郭 旺，姜澤平，馬 磊，喬 娟，莫文清，靳海波，何廣湘，黃永東，張榮月

（1. 北京石油化工學(xué)院新材料與化工學(xué)院，燃料清潔化及高效催化減排技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102617；2. 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190）

隨著生物制藥規(guī)模的不斷增大，對(duì)下游分離純化技術(shù)的要求越來(lái)越高［1］. 層析分離作為一種主流的分離純化技術(shù)，由于具有操作溫和、 易放大等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于蛋白分離純化中［2］. 其中，層析介質(zhì)性能是影響分離純化效率的關(guān)鍵，傳統(tǒng)多糖基質(zhì)的層析介質(zhì)的孔徑?。?0～50 nm）、 質(zhì)地軟（耐壓＜0.3 MPa），在高通量分離純化應(yīng)用中受到一定的限制，而有機(jī)聚合物基質(zhì)的層析介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度高（可耐壓10 MPa以上）、 孔徑大（＞100 nm），因此能更好地滿足高通量分離的需求［3］. 聚合物層析介質(zhì)孔徑大，有利于蛋白等大分子的快速傳質(zhì)，但隨著孔徑增加其比表面積降低，致使蛋白吸附容量降低［4］，因此提高大孔聚合物層析介質(zhì)的蛋白吸附容量具有重要意義.

接枝聚合物長(zhǎng)鏈?zhǔn)翘岣邔游鼋橘|(zhì)容量的常用方法之一. 小分子配基偶聯(lián)的層析介質(zhì)在二維平面吸附蛋白，其吸附容量有限； 而聚合物長(zhǎng)鏈在介質(zhì)表面的構(gòu)象豐富且易伸展，形成的接枝層能夠在三維空間吸附蛋白質(zhì)，極大地提高了蛋白結(jié)合容量［5］. 聚合物接枝方法主要有兩種： 聚合物直接接枝（“grafting to”）和小分子單體接枝聚合（“grafting from”）［6］. “Grafting to”法是在基質(zhì)上偶聯(lián)具有一定分子量的聚合物［7］. 其中，在交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)上分別接枝葡聚糖［8］或聚乙烯亞胺（PEI）［9］，經(jīng)過(guò)表面修飾得到陽(yáng)離子層析介質(zhì)和陰離子層析介質(zhì)，其蛋白吸附容量相比于非接枝型介質(zhì)可提升1倍以上.“Grafting from” 方法是單體在基質(zhì)表面引發(fā)接枝聚合形成聚合物長(zhǎng)鏈［10，11］，其位阻較小易形成較為均勻的接枝層［12］. 其中，原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）是grafting from 經(jīng)典的接枝方法，該方法由于接枝的聚合物易控［13］而便于研究接枝鏈長(zhǎng)度和接枝密度對(duì)蛋白結(jié)合容量的影響. 如，在纖維素基質(zhì)［14］和瓊脂糖基質(zhì)［15］表面分別引發(fā)帶負(fù)電荷的功能單體接枝聚合，制得的強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)的蛋白結(jié)合容量大幅度提升. 采用ATRP引發(fā)接枝，通常需要先用2-溴異丁酰溴在基質(zhì)表面引入具有引發(fā)活性的基團(tuán)［16］，該反應(yīng)需要嚴(yán)格的無(wú)水環(huán)境［17］，而對(duì)于多孔微球尤其親水性較好的基質(zhì)，其除水過(guò)程復(fù)雜，且需要大量的無(wú)水有機(jī)溶劑，因此在大規(guī)模進(jìn)行層析介質(zhì)生產(chǎn)中受到一定限制. 氧化還原引發(fā)接枝聚合的操作條件相對(duì)較為溫和［18］，基質(zhì)表面的羥基常用作還原劑與氧化劑組成引發(fā)體系. 如Wang等［19］用硝酸鈰銨作為氧化劑，在纖維素基質(zhì)（—OH 作為還原劑）上制備了弱陰離子交換介質(zhì)，對(duì)牛血清白蛋白（BSA）的靜態(tài)結(jié)合容量比未接枝介質(zhì)提升2倍. Machado 等［20］在聚（丙烯酰胺）基質(zhì)上通過(guò)氧化還原法制備了陽(yáng)離子交換介質(zhì)，對(duì)乳白蛋白的吸附容量達(dá)到210 mg/mL.

