王慶沛　宇光海　廖愛(ài)美　潘龍　黃繼紅

摘要：血紅蛋白是存在于原核和真核細(xì)胞中由血紅素輔基和珠蛋白肽鏈構(gòu)成的血紅素蛋白，具有多種生理功能，常被用于醫(yī)藥與食品行業(yè)。在食品加工領(lǐng)域，其作為調(diào)味劑以提高代肉未來(lái)食品——植物蛋白肉的口感和擬真性可以滿足有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的人們對(duì)肉類口感的需求。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)血紅蛋白相較于化學(xué)法提取具有操作方便、經(jīng)濟(jì)高效、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，近幾年已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。微生物高效表達(dá)血紅蛋白的關(guān)鍵在于血紅素的高水平供應(yīng)與血紅蛋白的正確表達(dá)兩個(gè)方面，強(qiáng)化血紅素合成途徑、優(yōu)化蛋白表達(dá)和發(fā)酵策略是實(shí)現(xiàn)血紅蛋白高效表達(dá)的重要途徑。文章圍繞微生物高效合成血紅蛋白最新研究進(jìn)展、血紅蛋白及其衍生物在食品中的應(yīng)用開展綜述，以期為促進(jìn)微生物源血紅蛋白在食品中的應(yīng)用提供理論參考。

關(guān)鍵詞：血紅蛋白；血紅素；植物蛋白肉；未來(lái)食品；食品調(diào)味品

中圖分類號(hào)：TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2024）01-0189-09

Research Progress of Synthesis of Hemoglobin by Microorganisms and Its Application in Food

WANG Qing-peiYU Guang-haiLIAO Ai-meiPAN LongHUANG Ji-hong1， 4*

Abstract： Hemoglobin is a heme protein composed of heme subunits and globin peptide chains that exists in prokaryotic and eukaryotic cells. It has various physiological functions and is often used in the pharmaceutical and food industries. In the field of food processing， it can be used as a seasoning agent to improve the taste and authenticity of future meat substitutes — plant protein meat， so as to meet the needs of people with special nutritional requirements for meat taste. Using microbial fermentation method to produce hemoglobin has advantages compared with chemical method， it is easy to operate， economical， efficient and environmentally friendly， and has become a research hotspot in recent years. The key to efficient expression of hemoglobin by microorganisms lies in two aspects： the high-level supply of hemoglobin and the correct expression of hemoglobin. Strengthening the heme synthesis? pathway， optimizing protein expression and fermentation strategies are important ways to achieve? efficient expression of hemoglobin. In this paper， the latest research progress of the efficient synthesis of hemoglobin by microorganisms， as well as the application of hemoglobin and its derivatives in food are reviewed， in order to provide theoretical references for promoting the application of microbial derived hemoglobin in food.

Key words： hemoglobin; heme; vegetable protein meat; future food; food seasoning

隨著消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)肉類食品的需求逐年增加，且受動(dòng)物疫病[1]、生產(chǎn)周期[2]、氣候變化[3]等因素的影響，傳統(tǒng)的畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)的肉類已無(wú)法滿足人們的需要，養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的能耗與溫室氣體的排放也會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[4]。且傳統(tǒng)養(yǎng)殖肉導(dǎo)致人類“三高”患病率逐年增加，尋求一類既能滿足人們對(duì)養(yǎng)殖肉營(yíng)養(yǎng)元素的需要，又能減少患病率的代肉未來(lái)食品已成為科研人員研究的方向[5]。目前代肉食品主要分為兩種：一種是以大豆等植物蛋白為原料的植物蛋白肉，另一種是從動(dòng)物身上提取細(xì)胞組織培育成的細(xì)胞培養(yǎng)肉[6]。

細(xì)胞培養(yǎng)肉生產(chǎn)成本較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，因此目前代肉食品的研究主要集中在植物基代肉未來(lái)食品。且由于食品加工業(yè)的快速發(fā)展和健康飲食知識(shí)的滲透，民眾的飲食要求已從之前的“吃得飽、吃得好”轉(zhuǎn)變?yōu)椤俺缘冒踩⒊缘脿I(yíng)養(yǎng)”。植物蛋白肉作為未來(lái)食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要研究方向，不僅可以減少畜牧業(yè)對(duì)水和土地的需求，降低溫室氣體的排放量[7]，而且能為對(duì)健康有特殊要求的消費(fèi)者提供更多的選擇。與真肉相比，植物蛋白肉具有豐富的植物蛋白，能降低心血管疾病和Ⅱ型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)[8]。

植物基蛋白肉是通過(guò)擠壓技術(shù)和3D食品打印技術(shù)將植物蛋白加工成類似肉類的纖維結(jié)構(gòu)，從而模擬真肉的質(zhì)地與口感。雖然制造技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但是在色澤、風(fēng)味及口感等方面仍然存在差異[9]。血紅蛋白是肉類食品的調(diào)味劑和著色劑，使用血紅蛋白作為添加劑可以極大地提高代肉食品的口感和風(fēng)味，極具食品工業(yè)應(yīng)用前景。但是化學(xué)法提取血紅蛋白的難度大，不具有經(jīng)濟(jì)性，且需要大量的動(dòng)物血液，同樣會(huì)引起過(guò)度畜牧帶來(lái)的土地、水資源的浪費(fèi)及溫室效應(yīng)的加劇，從而造成環(huán)境惡化[10]。將微生物法發(fā)酵生產(chǎn)的血紅蛋白應(yīng)用于代肉制品，可以極大地提高代肉制品的口感和風(fēng)味。微生物發(fā)酵法早在2016年就被應(yīng)用于素肉漢堡中[11]，也打開了微生物表達(dá)血紅蛋白的熱潮。本文對(duì)目前微生物合成的主要血紅蛋白種類、微生物高效表達(dá)血紅素及血紅蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)要?dú)w納和總結(jié)，為今后開發(fā)微生物源血紅蛋白產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)，并簡(jiǎn)要?dú)w納了血紅蛋白及其衍生物在食品中的應(yīng)用，以期促進(jìn)血紅蛋白在食品制造業(yè)中的進(jìn)一步發(fā)展。

