呂凱紅 ，胡玉梅 ，錢夢雨 ，李 璐，劉文君 ，曹 亮，李吉峰，王振中，章晨峰，肖 偉*

（1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198； 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001； 3.中藥制藥過程控制與智能制造全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001； 4.江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210046）

筋骨止痛凝膠全方由醋延胡索、川芎、威靈仙、伸筋草、東北透骨草、路路通、海桐皮、防風(fēng)、花椒、牛膝、薄荷腦、冰片共12 味藥材組成，具有活血理氣、祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效，臨床上用于改善膝骨關(guān)節(jié)炎、腎虛、筋脈淤滯等癥狀。由于該方所含藥材眾多、成分復(fù)雜，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制尚不明確。目前化學(xué)成分研究方面，秦建平等［1］建立了高效液相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜，指認(rèn)了12 個(gè)共有峰； 王偉等［2］利用HPLC 測定了指標(biāo)成分延胡索乙素和原阿片堿的含量； 劉莉莉等［3］利用GC 測定了揮發(fā)性成分冰片和薄荷腦的含量，但缺乏對(duì)復(fù)方非揮發(fā)性成分的全面分析。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS） 技術(shù)對(duì)筋骨止痛凝膠非揮發(fā)性成分進(jìn)行快速分離和鑒定，并對(duì)其藥材來源進(jìn)行歸屬，以期全面建立筋骨止痛凝膠化學(xué)成分譜，為明確藥效物質(zhì)、闡明作用機(jī)制、提升質(zhì)量控制水平提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1290 infinity 超高效液相色譜，聯(lián)用Agilent 6538 Q-TOF 質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源（ESI）、Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 軟件（美國Agilent公司）； MIKRO 200 高速離心機(jī)（德國Andreas Hettich 公司）； Pacific T Ⅱ7 超純水儀 （美國賽默飛公司）； KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Metller AL204 電子分析天平［梅特勒-托利多（上海） 有限公司］。

歐當(dāng)歸內(nèi)酯A （批號(hào)111826-201806）、鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)110732-201913）、苦參堿（批號(hào)110805-202010）、蘆?。ㄅ?hào) 100080-202012）、路路通酸 （批號(hào) 111735-201903）、延胡索乙素（批號(hào)110726-202020）、升麻素苷（批號(hào)111522-201913）、金絲桃苷（批號(hào)111521-201507）、綠原酸 （批號(hào)110753-201817）、咖啡酸 （批號(hào)110885-201703）、補(bǔ)骨脂素 （批號(hào)110739-201918）、原阿片堿（批號(hào) 110853-201805）、鹽酸黃連堿 （批號(hào) 112026-201802）、鹽酸川芎嗪（批號(hào)110817-201608）、蛇床子素（批號(hào)110822-202111）、黃芩素（批號(hào)111595-201808）、鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-202015）、阿魏酸松柏酯（批號(hào)CHB201106）、β-蛻皮甾酮（批號(hào)111638-201706） 對(duì)照品均購自中國食品藥品研究院； 洋川芎內(nèi)酯H （批號(hào)B21462）、羥基-α-山椒素（批號(hào)B26430）、羥基-β-山椒素（批號(hào)B26431）、紫花前胡素（批號(hào)B50638）、四氫小檗堿（批號(hào)B21206）、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)B21463） 對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司； 丁烯基苯酞 （批號(hào)CHB201122）、正丁基苯酞（批號(hào)CHB201116） 對(duì)照品購自成都克洛瑪生物科技有限公司； 海罌粟堿（批號(hào)475-81-0）、東莨菪內(nèi)酯（批號(hào)92-61-5） 對(duì)照品購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司； 去氫延胡索甲素（批號(hào)21081004）、延胡索甲素（批號(hào)21092302） 對(duì)照品購自成都格利普生物科技有限公司； 脫氫海罌粟堿（批號(hào)CFN90406） 對(duì)照品購自武漢Chem Face 公司；E-藁本內(nèi)酯（批號(hào)20191229） 對(duì)照品購自南京森貝伽生物科技有限公司。筋骨止痛凝膠（批號(hào)210101，江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司）； 處方藥材購自主產(chǎn)區(qū)或道地產(chǎn)區(qū)，經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司王振中研究員鑒定，醋延胡索為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang.的干燥塊莖； 川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖； 花椒為蕓香科植物花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.的干燥成熟果皮；防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根； 牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根； 威靈仙為毛茛科植物威靈仙ClematischinensisOsbeck.的干燥根和根莖； 路路通為金縷梅科植物楓香樹LiquidambarformosanaHance.的干燥成熟果序； 伸筋草為石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草； 東北透骨草為豆科野豌豆屬植物山野豌豆ViciacraccaL.的干燥地上全草； 海桐皮為豆科喬木刺桐ErythrinavariegateL.var.orientalis（L.） Merr 的樹皮。乙腈、甲酸均為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A） -0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～8 min，3% ～15% A； 8～20 min，15%A，20～30 min，15% ～30% A； 30～38 min，30% ～45% A；38～45 min，45% ～60% A； 45 ～48 min，60% ～95% A；48～50 min，95% ～3% A）； 體積流量0.35 mL/min； 柱溫35 ℃； 進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 一級(jí)全掃描： 電噴霧離子源（ESI）； 正、負(fù)離子模式； 裂解電壓135 V； 錐孔電壓65 V； 干燥氣氮?dú)猓瑴囟?50 ℃，體積流量8 L/min； 霧化氣氮?dú)?，壓?0 psi（1 psi ＝6.895 kPa）。二級(jí)掃描： 質(zhì)量掃描范圍m/z50 ～1 500； 碰撞氣氮?dú)?，碰撞能?5 eV。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，使各成分質(zhì)量濃度為20 μg/mL，14 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 稱取筋骨止痛凝膠約1 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，14 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 單味飲片溶液制備

