陳福海 蔣林 曹建斌 蔣偉青 項(xiàng)略 顧珊燁 劉犇

硫化氫（H2S）作為一種有毒氣體，早先被認(rèn)為在非硫生物體內(nèi)無特殊生理功能。然而近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)絕大部分哺乳動(dòng)物中都含有編碼H2S 生成酶的基因，暗示其可能作為內(nèi)源性氣體遞質(zhì)發(fā)揮重要的細(xì)胞功能[1]。胱硫醚-β-合成酶（cystathionine beta-synthase，CBS）是在哺乳動(dòng)物中鑒定得到的3 個(gè)H2S 合成酶之一，當(dāng)受維生素B6催化時(shí)能使絲氨酸與同型半胱氨酸合成胱硫醚，后者進(jìn)一步代謝產(chǎn)生H2S 分子[2]。目前已有實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了穩(wěn)定的CBS 編碼基因（Cbs）敲除小鼠[3-4]，證實(shí)了CBS 在正常生理狀態(tài)和疾病中都發(fā)揮著重要功能，包括心血管、神經(jīng)、免疫、腫瘤等[5-8]。斑馬魚Danio rerio 作為低等脊椎動(dòng)物研究模型，具有個(gè)體小、易養(yǎng)殖、體外受精且早期發(fā)育快、幼魚透明易于活體成像、遺傳操作方法豐富且高效等諸多研究?jī)?yōu)勢(shì)[9]，已逐漸成為全球第三大模式動(dòng)物，并已開發(fā)出多種熒光標(biāo)記的遺傳品系供活體觀察和研究，涉及的組織器官有心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等[10]。為了更深入細(xì)致地研究CBS 的功能，尤其是在發(fā)育過程中和正常生理情況下，本研究擬構(gòu)建斑馬魚中CBS 同源的胱硫醚-β-合成酶b 基因（cystathionine beat-synthase b gene，cbsb）的敲除品系，旨在為后續(xù)深入研究胱硫醚-β-合成酶b（cystathionine beta-synthase b，Cbsb）的功能提供基礎(chǔ)動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用AB/WT 斑馬魚品系飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心感覺整合與行為研究組的斑馬魚研究平臺(tái)，采用北京愛生科技發(fā)展有限公司公司斑馬魚集中養(yǎng)殖和繁育系統(tǒng)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖條件為水溫28.5 ℃、pH 7～8 和14 h 光/10 h 暗的光照周期。收集受精卵：前1 天的傍晚將性成熟的斑馬魚按1∶1 性別比放入交配盒中，并用擋板將雌雄魚分開；次日上午取出擋板，并在20 min 內(nèi)收集剛受精的胚胎（1-cell 期）用于顯微注射。

1.2 Cbsb 序列保守性分析 從國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中獲取人（序列號(hào)：AAA98524.1）、小鼠（序列號(hào)：AAH13480.1）、大鼠（序列號(hào)：AAB02042.1）、斑馬魚（序列號(hào)：AAW78657.1）的CBS 的蛋白序列，利用ClustalX軟件分析CBS 的同源性，并利用NCBI-Blast 分析CBS的保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì) 使用成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9 系統(tǒng)建立斑馬魚基因敲除品系：利用ChopChop 網(wǎng)站（http://chopchop.cbu.uib.no/）在線設(shè)計(jì)斑馬魚cbsb 的CRISPR/Cas9 敲除靶點(diǎn)，選擇位于第4、第5 和第6 個(gè)外顯子中的4 個(gè)向?qū)NA（guide RNA，gNRA）靶點(diǎn)，用于后續(xù)測(cè)試并篩選有效的切割靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證上述設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列在AB/WT斑馬魚基因組中的正確性，從Ensembl 數(shù)據(jù)庫中獲取這4 個(gè)靶點(diǎn)處的基因組序列，根據(jù)NCBI Primer-Blast設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；采用PCR 法從AB/WT 斑馬魚基因組中擴(kuò)增中這4 個(gè)靶點(diǎn)處的基因組序列，測(cè)序，驗(yàn)證基因組中實(shí)際的靶點(diǎn)序列。引物序列見表1。