1 微生物合成的主要血紅蛋白種類

血紅蛋白的結(jié)構(gòu)及存在部位見圖1。

目前已有15種不同來(lái)源的血紅蛋白在微生物中表達(dá)[12]，根據(jù)參與合成的生物體及組成結(jié)構(gòu)的不同主要研究集中在動(dòng)物血紅蛋白、動(dòng)物肌紅蛋白、微生物血紅蛋白及植物血紅蛋白方面。動(dòng)物血紅蛋白（hemoglobin）是紅細(xì)胞的重要組成成分，存在于血液中，是血紅素輔基和珠蛋白組成的輔助因子蛋白，有輸送和儲(chǔ)存氧氣等重要作用。動(dòng)物血紅蛋白是由兩條α鏈和兩條β鏈組成的四級(jí)結(jié)構(gòu)[13]，每條鏈含有一個(gè)血紅素基團(tuán)，其中血紅素基團(tuán)中心的亞鐵離子承擔(dān)機(jī)體氧氣運(yùn)輸?shù)墓δ躘14]。動(dòng)物肌紅蛋白（myoglobin）存在于動(dòng)物肌肉組織中，是一種結(jié)合蛋白，相比于血紅蛋白的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)，由一條肽鏈和一個(gè)血紅素輔基組合而成。肌紅蛋白只存在于動(dòng)物的心肌及骨骼肌肉中，在肌細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存氧的功能，在心肌受損時(shí)從心肌細(xì)胞中彌散出進(jìn)入血液循環(huán)。動(dòng)物肌紅蛋白結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，微生物合成難度不大，目前的研究已經(jīng)相對(duì)成熟。透明顫菌血紅蛋白（vitreoscilla hemeglobin）是由2個(gè)相同的亞基組成的同型二聚體，透明顫菌血紅蛋白被應(yīng)用在天然產(chǎn)物藥物、藥物前體或醫(yī)藥中間體、保健品功能因子及生物醫(yī)療材料等生物醫(yī)藥生產(chǎn)應(yīng)用研究中[15]。透明顫菌血紅蛋白基因vgb在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)可改變細(xì)胞的氧化狀態(tài)，促進(jìn)活性氧的累積，很好地解決了高密度發(fā)酵溶氧率問(wèn)題[16]。透明顫菌血紅蛋白的應(yīng)用主要體現(xiàn)在提高微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和增加生物修復(fù)能力上，將其應(yīng)用于食品方面并沒(méi)有研究。作為食品添加劑，豆血紅蛋白（leghemoglobin）在食品制造行業(yè)中的應(yīng)用最廣泛。豆血紅蛋白是單體血紅蛋白，由一個(gè)血紅素輔基和一條肽鏈組成，存在于豆科植物根上的固氮結(jié)節(jié)中，是根瘤菌感染大豆后產(chǎn)生的血紅蛋白[17]。豆血紅蛋白能賦予食品牛肉的風(fēng)味與顏色，已經(jīng)在食品制造業(yè)中作為添加劑得以應(yīng)用。但是化學(xué)法提取豆血紅蛋白的工藝復(fù)雜，且種植耗費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)，使得生產(chǎn)豆血紅蛋白的成本過(guò)高[18]。微生物發(fā)酵法替代傳統(tǒng)的化學(xué)法生產(chǎn)豆血紅蛋白，可降低成本，提高工作效率，以其作為食品調(diào)味劑應(yīng)用于食品中，已經(jīng)獲得了美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)使用。

2 微生物高效表達(dá)血紅蛋白的策略及研究進(jìn)展

在微生物宿主方面，枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母等9種微生物已被應(yīng)用于合成血紅蛋白[12]。血紅蛋白的高效表達(dá)依賴于血紅素的高水平供應(yīng)和蛋白的正確表達(dá)，主要通過(guò)以下3種策略實(shí)現(xiàn)：強(qiáng)化血紅素的合成途徑來(lái)提高血紅素的供應(yīng)；優(yōu)化血紅蛋白表達(dá)策略來(lái)提高球蛋白和血紅素的結(jié)合率以保證血紅蛋白的正確表達(dá)；優(yōu)化微生物表達(dá)血紅蛋白的發(fā)酵條件來(lái)進(jìn)一步提高血紅蛋白的表達(dá)量。