綜上所述，當(dāng)前研究多集中于以多糖微球?yàn)榛|(zhì)的離子交換介質(zhì)，但多糖基質(zhì)的孔徑較小，其孔道表面接枝聚合物長(zhǎng)鏈后孔道尺寸會(huì)進(jìn)一步降低，從而影響其對(duì)生物大分子的孔內(nèi)傳質(zhì). 而以大孔聚合物微球?yàn)榛|(zhì)的孔道尺寸較大，表面接枝聚合物長(zhǎng)鏈對(duì)孔道尺寸影響較小，能更好地提升該類介質(zhì)的蛋白吸附容量. 基于此，本文以大孔聚丙烯酸酯類微球?yàn)榛|(zhì)，采用氧化還原引發(fā)體系在微球表面接枝甲基丙烯酸，研究了接枝聚合各因素對(duì)吸附容量的影響，建立了弱陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)的制備方法，為該類層析介質(zhì)的設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供了理論參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

大孔聚合物微球FastSep-epoxy（表面富含環(huán)氧基），北京博爾賽譜生物科技有限公司； 甲基丙烯酸（MAA），分析純，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司； 考馬斯藍(lán)G-250、 過(guò)硫酸鉀（KPS）和三-（羥甲基） 氨基甲烷，分析純，北京伊諾凱科技有限公司； 溶菌酶（Lys），分析純，上海麥克林生化科技有限公司；CM Sepharose FF（瓊脂糖基質(zhì)弱陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)）購(gòu)自于Cytiva公司； 十二烷基硫酸鈉，分析純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，分析純，北京百靈威科技有限公司.

SHA-BA型水浴恒溫振蕩器（IS），金壇市榮華儀器制造有限公司； E1677型垂直混合儀（VM），寧波新芝生物科技股份有限公司； L5 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-Vis），上海儀電分析儀器有限公司；UPC10 AKTA 型自動(dòng)純化系統(tǒng)（AKTA），美國(guó)GE 公司； 掃描電子顯微鏡（SEM），韓國(guó)COXEM 公司；TG16型臺(tái)式高速離心機(jī)（TMHSC），上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司； Spectrum 100型傅里葉紅外光譜儀（FTIR），美國(guó)Perkin Elmer公司； Autopore IV 9500型壓汞儀（MIP），美國(guó)Micromeritics公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 弱陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)的制備 大孔弱陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)的制備過(guò)程如圖1所示. （1） Fast-Sep-epoxy 微球水解： 將 20 g 干燥恒重的大孔FastSep-epoxy 微球與200 mL 0.5 mol/L H2SO4加入500 mL錐形瓶中，反應(yīng)10 h后，用去離子水洗滌至中性，標(biāo)記為 FastSep-OH. （2） 接枝聚合甲基丙烯酸（MAA）單體： 取10 mL水解后的微球與一定量的甲基丙烯酸（MAA）混合并通入氮?dú)?，加入一定量的過(guò)硫酸鉀（KPS），于35 ℃進(jìn)行接枝聚合反應(yīng). 反應(yīng)完畢將制得的微球用去離子水洗滌至中性，標(biāo)記為 FastSep-PMAA.

Fig.1 Preparation of weak cation exchange chromatography medium

1.2.2 靜態(tài)結(jié)合容量測(cè)定 以Lys為模型蛋白，采用間歇式結(jié)合方法測(cè)定靜態(tài)結(jié)合容量（Static binding capacity，QSBC）［21］. 量取一定體積的FastSep-PMAA 微球，加入已知濃度蛋白溶液于離心管中（以170 r/min轉(zhuǎn)速吸附12 h），然后測(cè)定上層清液的吸光值（檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm），最后根據(jù)吸光值以及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QSBC. 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值.