2.2.3.1 花椒、川芎和防風(fēng)單味飲片溶液制備 按照筋骨止痛凝膠生產(chǎn)工藝，分別取飲片20 g，加入10 倍量水回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，干燥，得干膏。取適量干膏，按 “2.2.1” 項(xiàng)下方法配制成20 mg/mL 的單味飲片溶液。

2.2.3.2 醋延胡索、伸筋草、東北透骨草、路路通、海桐皮、牛膝和威靈仙單味飲片溶液制備 按照筋骨止痛凝膠生產(chǎn)工藝，分別取飲片20 g，加入10 倍量70%乙醇提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至小體積，干燥，得干膏。取適量干膏，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法配制成20 mg/mL 的單味飲片溶液。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立 查閱中英文相關(guān)文獻(xiàn)，建立延胡索、川芎、威靈仙、伸筋草、東北透骨草、路路通、海桐皮、防風(fēng)、花椒、牛膝10 味藥材化合物數(shù)據(jù)庫，包括化合物名稱、結(jié)構(gòu)、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量、特征碎片離子、所屬化學(xué)類型等信息。

3.2 化合物鑒定 利用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)，將供試品和對(duì)照品溶液在“2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，得到正、負(fù)離子的總離子流圖（TIC），見圖1。正、負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜檢測得到的精確相對(duì)分子質(zhì)量，利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 軟件生成的化合物分子式，選擇誤差在10 ppm 以內(nèi)的分子式與建立的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，推測出可能的化合物，進(jìn)一步結(jié)合Auto MS/MS模式獲得的相應(yīng)化合物碎片離子信息與對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)的比對(duì)進(jìn)行化合物的鑒定。本研究共鑒定100 個(gè)化合物，其中28 個(gè)化合物經(jīng)對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)，其中化合物2、4～8、10、14～22、28 ～29、32、38、41、44 ～48、50 ～51、53 ～54、56 ～58、60、63、75 ～76、78、91、95 均是含氮化合物； 3、42～43、77、79、80 ～81、83 ～85、97 ～100 均是苯酞類化合物； 23 ～24、26 ～27、30 ～31、33、35、39 ～40、49、52、55、59、61～62 均是黃酮類化合物； 64 和66 是香豆素類化合物； 65、67 ～74、82、86 ～90 是三萜皂苷類化合物； 1、9、11～13、25、34、36～37、92 ～94、96 是其他類化合物，結(jié)果見表1。