2.1 血紅素合成途徑的優(yōu)化

血紅素是合成血紅蛋白的輔基，具有攜氧能力，是生命體代謝活動(dòng)中不可缺少的小分子物質(zhì)，它存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻等生命體中。血紅素是一種鐵卟啉化合物，由卟啉和亞鐵構(gòu)成，通過(guò)改變側(cè)鏈形成不同結(jié)構(gòu)的衍生物[19]。血紅素的基本結(jié)構(gòu)是卟啉中心螯合亞鐵離子形成的共軛結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定[20]。大多數(shù)生物都可以內(nèi)源合成血紅素，主要分為兩種途徑：C4途徑與C5途徑。C4途徑與C5途徑的主要差別在于5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）上游途徑的不同。5-ALA是一種非蛋白氨基酸，是四吡咯途徑中合成血紅素、葉綠素、細(xì)胞色素及維生素B12的中間體，據(jù)研究，5-ALA與血紅素的產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)[21]。

2.1.1 5-ALA上游途徑的優(yōu)化

2.1.1.1 C4途徑5-ALA上游優(yōu)化

C4途徑也稱Shemin途徑（見圖1），它存在于哺乳動(dòng)物、鳥類、真菌等生物中[22]。在C4途徑中，5-ALA是琥珀酰輔酶A與甘氨酸在ALA合成酶（ALAS）的作用進(jìn)一步反應(yīng)縮合而成的。提高血紅素的產(chǎn)量首先需要篩選高效的ALA合成酶。在2014年，研究人員對(duì)莢膜紅桿菌、農(nóng)桿菌、球形紅桿菌的ALA合成酶進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)莢膜紅桿菌的ALAS活性最高，通過(guò)菌體利用C4途徑異源表達(dá)后，獲得了產(chǎn)量為8.8 g/L的5-ALA[23]。在2018年，張俊麗等[24]表達(dá)了來(lái)自釀酒酵母中的ALAS hemA基因并整合C5途徑5-ALA合成途徑，在添加前體物質(zhì)甘氨酸和琥珀酸的條件下，ALA產(chǎn)量為525.8 mg/L，實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母中合成高產(chǎn)量的ALA。在2020年，Hsuan等[25]發(fā)現(xiàn)密碼子優(yōu)化的莢膜紅桿菌ALAS異源表達(dá)可以獲得更多的可溶性ALAS，并進(jìn)一步產(chǎn)生高水平的5-ALA。由于ALA是由TCA循環(huán)中的甘氨酸和琥珀酰輔酶A縮合而成的，研究人員也對(duì)TCA代謝流進(jìn)行了改造。研究發(fā)現(xiàn)在有氧條件下敲除琥珀酸脫氫酶（SDH1）和富馬酸酶（FUM1），琥珀酸水平可增加2.7倍，SDH1的單獨(dú)缺失可使其提高1.6倍，可提高琥珀酰COA的產(chǎn)量[26]。且SDH1基因的敲除并不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生影響而敲除琥珀酸脫氫酶（SUC3）基因，促進(jìn)碳通量流向5-ALA會(huì)明顯抑制菌體的生長(zhǎng)出現(xiàn)嚴(yán)重的代謝失衡，可能是由于琥珀酸脫氫酶在合成代謝中的特殊作用，無(wú)法合成琥珀酰COA將會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。在谷氨酸棒狀桿菌中引入C4途徑，并敲除琥珀酸脫氫酶（SdhA）和乙醛酸操縱子阻遏蛋白（IclR），進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞中琥珀酰輔酶A的形成，同時(shí)抑制hemB基因表達(dá)，獲得5-ALA產(chǎn)量為6.93 g/L[27]。在釀酒酵母中，ACO1和ACO2編碼的烏頭酸酶是甘氨酸充足時(shí)TCA循環(huán)中的限速酶，與野生菌株S288C相比，ACO1缺失會(huì)導(dǎo)致菌的最大發(fā)酵速率降低35%[28]。過(guò)表達(dá)ALAS時(shí)ACO2的過(guò)表達(dá)可進(jìn)一步增加5-ALA的合成[29]。

2.1.1.2 C5途徑5-ALA上游優(yōu)化

C5途徑主要存在于高等植物、藻類和多種細(xì)菌中，以谷氨酸為前體合成5-ALA需要3種酶的參與分別是谷氨酸-tRNA合成酶（gltX）、谷氨酸-tRNA還原酶（hemA）和谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶（hemL）。在C5途徑的研究中，通過(guò)共表達(dá)SerA、SerB及SerC基因，5-ALA產(chǎn)量提高69%，在此基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)glyA基因，使5-ALA產(chǎn)量提高1.5倍[30]。通過(guò)敲除乙酸和乳酸等副產(chǎn)物合成途徑相關(guān)基因以減少乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，提高草酰乙酸含量也有利于5-ALA的產(chǎn)量[31]。5-ALA的合成與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電勢(shì)有關(guān)，共表達(dá)蘋果酸酶基因maeB和hemA時(shí)，可以提高ALAS的活力[32]。同時(shí)發(fā)酵時(shí)添加甘氨酸和琥珀酸等前體物質(zhì)、ALA脫氫酶的抑制劑左旋丙酸、乙酰丙酸、D-木糖等都可以增加5-ALA的產(chǎn)量[33]。且有研究顯示5-ALA在堿性條件下容易降解，產(chǎn)量隨著pH的降低而增加[34]。釀酒酵母作為一種耐酸菌株，由于其遺傳可馴化性、生命周期短和成熟的高密度發(fā)酵技術(shù)，以其作為底盤細(xì)胞將有利于5-ALA產(chǎn)量的增加。

