譚志梅　王晨戍　王淑培　杭方學(xué)　張靜　黃曉菲

摘要：桂花色素是一種性能優(yōu)良的天然色素，在食品加工工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。試驗(yàn)以浦城桂花為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了桂花品種、乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間、液料比對(duì)桂花色素得率的影響，進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝。同時(shí)通過(guò)牛津杯法驗(yàn)證提取的桂花色素對(duì)7種菌株（4株細(xì)菌，2株絲狀真菌，1株酵母菌）的抑菌效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲輔助法提取桂花色素的最佳提取條件為乙醇濃度60%、液料比25∶1 （mL/g）、超聲功率200 W、超聲時(shí)間30 min，在此條件下，桂花色素的得率最高，達(dá)到61.56%。此外，抑菌試驗(yàn)證實(shí)桂花色素對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌、釀酒酵母具有顯著的抑制作用，而對(duì)桔青霉和米曲霉的抑制效應(yīng)相對(duì)較弱。

關(guān)鍵詞：桂花；色素；超聲波；響應(yīng)面分析法；抑菌效應(yīng)

中圖分類號(hào)：TS264.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2024）01-0177-06

Analysis of Ultrasonic-Assisted Extraction Process and Antibacterial Effect of Osmanthus fragrans Pigment

TAN Zhi-meiWANG Chen-shuWANG Shu-pei2*， HANG Fang-xue ? ZHANG Jing3， HUANG Xiao-fei3

Abstract： Osmanthus fragrans pigment is a kind of natural pigment with excellent performance， which has broad application prospect in the food processing industry. In this test， with Pucheng Osmanthus fragrans as the raw material， the effects of Osmanthus fragrans varieties， ethanol concentration， ultrasonic power， ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of Osmanthus fragrans pigment are investigated by single factor test， and the extraction process is further optimized by response surface test. At the same time， Oxford cup method is used to verify the antibacterial effects of Osmanthus fragrans pigment on seven strains （including four strains of bacteria， two strains of filamentous fungi and one strain of yeast）. The results show that the optimal extraction conditions of Osmanthus fragrans pigment by ultrasonic-assisted extraction method are ethanol concentration of 60%， liquid-solid ratio of 25∶1 （mL/g）， ultrasonic power of 200 W and ultrasonic time of 30 min. Under these conditions， the yield of Osmanthus fragrans pigment is the highest， reaching 61.56%. In addition， in the antibacterial test， it is confirmed that the Osmanthus fragrans pigment has significant inhibitory effects on Bacillus subtilis， Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Micrococcus luteus and Saccharomyces cerevisiae， while the inhibitory effects on Penicillium citrinum and Aspergillus oryzae are relatively weaker.

Key words： Osmanthus fragrans； pigment； ultrasonic wave; response surface analysis methodology； antibacterial effect

桂花（Osmanthus fragrans （Thunb.） Lour.），又名木犀、巖桂、九里香等，屬木犀科植物，原產(chǎn)于我國(guó)西南部，主要分布于中亞熱帶和北亞熱帶地區(qū)[1-2]。桂花品類繁多，且富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、花青素等，在世界上被稱為“全營(yíng)養(yǎng)食品”[3-4]。桂花除用以鑒賞外，在化妝品、食品調(diào)香、藥品、天然色素提取等領(lǐng)域也有極廣闊的應(yīng)用前景[5-8]。隨著人們生活水平的不斷提高，天然植物色素受到廣泛的關(guān)注，天然色素不僅安全性高，而且具有一定營(yíng)養(yǎng)和保健作用。因此，開(kāi)發(fā)和使用天然色素逐漸成為發(fā)展趨勢(shì)[9]。桂花色素因色調(diào)鮮明亮麗、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)被視為品質(zhì)優(yōu)良的色素提取來(lái)源，除了可用于食品著色外，還具有一定的藥用價(jià)值，劉東陽(yáng)等[10]研究表明，桂果中提取的色素性能穩(wěn)定，具有一定的抗氧化活性，可作為天然色素資源應(yīng)用于食品領(lǐng)域；黃玲艷[11]以金桂花為原料，研究發(fā)現(xiàn)桂花提取物具有較好的抗氧化活性和抗衰老作用；馬森等[12]用石油醚從桂花中提取色素，結(jié)果表明桂花色素可顯著清除亞硝酸鹽；李志洲等[13]對(duì)桂花色素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)提取出的桂花色素在酸性條件下較穩(wěn)定，常見(jiàn)的食品添加劑及抗氧化劑對(duì)其穩(wěn)定性的影響不大。溶劑提取法、浸漬壓榨提取法、酶反應(yīng)提取法、微生物發(fā)酵法等都是傳統(tǒng)的天然色素提取方法，為了更好地提取及利用色素，微波輔助提取、超聲輔助提取、分子蒸餾萃取等方法也被廣泛研究應(yīng)用[14-16]。浦城縣位于福建省最北部，栽培桂花歷史悠久，品種多樣，全縣現(xiàn)有桂花林面積1 333 hm2以上，年產(chǎn)鮮桂花3×105 kg，綜合利用潛力巨大[17-18]。本試驗(yàn)以浦城縣5種主要桂花品種浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂為原料，采用超聲輔助法從中提取天然食用色素，旨在選取色素提取率最高的桂花品種，并進(jìn)一步優(yōu)化工藝，提高色素產(chǎn)量；同時(shí)研究桂花色素提取物對(duì)代表性細(xì)菌和真菌的抑制效應(yīng)，以期為桂花天然食用色素的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、大腸埃希菌（Escherichia coli，ATCC25922）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus，ATCC49732）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，ATCC9763）、桔青霉（Penicillium citrinum，ATCC9849）、米曲霉（Aspergillus oryzae，ATCC42149）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉、氯化鈉（AR）：上海展云化工有限公司；無(wú)水乙醇（AR）：三明市三圓化學(xué)試劑有限公司；浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂干花：浦城縣木樨園營(yíng)養(yǎng)食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHZ-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；UV-3200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；2XZ-2旋片式真空泵 臺(tái)州市椒江宏興真空設(shè)備廠；YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZD-85恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司；LRH-150F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 桂花色素提取液的制備