式中：c0（mg/mL）為L(zhǎng)ys溶液初始濃度；c1（mg/mL）為L(zhǎng)ys溶液剩余濃度；V1（mL）為L(zhǎng)ys溶液體積；V2（mL）為層析介質(zhì)的體積.

1.2.3 離子交換容量測(cè)定 參照文獻(xiàn)［22］方法測(cè)定離子交換容量（Ion exchange capacity，QIC）. 取已知體積的介質(zhì)用1.0 mol/L HCl 溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)型（30 min），然后將介質(zhì)洗滌至中性，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液中和介質(zhì)，最后用標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定收集液，記錄體積. 采用下計(jì)算QIC. 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值.

式中：cNaOH（mol/L）為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；cHCl（mol/L）為HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；VNaOH（mL）為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；VHCl（mL）為HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；V球（mL）為微球體積.

1.2.4 動(dòng)態(tài)結(jié)合容量測(cè)定 測(cè)定了不同介質(zhì)的Lys動(dòng)態(tài)結(jié)合容量（Dynamic binding capacity，QDBC）［3］，先用20 mmol/L PB緩沖溶液（pH=7.0）平衡層析柱（5.0 mm×30.0 mm）至基線平穩(wěn)，設(shè)定流速為150 cm/h；然后開(kāi)始進(jìn)樣（3.0 mg/mL Lys溶液）并記錄橫坐標(biāo)V1，待流穿10%時(shí)記錄橫坐標(biāo)V2； 最后，用0.5 mol/L NaCl的PB緩沖溶液進(jìn)行洗脫. 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值.

式中：c（mg/mL）為蛋白液濃度；V1（mL）為蛋白進(jìn)樣體積；V2（mL）為10%流穿體積；V球（mL）為微球體積.

1.2.5 不同鹽濃度、 pH 值下的QSBC測(cè)定 配制含有不同濃度NaCl（0.1～0.5 mol/L）以及不同pH 值（6.0～10.0）的PB緩沖溶液. 量取1.0 mL微球與已知濃度的Lys溶液混合. 按 1.2.2節(jié)方法測(cè)定不同鹽濃度、 pH值下的QSBC. 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值.

1.2.6 溶菌酶回收率測(cè)定 測(cè)定了不同介質(zhì)的Lys 回收率. 安裝層析柱（5.0 mm×30.0 mm）并通過(guò)1.0 mL定量環(huán)上樣3.0 mg/mL 的Lys 溶液（流速為150 cm/h），吸附5 min后，用0.5 mol/L NaCl 的PB洗脫液進(jìn)行梯度洗脫. 積分計(jì)算洗脫峰面積A1與不經(jīng)過(guò)層析柱空載峰面積A0. 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值. 計(jì)算回收率R的公式如下：

式中：A0（mAU·min）為空載峰面積；A1（mAU·min）為洗脫峰面積.

1.2.7 純化雞卵清中的溶菌酶 取新鮮雞蛋內(nèi)膜置于PB 緩沖溶液（pH=8.0）中浸泡24 h，取濾液備用［23］. 用緩沖溶液平衡層析柱（5.0 mm×30.0 mm）至基線平穩(wěn)，設(shè)定流速為150 cm/h. 用A 泵進(jìn)樣20 mL雞蛋清溶液，收集流穿液. 切換至B泵（緩沖溶液）待基線平穩(wěn)后換為0.5 mol/L NaCl 的PB 溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液.

2 結(jié)果與討論

2.1 弱陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)制備條件的優(yōu)化

接枝聚合物的密度及鏈長(zhǎng)是影響層析介質(zhì)載量的重要因素，通常通過(guò)控制單體（MAA）的濃度、 引發(fā)劑（KPS）的濃度和反應(yīng)溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)該參數(shù)的調(diào)控［24，14］. 本研究以QSBC為衡量參數(shù)，采用單一變量法對(duì)影響QSBC的各因素進(jìn)行了系統(tǒng)考察.