表1 斑馬魚cbsb 的引物

1.4 Cas9 mRNA 和gRNA 制備 根據(jù)T7 mMESSAGE Ultra?試劑盒（Ambion，美國(guó)，批號(hào)：AM1345）方法體外轉(zhuǎn)錄斑馬魚中密碼子優(yōu)化的Cas9 mRNA（體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒模板由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心感覺整合與行為研究組的斑馬魚研究平臺(tái)提供），并測(cè)定濃度；加入gRNA 靶點(diǎn)序列和T7 啟動(dòng)子，使用PCR 法（擴(kuò)增質(zhì)粒模板由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心感覺整合與行為研究組的斑馬魚研究平臺(tái)提供）制備gRNA 合成的DNA 模板，根據(jù)MAXIscript?T7 試劑盒（Ambion，美國(guó)，批號(hào)：AM1312）方法體外轉(zhuǎn)錄為gRNA；根據(jù)mirVana?miRNA Isolation試劑盒（Ambion，美國(guó)，批號(hào)：AM1561）方法回收和純化gRNA，并測(cè)定濃度。

1.5 顯微注射及gRNA 切割效率檢測(cè) 將Cas9 mRNA（400 mg/L）和gRNA（100 mg/L）混合物導(dǎo)入拉制好的顯微注射玻璃電極中，通過顯微注射儀（PICOSPRITZER?Ⅲ，Parker，美國(guó)；注射參數(shù)為30 psi，200 ms）將1 nL 的RNA 混合物注入1-cell 期細(xì)胞的動(dòng)物極中。使用Hanks 溶液培養(yǎng)（根據(jù)Zebrafish Book 配置），并在3 d 后選取20 枚正常發(fā)育的胚胎提取基因組，使用對(duì)應(yīng)的檢測(cè)靶點(diǎn)序列的引物擴(kuò)增靶點(diǎn)處基因組序列并測(cè)序，引物序列見表1。如果測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)處出現(xiàn)亂峰，說明基因組該靶點(diǎn)處有切割，進(jìn)一步將PCR 產(chǎn)物做T-A 克隆，多個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果與AB/WT 基因組序列比較，通過統(tǒng)計(jì)序列不一致的克隆數(shù)量計(jì)算靶點(diǎn)切割效率。

1.6 穩(wěn)定品系篩選和鑒定 將注射Cas9 mRNA和gRNA混合物的胚胎養(yǎng)殖至成年（F0 代），并與AB/WT 成年斑馬魚外交，收集子代胚胎，并選取20 枚3 d 齡子代斑馬魚基因組擴(kuò)增靶點(diǎn)處序列，通過測(cè)序檢測(cè)靶點(diǎn)處是否出現(xiàn)亂峰，出現(xiàn)亂峰的親本斑馬魚為敲除Founder。進(jìn)一步將出現(xiàn)亂峰的PCR 產(chǎn)物做T-A 克隆，測(cè)序分析后將發(fā)生移碼突變的Founder 于AB/WT 外交并養(yǎng)殖F1代。F1 代成年后通過剪尾提取基因組，通過PCR 和測(cè)序篩選cbsb 有移碼突變的斑馬魚，含有移碼突變的F1代斑馬魚進(jìn)一步外交養(yǎng)殖，同樣方法剪尾篩選獲得F2代穩(wěn)定敲除品系的雜合子。將F2 代雜合子內(nèi)交可有1/4 的概率獲得cbsb 敲除的純合子。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚Cbsb 保守性分析 ClustalX 和NCBI-Blast比對(duì)序列發(fā)現(xiàn)，斑馬魚Cbsb 序列與人的CBS 序列一致性為76.32%，與小鼠的CBS 序列一致性為74.69%，與大鼠的CBS 序列一致性為75.94%。與哺乳動(dòng)物相似，斑馬魚Cbsb 中間同樣含有一個(gè)保守CBS 結(jié)構(gòu)域，見圖1?？梢奀BS 在包含斑馬魚在內(nèi)的脊椎動(dòng)物中都非常保守，在該保守結(jié)構(gòu)域的編碼序列處設(shè)計(jì)敲除靶點(diǎn)將會(huì)有效破壞該基因產(chǎn)物的正常功能。

圖1 斑馬魚Cbsb 同源性分析

2.2 gRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及合成 利用ChopChop 在線設(shè)計(jì)斑馬魚cbsb 的敲除靶點(diǎn)，4 個(gè)靶點(diǎn)均位于Cbsb 保守結(jié)構(gòu)域編碼序列的上游，其中靶點(diǎn)1#位于第4 個(gè)外顯子上，靶點(diǎn)2#位于第5 個(gè)外顯子上，靶點(diǎn)3#和4#位于第6 個(gè)外顯子上。以AB/WT 斑馬魚基因組為PCR 模板，使用表1 引物序列擴(kuò)增，測(cè)序發(fā)現(xiàn)AB/WT 斑馬魚基因組中包含與設(shè)計(jì)靶點(diǎn)一致的序列，見圖2A。擴(kuò)增獲得約120 bps 的PCR 產(chǎn)物，即為gRNA 轉(zhuǎn)錄的DNA 模板，見圖2B。使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄gRNA 并回收，獲得的gRNA 的濃度分別為209、290、331 和222 mg/L。