2.1.2 5-ALA下游途徑的優(yōu)化

除了提高前體5-ALA的產(chǎn)量外，控制血紅素的合成和降解途徑是最有效的手段。血紅素在ALA前體充分存在的情況下，經(jīng)過(guò)ALA脫水酶（hemB）脫水縮合形成膽色素原，經(jīng)過(guò)羥甲基膽素合成酶（hemC）脫氨縮合形成羥甲基膽素，再經(jīng)過(guò)尿卟啉原Ⅲ合成酶（hemD）的作用脫水環(huán)化形成四吡咯環(huán)的尿卟啉原Ⅲ，從此步驟開始形成卟啉環(huán)，也是生物體內(nèi)所有四吡咯類物質(zhì)合成的共同前體[33]。尿卟啉原Ⅲ經(jīng)過(guò)尿卟啉原Ⅲ脫羧酶（hemE）將4個(gè)側(cè)鏈脫羧合成糞卟啉原Ⅲ，糞卟啉原Ⅲ經(jīng)過(guò)糞卟啉原Ⅲ氧化酶（hemF）對(duì)側(cè)鏈進(jìn)行氧化脫羧形成原卟啉原Ⅸ，再經(jīng)過(guò)原卟啉原Ⅸ脫氫酶（hemG）催化脫氫成原卟啉Ⅸ，最后在亞鐵螯合酶（hemH）的作用下，結(jié)合Fe2+形成血紅素[35]。血紅素的降解途徑一般與血紅素加氧酶（Hmx1）和參與有氧呼吸的Hap1p轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。血紅素加氧酶參與血紅素的氧化分解反應(yīng)，分解產(chǎn)物為膽綠素、鐵和一氧化碳，有研究表明Hmx1基因的缺失會(huì)使血紅素的降解活動(dòng)減弱，從而達(dá)到胞內(nèi)的積累[36]。Hap1p是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與有氧呼吸和氧化還原反應(yīng)的激活，并負(fù)責(zé)血紅素的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)胞內(nèi)血紅素含量過(guò)高時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制因子Rox1p抑制血紅素合成途徑hemF轉(zhuǎn)錄形成負(fù)反饋以降低血紅素的合成[37]。在2003年，Kwon等[38]首次利用三質(zhì)粒系統(tǒng)在大腸桿菌中組裝了整個(gè)血紅素合成途徑，得到的卟啉總濃度為90 μmol/L，血紅素濃度為3.3 μmol/L。通過(guò)優(yōu)化血紅素合成基因的表達(dá)水平，刪除競(jìng)爭(zhēng)通路，過(guò)表達(dá)血紅素輸出蛋白，使大腸桿菌的血紅素總產(chǎn)量達(dá)到1 034.3 mg/L[39]。過(guò)表達(dá)大腸桿菌的血紅素輸出蛋白ccmABC，血紅素的分泌率可提高63%。血紅素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)體hrtA、hrtB以及細(xì)胞色素輸出蛋白ccsA可能參與細(xì)胞的分泌，重組過(guò)表達(dá)進(jìn)行比較，顯示hrtAB更利于血紅素的產(chǎn)生，胞外分泌率達(dá)9.25%[40]。過(guò)表達(dá)C5途徑從L-谷氨酸開始的ALA生物合成途徑，敲除降解途徑基因pta、IdhA和yfex，以阻斷醋酸和乳酸的合成來(lái)優(yōu)化代謝通量，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ccmAB，使其產(chǎn)生73.4 mg/L血紅素，在培養(yǎng)基中添加ALA胞外血紅素產(chǎn)量為151.4 mg/L，占總產(chǎn)量239.2 mg/L的63.3%[41]。在大腸桿菌中構(gòu)建并篩選具有最佳RBS強(qiáng)度的hemBCDEFY組合菌株，獲得的卟啉濃度為160.8 mg/L，再?gòu)恼T變文庫(kù)中獲得了一個(gè)高活性的hemFECH變異體。對(duì)優(yōu)化后的hemBCDEFY和hemFECH突變體的菌株分批發(fā)酵，得到最高產(chǎn)量為127.6 mg/L的血紅素[42]。在釀酒酵母中，Hoffman等[43]通過(guò)構(gòu)建釀酒酵母血紅素合成基因過(guò)表達(dá)系統(tǒng)證明hemB、hemC為關(guān)鍵限速酶基因，同時(shí)hemE也具有限速酶的可能。Ishchuk等[44]對(duì)76個(gè)血紅素單獨(dú)敲除或者過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)40個(gè)基因可增加血紅素的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hemF可使血紅素產(chǎn)量提高300%，hemG、hemB、hemH、hemC及hemE也可使血紅素產(chǎn)量增加20%～70%。敲除不利基因、組合過(guò)表達(dá)有利基因后血紅素產(chǎn)量提高了70倍，血紅素產(chǎn)量達(dá)到53.7 mg/L。血紅素合成的最后一步是由鐵螯合酶（hemH）介導(dǎo)亞鐵插入卟啉環(huán)，從而產(chǎn)生血紅素。研究人員發(fā)現(xiàn)hemH與Mic60的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)是線粒體接觸位點(diǎn)和嵴組織系統(tǒng)（MICOS）的核心成分。MICOS的缺失會(huì)對(duì)hemH的活性產(chǎn)生負(fù)面影響，影響酵母中血紅素的合成[45]。在谷氨酸棒狀桿菌中，結(jié)合兩種前體途徑，共表達(dá)通路基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子DtxR，過(guò)表達(dá)血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，敲除血紅素結(jié)合蛋白實(shí)現(xiàn)了血紅素產(chǎn)量為（309.18±16.43） mg/L，胞外濃度為（242.95±11.45） mg/L[46]。將血紅素生物合成途徑分為4個(gè)模塊：內(nèi)源C5途徑、異源C4途徑、尿卟啉原Ⅲ合成途徑和下游合成途徑。過(guò)表達(dá)谷氨酰t-RNA還原酶的hemA，敲除C5通路中谷氨酸脫氫酶rocG，血紅素產(chǎn)量增加了427%；過(guò)表達(dá)hemC、hemD、hemB，使血紅素的產(chǎn)量增加了39%；通過(guò)10 L發(fā)酵罐發(fā)酵，胞外血紅素產(chǎn)量為（221.83±4.71） mg/L，總血紅素產(chǎn)量為（248.26±6.97） mg/L[47]。這些研究均表明，在提高血紅素產(chǎn)量方面針對(duì)一個(gè)基因的敲除或者過(guò)表達(dá)并不能產(chǎn)生明顯的效果，當(dāng)hemD表達(dá)量降低時(shí)，hemB會(huì)自發(fā)轉(zhuǎn)化為尿卟啉原 Ⅰ 從而減少尿卟啉原Ⅲ的合成，繼而減少血紅素的合成[48]。高水平的hemD和hemF過(guò)表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致ALA的積累，說(shuō)明血紅素的合成是由多個(gè)基因進(jìn)行調(diào)控的，提高血紅素的產(chǎn)量需要對(duì)每個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)整。血紅素合成通路見圖2。