2.1.1 單體濃度對(duì)QSBC的影響QSBC隨單體濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，其具體變化規(guī)律如圖2所示. 當(dāng)單體濃度為 0.5 mol/L時(shí)，QSBC達(dá)到最大值（174.77 mg/mL）. 這是因?yàn)殡S單體濃度增加，其反應(yīng)速率加快，接枝量增加，所以QSBC值增加； 隨著單體濃度繼續(xù)增加，其單體自身均聚反應(yīng)速率增加，嚴(yán)重阻礙了接枝反應(yīng)的進(jìn)行［25］，致使介質(zhì)表面接枝量減小. 類似規(guī)律在巰基-過(guò)硫酸鉀氧化還原引發(fā)體系中也被觀察到，Liu等［26］將甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）接枝到羽毛表面，其接枝量隨單體濃度呈先上升后下降趨勢(shì). 為獲得較高的蛋白結(jié)合容量，選擇單體濃度為0.5 mol/L.

Fig.2 Effect of monomer concentration on QSBC(cKPS=36.8 mmol/L , T=35 ℃)

2.1.2 KPS 濃度對(duì)QSBC的影響 引發(fā)劑濃度影響自由基聚合反應(yīng)速率［27］，實(shí)驗(yàn)中考察了氧化劑KPS濃度對(duì)介質(zhì)QSBC的影響. 如圖3 所示，QSBC隨KPS 濃度的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，KPS 濃度為18.5 mmol/L時(shí)介質(zhì)的QSBC最高為252.21 mg/mL. 究其原因是隨著KPS的濃度升高，溶液中的自由基濃度也增加，反應(yīng)速率加快，導(dǎo)致接枝量升高，QSBC值增加； 繼續(xù)升高KPS濃度，反應(yīng)體系中自由基濃度繼續(xù)增加，會(huì)使單體本身均聚反應(yīng)比例增加，導(dǎo)致其接枝效率下降，因而介質(zhì)的QSBC值下降，這一現(xiàn)象符合普通自由基接枝聚合的一般規(guī)律［28，29］.

Fig.3 Effect of KPS concentration on QSBC(cMAA=0.5 mol/L, T=35 ℃)

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)QSBC的影響 圖4為QSBC隨反應(yīng)溫度增加的變化趨勢(shì)圖，可見(jiàn)QSBC隨溫度增加出現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì). Mondal等［30］在研究棉纖維接枝聚合甲基丙烯酸（MAA）時(shí)也報(bào)道了這種趨勢(shì). 在較低溫度（T＜35 ℃）時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，其自由基濃度增加導(dǎo)致其接枝量增加，所以QSBC升高［31］；而當(dāng)溫度繼續(xù)升高到一定程度（＞35 ℃）時(shí)，單體自身均聚的速率則會(huì)高于接枝聚合速率，導(dǎo)致接枝到基質(zhì)上的聚合物數(shù)量減少，配基密度下降，進(jìn)而致使SBC下降. 為獲得較高的蛋白吸附容量，選擇反應(yīng)溫度為35 ℃.

Fig.4 Effect of reaction temperature on QSBCcMAA=0.5 mol/L, cKPS=18.5 mmol/L.

2.2 接枝前后微球的紅外光譜

通過(guò)紅外光譜表征了FastSep-epoxy 微球接枝前后的化學(xué)組成，結(jié)果如圖5 所示. FastSep-epoxy 微球在2966.3 cm-1處的吸收峰為C—H伸縮振動(dòng)峰，1733.3和1201.7 cm-1處的吸收峰分別為C=O以及C—O特征吸收峰； FastSep-epoxy的環(huán)氧基經(jīng)過(guò)水解后生成鄰羥基，從而制得FastSep-OH. 紅外譜圖中FastSep-OH 與FastSep-epoxy 相比，除了繼續(xù)保留FastSep-epoxy 的1733.3 cm-1（C=O）和1201.7 cm-1（C—O）特征吸收峰外，在3544.5 cm-1處出現(xiàn)新的羥基特征峰，證明已發(fā)生了開(kāi)環(huán)反應(yīng)； FastSep-PMAA與FastSep-OH 比較發(fā)現(xiàn)，在3544.5，1733.3 和1201.7 cm-1處的特征吸收峰均有所增強(qiáng)，主要來(lái)源于FastSep-PMAA 微球接枝PMAA 的大量—COOH，證明接枝聚合反應(yīng)發(fā)生. 另外，由于羧基基團(tuán)的締合作用［32］，使得羥基峰向低波數(shù)方向位移，導(dǎo)致3544.5～3200 cm-1處出現(xiàn)寬而散的特征峰，均為—COOH的典型特征吸收峰.