準(zhǔn)確稱取1.000 g桂花粉置于燒杯內(nèi)，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的液料比（mL/g）加入乙醇溶液（體積比），移入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，在一定的超聲功率、超聲時(shí)間下進(jìn)行桂花色素提取。對(duì)提取后的浸提液進(jìn)行抽濾（－0.1 MPa），將抽濾后的提取液移入臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中進(jìn)行離心（4 ℃，4 500 r/min，15 min），棄去沉淀后即得到桂花色素提取液。

1.3.2 桂花色素粗提物的制備

將上述提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮（55 ℃，－0.1 MPa），濃縮至黏稠狀。將黏稠狀的濃縮液置于真空干燥箱中干燥（60 ℃）至恒重，即獲得桂花色素粗提物[19]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考劉婭涵等[20]的方法，稱取0.110 g桂花色素粗提物，加入少量60%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以60%乙醇定容至刻度線，搖勻，得到1 000 μg/mL的桂花色素母液。用移液管分別移取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL的桂花色素溶液于100 mL容量瓶中，分別用60%乙醇定容至刻度線，搖勻，得到濃度分別為5，10，15，20，25，30，35，40 μg/mL的桂花色素工作液。以60%乙醇溶液調(diào)零，在保護(hù)層波長(zhǎng)330 nm下測(cè)定其OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.116x－0.001（R2=0.999 8）。

1.4.2 得率的計(jì)算

經(jīng)超聲輔助法提取得到的桂花色素溶液，經(jīng)真空抽濾后離心，棄去沉淀定容至50 mL，稀釋適宜倍數(shù)得到樣品測(cè)試液，以相應(yīng)濃度的乙醇溶液調(diào)零，在波長(zhǎng)為330 nm條件下測(cè)定其OD值。根據(jù)繪制的桂花色素標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性回歸方程計(jì)算出桂花色素樣品液濃度。

色素得率（%）=（C×d×50）/（m×106）×100。

式中：C為樣品測(cè)試液桂花色素溶液濃度，μg/mL；d為稀釋倍數(shù)；50為桂花色素提取液定容體積，mL；m為桂花質(zhì)量，g；106為單位換算系數(shù)，1 g=106 μg。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

以O(shè)D330 nm值表征色素含量，分別考察了桂花品種、乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間、液料比對(duì)桂花色素得率的影響。各品種桂花分別篩選、去除雜質(zhì)，低溫烘干，用超微粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取一定量桂花樣品，參考趙娟娟等[21]的方法，在液料比20∶1 （mL/g）、乙醇濃度70%、超聲功率200 W、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間30 min的條件下提取桂花色素，研究不同桂花品種（浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂）對(duì)桂花色素提取率的影響。以四季桂為原料，研究不同乙醇溶液濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、超聲功率（80，120，160，200，240，280，320 W）、提取時(shí)間（10，20，30，40，50，60，70 min）、液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，mL/g）對(duì)桂花色素吸光度值的影響，取1 mL溶液稀釋至25 mL，測(cè)定其OD值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選定四季桂為提取原料，選取乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間、液料比為考察因素，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)[22]，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.4.5 抑菌試驗(yàn)