圖1 筋骨止痛凝膠供試品TIC 圖

表1 筋骨止痛凝膠中的化合物的UPLC-ESI-Q-TOF MS/MS 鑒定

3.3 筋骨止痛凝膠中化合物成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律解析

3.3.1 含氮類化合物 筋骨止痛凝膠中的含氮類化合物有生物堿類和酰胺類，生物堿類主要來源于醋延胡索、伸筋草。延胡索藥材的生物堿成分大致可以分為4 個(gè)類型［30］，結(jié)構(gòu)見圖2。具體的二級(jí)裂解途徑為四氫原小檗堿型生物堿（Ⅰ），A 和D 環(huán)的取代基最常見的是羥基、甲氧基和亞甲二氧基，此結(jié)構(gòu)的C 環(huán)易發(fā)生逆狄爾斯-阿爾得（RDA） 反應(yīng)，常見的特征碎片離子是m/z165.09，192.10，177.08，化合物32、45～46、50 均為Ⅰ類生物堿，以延胡索乙素（45） 為例，在正離子模式下，化合物45 在一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰是m/z356.18 ［M＋H］＋，在二級(jí)質(zhì)譜中，［M＋H］＋經(jīng)過RDA 反應(yīng)產(chǎn)生特征碎片離子m/z165.09 和m/z192.10，分別進(jìn)一步丟失甲基，產(chǎn)生碎片離子m/z150.17，可能的裂解途徑見圖3； 原小檗堿型生物堿（Ⅱ），不會(huì)發(fā)生RDA 反應(yīng)，8 位的H 易丟失，丟失CH4形成共軛體系，常見的特征碎片離子包括m/z322.09，323.11，324.12，336.12，化合物47、51、53、56 ～58、60均為Ⅱ類生物堿； 原阿片堿型生物堿（Ⅲ），會(huì)發(fā)生RDA反應(yīng)，但是RDA 反應(yīng)的碎片離子的質(zhì)荷比加和不等于準(zhǔn)分子離子峰的質(zhì)荷比，一般相差一分子H2O，其典型碎片離子是m/z206.08，化合物38 為Ⅲ類生物堿； 阿樸啡型生物堿（Ⅳ），一般會(huì)產(chǎn)生相較于準(zhǔn)分子離子峰31.04 Da 的碎片離子，m/z31.04 （NH2CH3） 是很典型的辨識(shí)阿樸啡型生物堿的標(biāo)志。4 個(gè)類型的結(jié)構(gòu)見圖2。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，化合物38、41、45、48、50～51、53、57～58 分別確認(rèn)為原阿片堿、脫氫海罌粟堿、延胡索乙素、海罌粟堿、四氫小檗堿、紫堇堿、巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿。

圖2 4 種類型的延胡索生物堿

伸筋草中生物堿依據(jù)文獻(xiàn)可大致分為2 種類型，含有1個(gè)N 原子的生物堿和含有2 個(gè)N 原子的生物堿，在筋骨止痛凝膠中檢測到的化合物2、5～8、14、64 均為含有1 個(gè)N原子的生物堿； 化合物10、17～18 是含有2 個(gè)N 原子的生物堿，該類生物堿最常見的質(zhì)譜裂解過程為與N 原子相連的甲基的裂解。以化合物10 為例，在正離子模式下，在一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰是m/z261.19 ［M＋H］＋，在二級(jí)質(zhì)譜中，［M＋H］＋丟失NH3后形成特征碎片m/z244.16 ［M＋H- NH3］＋，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)為N-去甲基-α-玉柏堿（N-demethy-α-obscurine），可能的裂解途徑見圖4。

圖4 N-去甲基-α-玉柏堿的二級(jí)質(zhì)譜及可能的裂解途徑

酰胺類化合物主要來源于花椒藥材，在正離子模式下，化合物75～76、78 的酰氨基常裂解產(chǎn)生由于酰胺鍵斷開而產(chǎn)生丟失氨基部分的m/z175.11 碎片離子。以化合物78 為例，其在一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰是m/z264.19 ［M＋H］＋，在二級(jí)質(zhì)譜中，［M＋H］＋丟失氨基部分而形成特征碎片m/z175.11 ［M＋H-C4H10NO］＋，失去一分子CO 碎片離子產(chǎn)生m/z147.11 ［M ＋H-C4H10NO-CO］＋，繼續(xù)丟失碎片C3H4產(chǎn)生m/z107.08 ［M＋H-C4H10NO-CO-C3H4］＋?；衔?8 經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)為羥基-β-山椒素，其可能的裂解途徑見圖5?；衔?5 ～76 經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，分別確認(rèn)為羥基-ε-山椒素和羥基-α-山椒素?；衔?1 依據(jù)碎片離子信息與文獻(xiàn)比對(duì)，鑒定為α-山椒素［27］。