Fig.5 FTIR spectra of microspheres before and after methacrylic acid grafting

2.3 接枝前后介質(zhì)的表面形貌及孔徑表征

通過(guò)SEM 觀察了大孔聚合物微球接枝前后表面形貌的變化，結(jié)果如圖6 所示. 圖6（A）～（C）為FastSep-OH微球的表面形貌照片，可見(jiàn)微球表面孔間連通性較好，孔徑尺寸為700～1000 nm. 圖6（D）～（F）示出了接枝后FastSep-PMAA微球的表面形貌，接枝后微球中的聚合物骨架尺寸增加，骨架間空隙增大，一方面表明已接枝聚甲基丙烯酸（PMAA），另一方面顯示出接枝的PMAA 對(duì)原微球的骨架有融合或增強(qiáng)作用. 接枝后的介質(zhì)仍具有大孔結(jié)構(gòu)，采用壓汞法對(duì)其平均孔徑尺寸變化情況進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖7 所示. 接枝后的FastSep-PMAA 與接枝前FastSep-OH 相比，其＜700 nm 的孔容部分明顯下降，孔隙率由88.5%下降至83.0%，同時(shí)其平均孔徑尺寸從（731.2±10） nm 增加到（978.14±10） nm，表明接枝PMAA 對(duì)孔徑尺寸較小的部分孔道影響較明顯，而對(duì)于＞700 nm 的孔道影響較小，該數(shù)據(jù)與SEM 表征結(jié)果一致. 介質(zhì)中保留的大孔有利于大分子快速傳質(zhì)，進(jìn)而提高純化效率［33］.

Fig.6 Microsphere morphologies before(A—C) and after(D—F) grafting methacrylic acid

Fig.7 Distribution of pore size of medium before(a)and after(b) grafting

2.4 弱陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)的色譜性能評(píng)價(jià)

離子交換容量（QIC）、 蛋白結(jié)合容量及分離效能等均為離子交換層析介質(zhì)的重要表征參數(shù)，實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)價(jià)，考察了不同QIC的層析介質(zhì)的色譜行為. 為便于分析，統(tǒng)一將評(píng)價(jià)介質(zhì)命名為Fast-Sep-PMAA-n，其中n代表QIC.

2.4.1QIC對(duì)QSBC的影響QIC是離子交換層析介質(zhì)的重要參數(shù)，其取決于介質(zhì)表面的離子交換基團(tuán)數(shù)量，本文中即介質(zhì)上的羧基數(shù)量，通常該類介質(zhì)的蛋白結(jié)合容量與其數(shù)量有直接關(guān)系. 對(duì)具有不同QIC的介質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖8所示. 在0.429～0.461 mmol/mL的QIC范圍內(nèi)，介質(zhì)QSBC隨著QIC的增加而升高，主要原因是介質(zhì)表面與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)隨著羧基的數(shù)量增加而增多，從而可以結(jié)合更多的蛋白. Sun 等［34］在瓊脂糖基質(zhì)的微球上接枝PMAA 時(shí)，在QIC為0.130～0.680 mmol/mL 范圍內(nèi)，蛋白吸附能力同樣隨QIC值增加而增大. FastSep-PMAA-0.461 的平均孔徑為（978.14±10） nm，QSBC為252.21 mg/mL，而聚合物基質(zhì)的商品Fractogel?EMD COO-（M）［35］的平均孔徑為（80±10） nm，QSBC為100 mg/mL，自制介質(zhì)平均孔徑遠(yuǎn)大于Fractogel?EMD COO-（M），但其QSBC仍大于同類商品介質(zhì)2.5 倍之多.