2.1.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵優(yōu)化也是提高血紅素產(chǎn)量的重要手段。通過(guò)溫度、溶氧及外源添加物對(duì)卟啉合成前體5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）及終產(chǎn)物血紅素產(chǎn)量影響的分析，發(fā)現(xiàn)Fe2+、谷氨酸或葡萄糖均能提升5-ALA和血紅素的含量，37 ℃、200 mL 裝液量條件下添加0.2 mmol/L 葡萄糖，血紅素產(chǎn)量最高，可達(dá)34.45 μmol/L，比對(duì)照提高了10.79倍[49]。對(duì)培養(yǎng)基改良發(fā)現(xiàn)添加碳酸氫鈉和磷酸鹽緩沖液可使血紅素的生成速度提高60%，硫胺素等生長(zhǎng)因子的添加使血紅素生成量提高1倍[50]。因此，提高血紅素產(chǎn)量的發(fā)酵策略基本是在培養(yǎng)基中補(bǔ)充前體物質(zhì)、合成過(guò)程中的金屬離子及一些促生長(zhǎng)因子、改善發(fā)酵環(huán)境這幾個(gè)方面。調(diào)整發(fā)酵工藝也能影響血紅素基因的表達(dá)水平，從而提高血紅素的產(chǎn)量[51]。研究人員運(yùn)用分批補(bǔ)料的方法，在碳源耗盡和pH高于預(yù)設(shè)值時(shí)在發(fā)酵罐中自動(dòng)添加培養(yǎng)基，使血紅素產(chǎn)量進(jìn)一步提升[41]。高水平的氧氣會(huì)促進(jìn)酵母細(xì)胞血紅素的合成，因此在C4途徑的優(yōu)化中，除了添加前體ALA、琥珀酸和甘氨酸，控制溶氧率也能提高血紅素的產(chǎn)量。

2.2 血紅蛋白表達(dá)策略的優(yōu)化

2.2.1 動(dòng)物血紅蛋白表達(dá)策略的優(yōu)化

微生物法合成動(dòng)物血紅蛋白根據(jù)用途可以分為兩種：應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的人血紅蛋白和應(yīng)用于食品的動(dòng)物血紅蛋白。在人血紅蛋白的研究中通過(guò)外源添加血紅素，血紅蛋白產(chǎn)量能達(dá)到細(xì)胞總蛋白產(chǎn)量的5%～10%，且只有50%的血紅素被結(jié)合[52]。隨后研究人員在大腸桿菌中添加ALA使血紅素結(jié)合率從20%提高到68%[53]。但是研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌系統(tǒng)不能產(chǎn)生功能性的血紅蛋白，因此構(gòu)建血紅蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)血紅素的可用性是目前研究的熱點(diǎn)。在釀酒酵母中，通過(guò)平衡球蛋白的表達(dá)和工程血紅素生物合成途徑，血紅蛋白的表達(dá)水平顯著提高到酵母細(xì)胞總蛋白的3%～4%，隨后對(duì)釀酒酵母中限速酶hemC過(guò)表達(dá)來(lái)增加血紅蛋白產(chǎn)量[54]，再通過(guò)敲除異源蛋白降解途徑使血紅蛋白積累到總蛋白的18%[55]。在動(dòng)物血紅蛋白的研究中，薛繼科等[56]在選擇半乳糖誘導(dǎo)策略（pGAL1啟動(dòng)子）對(duì)球蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、去除血紅素合成過(guò)程中的空間屏障、增加5-ALA的合成、適度提高血紅素合成的限速步驟后，實(shí)現(xiàn)了（19.3±2.8） mg/L的牛血紅蛋白和（11.7±0.4） mg/L的豬血紅蛋白的微生物合成。此外，還獲得了產(chǎn)量為（108.2±3.5） mg/L的豆血紅蛋白、（68.9±1.6） mg/L的牛肌紅蛋白和（85.9±5.0） mg/L的豬肌紅蛋白。在大腸桿菌和畢赤酵母中通過(guò)構(gòu)建載體誘導(dǎo)表達(dá)使得鱷魚血紅蛋白的產(chǎn)量分別為3.0 mg/L和6.0 mg/L[57]。相比于動(dòng)物肌紅蛋白，動(dòng)物血紅蛋白的產(chǎn)量明顯較低，可能是由于動(dòng)物血紅蛋白結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，折疊形成正確的結(jié)構(gòu)難度較大，所以在食品應(yīng)用方面可以替代的動(dòng)物肌紅蛋白成為了研究的潛力方向。