圖5 羥基-β-山椒素的二級(jí)質(zhì)譜及可能的裂解途徑

3.3.2 苯酞類化合物 苯酞類化合物來源于川芎，苯酞類化合物裂解時(shí)最常見特征為內(nèi)酯環(huán)開裂，含有不飽和側(cè)鏈的化合物一般會(huì)丟失C2H5和CO 中性分子，化合物42～43、77、79、83 屬于此類苯酞； 含有飽和側(cè)鏈的化合物一般會(huì)丟失C4H9和CO 中性分子，側(cè)鏈還常見丟失H2O 分子，化合物3、80～81 屬于此類苯酞?；衔?2 和43 是同分異構(gòu)體，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，分別為洋川芎內(nèi)酯I 和洋川芎內(nèi)酯H?；衔?3～84 的出峰位置很接近，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，分別確認(rèn)為丁烯基苯酞和正丁基苯酞。

以化合物85 為例，在正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜中準(zhǔn)分子離子峰為m/z191.10 ［M＋H］＋，在二級(jí)質(zhì)譜中，內(nèi)酯環(huán)開裂失去一分子H2O，產(chǎn)生碎片離子m/z173.09 ［M＋HH2O］＋，失去一分子CO 碎片離子產(chǎn)生m/z145.10 ［M＋HH2O-CO］＋，繼續(xù)丟失C2H4碎片離子m/z117.06 ［M ＋HH2O-CO- C2H4］＋，也會(huì)重排之后丟失C2H4而產(chǎn)生碎片離子m/z163.11 ［M＋H- C2H4］＋，化合物85 與對(duì)照品E-藁本內(nèi)酯裂解途徑一致，故確定為E-藁本內(nèi)酯，其可能的裂解途徑見圖6。

圖6 E-藁本內(nèi)酯的二級(jí)質(zhì)譜及可能的裂解途徑

3.3.3 香豆素類化合物 香豆素類化合物主要來源于防風(fēng)和花椒，其裂解時(shí)一般會(huì)丟失CO 和CO2碎片離子，這是因?yàn)榇送緩接行纬筛€(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu)的趨勢。化合物64 為呋喃香豆素類，化合物66 為簡單香豆素類，兩者均會(huì)丟失CO 碎片離子。在正離子模式下，化合物64 在一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰是m/z217.04 ［M＋H］＋，在二級(jí)質(zhì)譜中，［M＋H］＋丟失一分子CH3形成特征碎片離子m/z202.02 ［M＋H- CH3］＋，丟失一分子CO 形成特征碎片離子m/z174.02［M＋H-CH3-CO］＋，繼續(xù)丟失兩分子CO 形成特征碎片m/z146.03 ［M＋H-CH3-2CO］＋，故確認(rèn)為花椒毒素，其可能的裂解途徑見圖7； 化合物66 在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z193.12 ［M＋H］＋，二級(jí)碎片離子m/z178.02 ［M＋H-CH3］＋、137.06 ［M＋H-2CO］＋和m/z122.96 ［M＋H-2COCH3］＋，因此推斷為東莨菪素。