將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、藤黃微球菌分別接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于37 ℃培養(yǎng)24～48 h，備用；將釀酒酵母、桔青霉、米曲霉接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，于27 ℃培養(yǎng)2～5 d，備用。取活化好的菌種斜面，用滅菌生理鹽水制成107～108 CFU/mL的菌懸液，備用[23]。

將桂花色素粗提物用DMSO精確配成0（對(duì)照組），2.5，5，10，15，20，25 mg/mL系列濃度的溶液，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。參考陳光等[24]的方法，采用牛津杯法測(cè)試桂花色素對(duì)7種指示菌的抑菌作用。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Excel 2019統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20軟件。方差分析采用ANOVA，采用Duncan's多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。圖表繪制采用Origin 9.0軟件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析使用Design-Expert 8.0.6.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 桂花品種對(duì)得率的影響

試驗(yàn)選擇了浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂5個(gè)品種的桂花進(jìn)行色素的提取，桂花品種對(duì)桂花色素得率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，在相同的提取工藝條件下，四季桂的色素得率最高（49.52%），銀桂、金桂、狀元紅次之，浦城丹桂的色素得率較低。故后續(xù)色素提取原料選定四季桂。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)得率的影響

乙醇濃度對(duì)桂花色素得率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，乙醇濃度在30%～60%范圍內(nèi)，色素得率不斷上升，且在乙醇濃度為60%時(shí)取得極值51.38%。其原因可能是隨著乙醇濃度的增加，色素分子與乙醇充分接觸，色素溶出率增加，提取初期桂花色素-乙醇溶液中色素濃度差異大，利于提取。乙醇濃度繼續(xù)增大，得率下降，當(dāng)乙醇濃度大于80%時(shí)，得率陡然下降，可能是隨著乙醇濃度的增加，提取劑的極性增大，使醇溶性、脂溶性的物質(zhì)析出，而這些物質(zhì)與色素形成競(jìng)爭(zhēng)，并與乙醇-水分子結(jié)合而導(dǎo)致的[25]。乙醇濃度達(dá)到80%后，色素分子結(jié)構(gòu)被分解破壞，導(dǎo)致得率下降，故乙醇濃度選取60%為宜。

2.1.3 超聲功率對(duì)得率的影響

超聲功率對(duì)桂花色素得率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，超聲功率在80～200 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增大，桂花色素得率上升，在超聲功率為200 W時(shí)，得率達(dá)到最大值51.36%。其原因可能是色素提取需要適宜的超聲功率，超聲功率較低時(shí)，植物細(xì)胞壁破壞不充分，提取速率較慢，隨著功率的增大，色素分子在乙醇中的溶解度提升，使得率提升。而當(dāng)超聲功率增加到200 W以后，超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)增強(qiáng)，提取體系中超聲波的物理振蕩作用進(jìn)一步加強(qiáng)，致使色素的分子結(jié)構(gòu)被破壞[26]，同時(shí)隨著超聲功率的增大，提取體系溫度上升也不可避免地造成了提取劑的揮發(fā)，最終導(dǎo)致得率下降，故超聲功率選取200 W為宜。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)桂花色素得率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，桂花色素得率整體呈先上升后下降的趨勢(shì)。在超聲時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到極值57.87%。超聲時(shí)間為10～20 min時(shí)，得率上升緩慢，這是因?yàn)楣鸹ㄉ嘏c乙醇溶劑需要一定時(shí)間的充分接觸才能被提取出來(lái)，超聲時(shí)間過(guò)短，超聲提取的作用沒(méi)有充分發(fā)揮，得率較低。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，更多溶劑滲入細(xì)胞內(nèi)部，促進(jìn)色素的溶出，使得桂花色素取得最大得率[27]。超聲時(shí)間繼續(xù)增加，得率明顯下降，可能是因?yàn)樘崛◇w系長(zhǎng)時(shí)間超聲處理以及一直處于較高溫度加速了色素的分解，使得色素得率下降，故超聲時(shí)間選擇30 min為宜。

