得毒力質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移機制奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，高黏液表型肺炎克雷伯菌毒力基因的高攜帶率及其攜帶差異，更能夠證實高黏液表型肺炎克雷伯菌的高致病性，但目前具體感染機制尚未完全闡明，有待后續(xù)研究。與此同時本研究發(fā)現(xiàn)ST23 型高毒力肺炎克雷伯菌的傳播，提示臨床工作中應(yīng)積極監(jiān)測抗生素的應(yīng)用和耐藥質(zhì)粒的傳播，對院內(nèi)感染進行有效的預(yù)防和控制[26]，以防高黏液全敏感肺炎克雷伯菌在抗生素選擇壓力下獲得耐藥質(zhì)粒成為“超級細菌”，對公眾健康問題造成更大的威脅。