圖7 花椒毒素的二級(jí)質(zhì)譜及可能的裂解途徑

3.3.4 黃酮類化合物 黃酮類化合物主要來源于防風(fēng)、花椒和東北透骨草。黃酮類化合物以2-苯基色圓酮為母核，其二級(jí)質(zhì)譜常發(fā)生糖苷鍵斷裂，形成苷元離子。黃酮及其苷類化合物C 環(huán)易發(fā)生RDA 裂解反應(yīng)，以及不飽和C 環(huán)丟失一分子CO 成五元環(huán)，一些苷元會(huì)脫H2O、CH3以及C4H4O2碎片。以金絲桃苷（31） 為例，在負(fù)離子模式下，峰31 在一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰是m/z463.09 ［M-H］-，在二級(jí)質(zhì)譜中，［M-H］-丟失葡萄糖基，產(chǎn)生了特征碎片m/z300.02 ［M-H-Glc］-，繼續(xù)丟失一分子CO 形成特征碎片m/z271.02 ［M-H-Glc-CO］-； ［M-H］-也可能經(jīng)過RDA反應(yīng)產(chǎn)生特征碎片m/z151.00 和m/z313.08，化合物31 與對(duì)照品金絲桃苷的裂解途徑一致，因此將峰31 確認(rèn)為金絲桃苷，其可能的裂解過程見圖8?；衔?3、24、31 經(jīng)與對(duì)照品和文獻(xiàn)［13，29-30］ 比對(duì)，分別確認(rèn)為蘆丁、升麻素苷、金絲桃苷。

圖8 金絲桃苷的二級(jí)質(zhì)譜及可能的裂解途徑

3.3.5 三萜皂苷類化合物 三萜皂苷類化合物主要來源于牛膝和威靈仙，三萜皂苷類化合物一般是皂苷的糖苷鍵發(fā)生斷裂。皂苷所連糖基有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等，依據(jù)丟失的質(zhì)荷比可以判斷糖基的類型。牛膝皂苷和威靈仙皂苷的苷元均為齊墩果酸母核。以chikusetsusaponin Ⅳ（70） 為例，化合物70 在一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰m/z925.48 ［M-H］-，在二級(jí)質(zhì)譜中，先丟失1 分子阿拉伯糖基產(chǎn)生碎片離子m/z793.43 ［M-H-Ara］-，丟失葡萄糖基產(chǎn)生碎片離子m/z631.39 ［M-H-Ara-Glu］-，推斷化合物70 是chikusetsusaponin Ⅳ［16］，其可能的裂解途徑見圖9。根據(jù)以上裂解規(guī)律，峰65、67～69、71 ～74、82、86 ～90，分別確認(rèn)為clematichinenoside C、huzhangoside B、pen-rha-pen-oleglc-glc、ginsenosideRo、chikusetsusaponinⅣa、achyranthoside C、achyranthoside E、achyranthoside B or bidentatoside I、zingibroside R1、achyranthoside Ⅳ、28-deglucosyl-achyrantho-side C、28-deglucosylchikusetsusa-poninⅣ、28-deglucosychikusetsusa-ponin Ⅳ a、28-deglucosylachyrantho-side E。

圖9 chikusetsusaponin Ⅳ的二級(jí)質(zhì)譜及可能的裂解途徑

4 討論

為獲得較好的分離，本實(shí)驗(yàn)前期考察了流動(dòng)相，包括0.8%甲酸（含有0.1% 甲酸銨） -乙腈、0.1% 甲酸-甲醇、0.1%三乙胺-乙腈、0.1%甲酸-乙腈等，采用不同梯度進(jìn)行洗脫，最終確定0.1% 甲酸-乙腈梯度洗脫條件下各成分分離度良好，出峰數(shù)目較多。

本實(shí)驗(yàn)通過保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰、二級(jí)碎片離子信息對(duì)各個(gè)色譜峰進(jìn)行了歸屬，共鑒別100 個(gè)化合物，28個(gè)化合物經(jīng)對(duì)照品比對(duì)得到確認(rèn)，并推測了含氮類、苯酞類、香豆素類、黃酮類和三萜皂苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，化合物主要來源于延胡索、川芎、威靈仙，東北透骨草、路路通、海桐皮、防風(fēng)、花椒，未鑒定出薄荷腦和來源于冰片的化合物，因?yàn)楸『赡X和冰片中的化合物為揮發(fā)性成分，后期需進(jìn)一步采用GC-MS 對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒別，完善了筋骨止痛凝膠的物質(zhì)基礎(chǔ)信息。

本研究結(jié)果表明筋骨止痛凝膠主要化學(xué)成分為生物堿類、苯酞類、黃酮類和三萜皂苷類，主要來自于延胡索、川芎、海桐皮、花椒等，明確了這些藥味在方中的貢獻(xiàn)，為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考。