2.2.2 動(dòng)物肌紅蛋白表達(dá)策略的優(yōu)化

戎倩倩[58]在釀酒酵母中構(gòu)建3種啟動(dòng)子調(diào)控下的8個(gè)血紅素合成基因的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，敲除Hmxl、Hapl后組合調(diào)控獲得了血紅素產(chǎn)量為1.12 mg/（L·OD600），整合異源C5途徑基因并優(yōu)化，進(jìn)一步過(guò)表達(dá)hemC，菌株發(fā)酵96 h時(shí)血紅素產(chǎn)量達(dá)到104.5 mg／L，較搖瓶發(fā)酵結(jié)果提高了4.51倍。在此基礎(chǔ)上，利用eGFP的熒光特性和6×His組氨酸標(biāo)簽，成功構(gòu)建了普通牛肌紅蛋白與豆血紅蛋白的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，證明了輔基基團(tuán)的生產(chǎn)可以用代謝工程的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而增加了高效生產(chǎn)含輔基基團(tuán)的復(fù)雜蛋白質(zhì)的可能性。利用促溶標(biāo)簽MBP、TrxA等融合表達(dá)不同來(lái)源血紅蛋白畢赤酵母重組菌株，豬肌紅蛋白、牛肌紅蛋白、豆血紅蛋白在搖瓶條件下產(chǎn)量分別達(dá)到42.0，20.0，100 mg/L；并進(jìn)一步優(yōu)化豬肌紅蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)體系，最終構(gòu)建得到的重組菌株48 h搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到69.0 mg/L，較對(duì)照組提高了59.4%[59]。通過(guò)外源添加血紅素，重組豬肌紅蛋白增加到285.42 mg/L，在5 L發(fā)酵罐中血紅素結(jié)合率從12.5%增加至22%[60]。張博涵[61]在畢赤酵母中優(yōu)化了表達(dá)宿主引入信號(hào)肽構(gòu)建最佳組成型表達(dá)體系后，引入強(qiáng)啟動(dòng)子GAP，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后豬肌紅蛋白的最高產(chǎn)量為576.42 mg/L。相比于其他血紅蛋白，微生物合成的肌紅蛋白具有產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)單、是動(dòng)物源的血紅蛋白等優(yōu)勢(shì)，更適用于食品的研究與開發(fā)。

2.2.3 豆血紅蛋白表達(dá)策略的優(yōu)化

目前表達(dá)豆血紅蛋白的系統(tǒng)主要包括大腸表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)，劉萌等[62]將攜帶豇豆血紅蛋白Lb Ⅱ基因的質(zhì)粒pET-15b轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21中表達(dá)，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化獲得了產(chǎn)量為7.30 μg/mL的大腸桿菌表達(dá)菌株。蘇悅[63]以畢赤酵母為宿主，通過(guò)選擇合適的啟動(dòng)子構(gòu)建豆血紅蛋白表達(dá)重組菌，通過(guò)提高抗生素濃度，篩選得到高效表達(dá)重組菌，然后經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后豆血紅蛋白分泌表達(dá)量達(dá)到0.12 g/L，最后對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，將重組菌豆血紅蛋白分泌表達(dá)量提高了66.7%，達(dá)到0.2 g/L。在2022年通過(guò)增加豆血紅蛋白基因拷貝數(shù)和強(qiáng)化內(nèi)源血紅素途徑，構(gòu)建了一株高效分泌活性豆血紅蛋白的畢赤酵母工程菌株，使得血紅蛋白最終產(chǎn)量達(dá)3.5 g/L，血紅素結(jié)合率達(dá)93%，是迄今為止在微生物細(xì)胞工廠中血紅蛋白的最高表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[64]。且該文章表示血紅素通路的8個(gè)基因?qū)钚远寡t蛋白的產(chǎn)生都具有積極作用，添加ALA可以增加細(xì)胞內(nèi)血紅素的產(chǎn)量，從而促進(jìn)豆血紅蛋白的正確折疊和分泌。但是添加ALA的豆血紅蛋白的比活性比添加血紅素的高42%，這是由于發(fā)酵液中血紅素通過(guò)酵母細(xì)胞膜的效率較低，即使在發(fā)酵液中存在過(guò)量的血紅素，也只能有小部分被轉(zhuǎn)化為血紅蛋白。隨后新的研究證明了在真核系統(tǒng)中存在著轉(zhuǎn)運(yùn)血紅素的膜蛋白基因TANGO2，TANGO2的缺失會(huì)導(dǎo)致線粒體中的血紅素超載從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，且TANGO2可以結(jié)合血紅素并將其轉(zhuǎn)移到球蛋白并形成血紅蛋白[65]。后續(xù)的研究可以在調(diào)整整個(gè)血紅素合成通路基因的表達(dá)水平基礎(chǔ)上，對(duì)膜蛋白基因進(jìn)行強(qiáng)化表達(dá)以提高血紅素的結(jié)合率及血紅蛋白的產(chǎn)量，不同微生物宿主高效合成血紅蛋白的技術(shù)策略見表1。