圖2 gRNA 靶點(diǎn)基因組序列測(cè)序驗(yàn)證及其體外轉(zhuǎn)錄gRNA 的模板制備（A：基因組測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的gRNA 靶點(diǎn)序列比對(duì)；B：gRNA 模板電泳圖）

2.3 檢測(cè)靶點(diǎn)的切割效率 將體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA 分別和gRNA 混合，注入1-cell 期細(xì)胞的動(dòng)物極中，并獲得注射過的胚胎約100 枚，培養(yǎng)3 d。每組取20 條左右發(fā)育正常的幼魚，提取基因組并測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4#靶點(diǎn)gRNA 的斑馬魚胚胎基因組中該位點(diǎn)的序列出現(xiàn)亂峰，其余靶點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)亂峰，表明4#靶點(diǎn)被Cas9/gRNA 混合物切割，見圖3A。T-A 克隆并測(cè)序，序列分析表明4#靶點(diǎn)處基因組序列被切割，切割效率為33.33%（5/15），見圖3B。上述結(jié)果表明設(shè)計(jì)的gRNA 4#可高效切割斑馬魚cbsb 中對(duì)應(yīng)的基因組上靶點(diǎn)，可通過該靶點(diǎn)來制備斑馬魚cbsb 敲除品系。

圖3 不同gRNA 注射后檢測(cè)基因組切割效率（A：注射Cas9/gRNA 混合物后幼魚基因組測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的gRNA 序列比對(duì)；B：4#靶點(diǎn)序列改變及切割效率）

2.4 F0 代養(yǎng)殖和Founder 篩選 從gRNA 4#注射后的剩余胚胎中取40 條正常發(fā)育的幼魚繼續(xù)培養(yǎng)至F0 代性成熟，優(yōu)先使用F0 代雄魚外交；取20 條子代幼魚的混合基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并測(cè)序，選取在靶點(diǎn)處出現(xiàn)亂峰的樣本，即為Founder。首批共9 條雄魚外交，篩選后發(fā)現(xiàn)其中7 條出現(xiàn)亂峰，暗示該位點(diǎn)切割后產(chǎn)生的插入/刪除序列遺傳至下一代斑馬魚，見圖4。其中Founder 5#、10#、12#和13#在靶點(diǎn)處出現(xiàn)顯著亂峰，推測(cè)這些Founder 子代中出現(xiàn)cbsb 破壞的斑馬魚概率較高。選擇Founder 5#和10#的子代幼魚進(jìn)一步養(yǎng)殖，以篩選穩(wěn)定的cbsb 敲除雜合子品系。

圖4 F0 子代幼魚基因組測(cè)序篩選cbsb 敲除Founder

2.5 F1 代鑒定及穩(wěn)定品系傳代 剪尾篩選發(fā)現(xiàn)，25條Founder 5#和10#的成年子代（F1 代）中，17條基因組該位點(diǎn)都出現(xiàn)亂峰，進(jìn)一步分析峰圖和亂峰起始位置可見，F(xiàn)1代含有3種不同的基因組改變方式，見圖5A；對(duì)這些F1 代斑馬魚的PCR 產(chǎn)物克隆后測(cè)序，鑒定確認(rèn)為-8 bp、-3+13 bps 和-228 bps 處基因組改變，見圖5B。選擇-3+13 bps 和-228 bps 的兩種子代傳代，得到-3+13 bps 改變的穩(wěn)定品系，命名為Ko（cbsb）a，-228 bps改變的穩(wěn)定品系，命名為Ko（cbsb）b。將這兩種品系各自內(nèi)交并養(yǎng)殖F2 代，剪尾測(cè)序篩選并驗(yàn)證基因組序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變可穩(wěn)定遺傳，即可獲得cbsb 敲除斑馬魚的純合子，見圖5C。序列分析表明，Ko（cbsb）a品系可產(chǎn)生長(zhǎng)為285 個(gè)氨基酸的Cbsb 截?cái)喈a(chǎn)物，Ko（cbsb）b品系整個(gè)6#外顯子幾乎全部刪除，其轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)移碼突變，產(chǎn)生長(zhǎng)為216 個(gè)氨基酸的Cbsb 截?cái)喈a(chǎn)物，見圖5D。