2.1.5 液料比對(duì)得率的影響

由圖5可知，液料比由10∶1（mL/g）上升到25∶1（mL/g）的過(guò)程中，桂花色素的得率也隨之上升，在液料比為25∶1（mL/g）時(shí)取得最大值61.53%，可能是因?yàn)殡S著溶劑的增加，滲透壓增加，利于提取。隨著液料比繼續(xù)增加，得率顯著下降，其原因可能是液料比增加后，有機(jī)溶劑添加過(guò)多使得其他雜質(zhì)溶出，影響了色素本身的溶出，因此液料比過(guò)高并不利于色素浸提[28]，故液料比選擇25∶1（mL/g）為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)色素得率的結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以桂花色素得率為響應(yīng)值，乙醇濃度（A）、超聲功率（B）、超聲時(shí)間（C）、液料比（D）為自變量，得到二次多項(xiàng)回歸模型：Y桂花色素得率 =61.47－1.04A+1.37B－0.43C+0.67D+0.11AB+0.59AC－1.51AD+0.08BC－1.21BD+0.30CD－3.61A2－5.60B2－4.93C2－5.06D2。

由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，表明該方程擬合性較好， RAdj2=0.986 5，說(shuō)明數(shù)據(jù)可靠性較高。試驗(yàn)中A（乙醇濃度）、B（超聲功率）、C（超聲時(shí)間）、D（液料比）對(duì)色素得率的影響極顯著；交互項(xiàng)中，AD、BD極顯著，AC顯著。由F值可知，各試驗(yàn)因素影響順序?yàn)槌暪β剩˙）＞乙醇濃度（A）＞液料比（D）＞超聲時(shí)間（C）。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行解析，得到最優(yōu)的桂花色素提取工藝參數(shù)為乙醇濃度58.39%、超聲功率204.47 W、超聲時(shí)間29.49 min、液料比25.37∶1 （mL/g），在此條件下桂花色素預(yù)測(cè)得率為61.66%。結(jié)合實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)工藝參數(shù)修正為乙醇濃度60%、超聲功率200 W、超聲時(shí)間30 min、液料比25∶1 （mL/g）。在修正工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，桂花色素得率平均值為61.56%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.16%，說(shuō)明利用響應(yīng)面法優(yōu)化后得到的色素提取參數(shù)具有實(shí)際指導(dǎo)意義，且所得工藝參數(shù)可信，預(yù)測(cè)的回歸模型對(duì)優(yōu)化超聲波細(xì)胞破碎輔助法提取桂花色素的工藝是可行的。

2.4 桂花色素抑菌效果的研究

桂花色素粗提液對(duì)不同指示菌的抑菌效果見(jiàn)表4。

由表4可知，相對(duì)于對(duì)照組（DMSO），當(dāng)桂花色素粗提液的濃度大于5 mg/mL時(shí)，對(duì)所選的7種指示菌均具有一定的抑制作用，其抑制程度為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞藤黃微球菌＞大腸埃希菌＞釀酒酵母，整體上對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果優(yōu)于陰性菌，對(duì)霉菌中的桔青霉和米曲霉均具有抑菌作用，抑菌效果與色素的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。這可能與桂花色素主要成分為類黃酮化合物以及類胡蘿卜素有關(guān)，有研究表明，黃酮類物質(zhì)可以阻礙細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的生成，抑制ATP的合成，影響菌體代謝[29]。此外，黃酮類物質(zhì)可與金屬形成螯合物，抑制細(xì)菌金屬酶的活性[30]。李念等[31]發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素可抑制細(xì)胞膜的生成。目前，對(duì)于色素中具體的抑菌物質(zhì)和機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

試驗(yàn)選取浦城丹桂、四季桂、狀元紅、金桂、銀桂這5個(gè)浦城桂花產(chǎn)量較高的品種提取色素，其中四季桂的色素得率最高，為49.52%。以四季桂為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、液料比、超聲功率、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到桂花色素的最佳提取工藝為乙醇濃度60%、超聲功率200 W、超聲時(shí)間30 min、液料比25∶1 （mL/g）。在此條件下，桂花色素提取率最高，為61.56%，與預(yù)測(cè)值（61.66%）的相對(duì)誤差為0.16%，表明響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助法提取桂花色素的工藝是可行的。桂花色素的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，桂花色素的抑菌效果顯著，整體上，桂花色素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果優(yōu)于陰性菌。試驗(yàn)中色素的抑菌程度為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞藤黃微球菌＞大腸埃希菌＞釀酒酵母，對(duì)桔青霉和米曲霉的抑制作用較弱。桂花色素除了可用于食品著色外，還具有顯著的抑菌效應(yīng)，在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域中具有極大的開(kāi)發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

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收稿日期：2023-07-14

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022GXNSFBA035561）；南寧師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（20210502）；福建省科技廳社會(huì)發(fā)展引導(dǎo)性項(xiàng)目（2020N0036）

作者簡(jiǎn)介：譚志梅（1998－），女，碩士，研究方向：食品微生物。

*通信作者：王淑培（1986－），女，講師，博士，研究方向：食品微生物及生物技術(shù)。