2.3 微生物表達(dá)血紅蛋白發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件的優(yōu)化對(duì)于血紅蛋白的合成也是比較重要的，陳林杰等[68]首先通過(guò)單因素試驗(yàn)研究蛋白胨種類、大豆蛋白胨濃度、鐵鹽種類及血紅素濃度在誘導(dǎo)階段對(duì)畢赤酵母產(chǎn)豆血紅蛋白的影響，然后通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出對(duì)豆血紅蛋白產(chǎn)量影響最大的3個(gè)因素，得出4%大豆蛋白胨作為氮源、甲醇誘導(dǎo)濃度為1.5%、血紅素濃度為5 μmol/L時(shí)發(fā)酵效果較好，最后根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐高密度發(fā)酵。經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后得到蛋白胨濃度51.48 g/L、pH 5.66、培養(yǎng)基裝液35.84 mL/250 mL 是最優(yōu)發(fā)酵條件。在此條件下?lián)u瓶發(fā)酵產(chǎn)量為191 mg/L，采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，豆血紅蛋白產(chǎn)量最高，達(dá)到384 mg/L。張博涵[61]經(jīng)搖瓶發(fā)酵，最終確定了發(fā)酵條件為1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、1%甘油、0.4 mg/L生物素及40 mg/L氯化血紅素，肌紅蛋白最高產(chǎn)量為17.2 mg/L，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵罐水平發(fā)酵優(yōu)化，經(jīng)終濃度150 mg/L氯化血紅素的流加發(fā)酵，肌紅蛋白最高產(chǎn)量達(dá)到576.42 mg/L。由此可以看出血紅蛋白的發(fā)酵也是從菌株對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等方面的需求來(lái)進(jìn)行優(yōu)化的。除此之外，提高微生物內(nèi)源血紅素的產(chǎn)量尤為關(guān)鍵，在血紅蛋白發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)上對(duì)血紅素的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，可以提高血紅素的產(chǎn)量，進(jìn)而保證血紅蛋白的正確折疊與表達(dá)。在發(fā)酵工藝方面，采用發(fā)酵罐發(fā)酵、分批補(bǔ)料、高密度發(fā)酵等科技手段針對(duì)不同微生物的特性有效控制發(fā)酵的多個(gè)環(huán)節(jié)也可以提高血紅蛋白表達(dá)量。

3 血紅蛋白及其衍生物在食品中的應(yīng)用

3.1 血紅蛋白在傳統(tǒng)食品中的應(yīng)用

血紅蛋白作為可食用調(diào)味品，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)食品領(lǐng)域。血紅蛋白由于其穩(wěn)定的著色效果、良好的感官評(píng)價(jià)常被作為著色劑應(yīng)用于素肉制品、腌肉制品、豬肉脯制品中以提高代肉及肉制品的風(fēng)味。血紅蛋白作為著色劑用于肉制品中能完全替代亞硝酸鹽，降低了肉制品中的亞硝酸鹽殘留量，顯著增加了產(chǎn)品的安全性[70]。血紅蛋白肽是血紅蛋白的一種衍生物，是通過(guò)物理化學(xué)方法將血紅蛋白中的珠蛋白分解成短肽段，再與血紅素連接的生物活性肽。研究發(fā)現(xiàn)人類對(duì)活性蛋白肽的吸收率高，對(duì)于年老、體弱多病及術(shù)后人群直接攝入這種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比經(jīng)靜脈注射的氨基酸更易快速吸收[71]。血紅蛋白是一種溶解性良好的蛋白，經(jīng)脫色得到珠蛋白，因其具有乳化脂肪的能力且穩(wěn)定性良好常被應(yīng)用于香腸和肉餡的制備中[72]。研究人員發(fā)現(xiàn)用酶水解技術(shù)可以提高豬血紅蛋白的乳化特性，通過(guò)優(yōu)化酶解條件可以得到高乳化性的蛋白類產(chǎn)物，將產(chǎn)物添加到烤腸中不但可以代替瘦肉蛋白，還可以提高烤腸的品質(zhì)[73]。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)的角度來(lái)看，膳食鐵通?？煞譃閮煞N形式：血紅素鐵和非血紅素鐵。非血紅素鐵主要包括硫酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵等[74]。血紅素鐵由其具有較高的生物利用度和較少的副作用可以作為天然的補(bǔ)鐵劑治療營(yíng)養(yǎng)不良或妊娠期貧血等疾病[75]。