圖5 穩(wěn)定cbsb 敲除品系篩選和鑒定（A：F1 代剪尾測(cè)序篩選cbsb 敲除雜合子；B：F1 代T-A 克隆并測(cè)序確認(rèn)基因組改變方式；C：F2 代剪尾測(cè)序鑒定cbsb 敲除純合子；D：編碼序列分析穩(wěn)定cbsb 敲除品系產(chǎn)生截?cái)嗟腃bsb）

3 討論

對(duì)人類遺傳疾病的研究發(fā)現(xiàn)，Cbs 的突變與胱硫醚尿癥相關(guān)，臨床表現(xiàn)為眼、骨骼、大腦、血管等組織的病變[11-12]。在小鼠模型中，敲除Cbs 導(dǎo)致小鼠血漿中同型半胱氨酸水平上升為正常小鼠的40 倍，并導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲緩表型，多數(shù)模型小鼠在出生后5 周內(nèi)死亡。這些結(jié)果表明小鼠完全缺乏CBS 可導(dǎo)致嚴(yán)重同型半胱氨酸血癥[13]。

血漿中同型半胱氨酸水平升高被認(rèn)為是心血管相關(guān)疾病的危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)Cbs 敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的高血壓和血管舒張性降低，提示H2S 是一種生理性血管擴(kuò)張劑和血壓調(diào)節(jié)劑[13]。Cbs 敲除的老年小鼠中，主動(dòng)脈環(huán)對(duì)乙酰膽堿的舒張選擇性受損，血栓調(diào)節(jié)蛋白抗凝血活性降低[14]，其肺部的血管生長(zhǎng)也顯著降低[15]。同時(shí)敲除Cbs 和apolipoprotein E 則導(dǎo)致無飲食誘導(dǎo)下的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[16]。敲除Cbs 還會(huì)導(dǎo)致高血壓以及血管的不良重塑[17-18]。可見CBS 對(duì)于血管的正常生長(zhǎng)和功能起到了重要作用。

CBS 還在其它多種生理和病理過程中發(fā)揮作用。如Cbs 敲除小鼠表現(xiàn)出貧血，血清、肝臟、脾臟和心臟中的鐵含量顯著增加，肝臟嚴(yán)重受損，出現(xiàn)血色素沉著癥樣表型，表明CBS 參與了體內(nèi)的鐵離子穩(wěn)態(tài)[19]。斑馬魚發(fā)育模型中，cbsb 瞬時(shí)敲降會(huì)導(dǎo)致部分胚胎出現(xiàn)體軸彎曲，暗示其可能在體軸發(fā)育中也發(fā)揮關(guān)鍵的作用[20]。在小鼠炎癥模型中，敲除小膠質(zhì)細(xì)胞的Cbs可導(dǎo)致炎癥和神經(jīng)元凋亡增加，而過表達(dá)Cbs 降低了炎癥及其相關(guān)因子的表達(dá)水平，表明其對(duì)免疫系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用[7]。另外，Cbs 在腎臟系統(tǒng)、肝臟系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、紅細(xì)胞生成、腫瘤發(fā)生等中發(fā)揮特定的功能[12，21-24]。可見CBS 涉及的功能十分廣泛。

CRISPR 是原核生物所特有的一種抵御外源性遺傳物質(zhì)的免疫系統(tǒng)，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用于斑馬魚基因敲除品系建立。本研究基于CBS在斑馬魚中的保守性，使用CRISPR/Cas9 建立了斑馬魚cbsb 敲除模型。本研究通過測(cè)序和精細(xì)序列分析來檢測(cè)敲降效率、篩選穩(wěn)定品系、鑒定雜合子/純合子等，減少了技術(shù)環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)化了敲除品系方法和流程，為后續(xù)斑馬魚敲除品系的制備和傳代提供借鑒的方法。本研究成功構(gòu)建的cbsb 敲除穩(wěn)定品系可與現(xiàn)有的斑馬魚多種熒光標(biāo)記品系（如血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腎臟細(xì)胞等）雜交，從而獲得cbsb 穩(wěn)定敲除且具熒光標(biāo)記的模型，借助斑馬魚活體成像技術(shù)和高通量技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，為進(jìn)一步研究cbsb 在生理和病理過程中的精細(xì)功能提供基礎(chǔ)。