3.2 血紅蛋白在未來(lái)食品中的應(yīng)用

現(xiàn)階段向植物、動(dòng)物、微生物要熱量、要蛋白的未來(lái)食品的發(fā)展已啟步，作為其代表的植物蛋白肉制品也逐漸出現(xiàn)在日常生活中。植物蛋白肉是利用大豆、小麥、豌豆等植物蛋白，通過(guò)合成、加工而形成的具有肉類營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、口感和風(fēng)味的食品[76]。植物蛋白肉相較于傳統(tǒng)養(yǎng)殖肉具有高植物性蛋白質(zhì)、少量的脂肪、無(wú)激素、富含多種氨基酸、低飽和脂肪、無(wú)反式脂肪、富含膳食纖維、無(wú)膽固醇等優(yōu)勢(shì)，更適合于有特殊肉類需求的人群食用[77]。目前能有效形成纖維狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、規(guī)模化生產(chǎn)的植物蛋白肉加工工藝主要包括3種紡絲技術(shù)、擠壓技術(shù)和食品3D打印技術(shù)[78]。食品3D打印技術(shù)采用逐層材料沉積模式，制造的食品在質(zhì)構(gòu)與外觀上更加逼真，近年來(lái)也成為研究的熱點(diǎn)[79]。除了質(zhì)構(gòu)外，口感和色澤也是人造肉制品獲得市場(chǎng)認(rèn)可度的關(guān)鍵，血紅蛋白作為植物蛋白肉制品的顯色及調(diào)味劑可以大幅改善口感及擬真性。利用畢赤酵母合成的豆血紅蛋白早在2016年已被Impossible Foods 公司應(yīng)用于植物基漢堡中。微生物法合成血紅蛋白應(yīng)用于植物蛋白肉制品已具備市場(chǎng)基礎(chǔ)，其安全性也已被證實(shí)[11]。通過(guò)添加血紅蛋白、風(fēng)味肽、維生素等物質(zhì)，科學(xué)復(fù)配使植物肉不僅與傳統(tǒng)肉類的外觀、色澤、口感高度相似，氨基酸組成更合理且降低了肉類帶來(lái)的疾病患病率，為人們的健康生活方式提供了更多選擇。未來(lái)的發(fā)展中可以對(duì)不同的人群進(jìn)行評(píng)估，通過(guò)改變植物蛋白肉與真實(shí)肉的混合比例來(lái)控制蛋白質(zhì)與氨基酸的攝入，將會(huì)更有利于人類的健康，血紅蛋白及其衍生物在食品中的應(yīng)用見圖3。

4 結(jié)論與展望

微生物高效表達(dá)血紅蛋白主要通過(guò)強(qiáng)化不同宿主內(nèi)源血紅素合成途徑、敲除血紅素加氧酶等策略來(lái)減少血紅素的降解以提高血紅素的產(chǎn)量；通過(guò)調(diào)整蛋白表達(dá)策略使血紅素輔基與球蛋白高效結(jié)合，過(guò)表達(dá)血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加血紅蛋白的產(chǎn)量；通過(guò)在培養(yǎng)基中添加血紅素及血紅蛋白合成相關(guān)的輔因子及前體物質(zhì)來(lái)優(yōu)化發(fā)酵條件等策略來(lái)提高微生物血紅蛋白表達(dá)量。微生物法表達(dá)各種血紅蛋白的研究已然相對(duì)成熟，但是依然存在著諸多問(wèn)題，比如大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)還原性環(huán)境不利于蛋白質(zhì)分子間二硫鍵的形成，會(huì)造成蛋白未折疊或折疊不完全使蛋白無(wú)功能性和活性，產(chǎn)品純化比較困難[67]；非食品級(jí)的畢赤酵母底盤細(xì)胞同樣也能帶來(lái)潛在的食品安全隱患；植物來(lái)源的豆血紅蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上與動(dòng)物來(lái)源的血紅蛋白存在著一定的差異等。因此，未來(lái)應(yīng)將尋找食品級(jí)底盤細(xì)胞、運(yùn)用已成熟的血紅素改造途徑和蛋白表達(dá)策略生產(chǎn)動(dòng)物來(lái)源的血紅蛋白或者肌紅蛋白作為研究的重心。

微生物表達(dá)血紅蛋白作為未來(lái)食品的研究熱點(diǎn)，是食品和生物技術(shù)的有效結(jié)合，其囊括了合成生物學(xué)、發(fā)酵工程、基因工程等，是多學(xué)科交叉融合的產(chǎn)物。利用微生物合成的方法不僅能夠滿足人類對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)、安全、美味等方面的需求，而且可以減少資源的消耗，降低對(duì)環(huán)境的影響。以其作為調(diào)味劑應(yīng)用于植物基代肉未來(lái)食品中可滿足大眾對(duì)代肉制品視覺(jué)及口感上的需求，也證明了未來(lái)食品的生產(chǎn)模式可以更加綠色、高效和可持續(xù)。未來(lái)食品的發(fā)展前景非常廣闊，加大對(duì)未來(lái)食品、植物蛋白肉及微生物合成血紅蛋白的宣傳，提高民眾的關(guān)注與信任度，以促進(jìn)未來(lái)食品行業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

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收稿日期：2023-07-17

基金項(xiàng)目：河南省重大公益專項(xiàng)（201300110300）；中原學(xué)者工作站資助項(xiàng)目（224400510026）；河南省中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項(xiàng)目（Z20221341069）；功能糖發(fā)酵菌株創(chuàng)制及綠色生物制造關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用（231111310700）；河南省重大科技專項(xiàng)（221100110700）

作者簡(jiǎn)介：王慶沛（1997－），女，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：黃繼紅（1965－），女，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品精深加工。