Fig.8 Effects of QIC on QSBC

2.4.2QIC對(duì)QDBC的影響QDBC是衡量離子交換層析介質(zhì)蛋白吸附能力的重要參數(shù)［4，9］，該參數(shù)與QIC之間的關(guān)系如圖9 所示. 在0.429～0.461 mmol/mL 的IC 范圍內(nèi)，QDBC隨著QIC的增加而增大. 通常QIC越高，介質(zhì)上可供結(jié)合的吸附位點(diǎn)越多，則DBC 也隨之增加［20］. 這一規(guī)律與Zhao 等［36］制備的弱陽(yáng)層析介質(zhì)表現(xiàn)相似（相同IC 范圍），且在QIC近似的條件下，F(xiàn)astSep-PMAA-0.461 對(duì)溶菌酶的QDBC（157.25 mg/mL）略高于該文獻(xiàn)報(bào)道值（140 mg/mL）. 還發(fā)現(xiàn)存在臨界離子交換容量（cIC）現(xiàn)象（當(dāng)QIC超過(guò)0.443 mmol/mL，其QDBC有很大程度的提升），其原因是當(dāng)QIC值小于QcIC時(shí)，聚合物長(zhǎng)鏈之間的距離較遠(yuǎn)“鏈傳遞”現(xiàn)象難以發(fā)生，鏈的靈活性受到限制，所以QDBC較低； 當(dāng)QIC超過(guò)QcIC值時(shí)，鏈間的距離縮短，有效促進(jìn)“鏈傳遞”行為的發(fā)生，使得溶菌酶在層析介質(zhì)的傳質(zhì)速率極大提升，所以QDBC高［37，38］.

Fig.9 Effects of QIC on QDBC

另外，在相同流速下（150 cm/h）測(cè)試了FastSep-PMAA-0.461和商品 CM Sepharose FF［39］（該介質(zhì)在交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)上偶聯(lián)羧酸基團(tuán)制備獲得）的QDBC，結(jié)果如圖10 所示，F(xiàn)astSep-PMAA-0.461 的QDBC值為157.25 mg/mL，與商品CM Sepharose FF（94.74 mg/mL）相比，QDBC高出65.9%.

Fig.10 Comparison of QDBC between CM Sepharose FF and FastSep-PMAA-0.461

2.4.3 鹽濃度對(duì)QSBC的影響 耐鹽型離子交換層析在高鹽濃度下保持較高的蛋白結(jié)合容量，可以免去對(duì)蛋白原料液稀釋的操作，不僅可以節(jié)約蛋白純化成本，還可最大化地保持蛋白的活性［40］.

改變平衡液的鹽濃度，測(cè)定了具有不同QIC的介質(zhì)的QSBC，結(jié)果如圖11所示. 隨著鹽濃度的增加，介質(zhì)FastSep-PMAA-0.429和FastSep-PMAA-0.443的QSBC呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在PMAA接枝型介質(zhì)對(duì)Lys的吸附中也有類似的現(xiàn)象［34］. 其增加的可能原因是隨著離子強(qiáng)度的增加，Lys進(jìn)入層析介質(zhì)的可利用孔體積也增加，蛋白質(zhì)的空間位阻隨之明顯減弱［4］，所以在中低離子強(qiáng)度下SBC 有所提升； 在高鹽濃度下，其QSBC下降，可歸因于高離子強(qiáng)度的電荷屏蔽作用，從而降低了蛋白質(zhì)與固定相上反應(yīng)位點(diǎn)的靜電相互作用［41］，導(dǎo)致靜態(tài)結(jié)合量降低. 介質(zhì)FastSep-PMAA-0.436，F(xiàn)astSep-PMAA-0.451 和FastSep-PMAA-0.461的QSBC隨著鹽濃度的升高而下降，其原因是離子強(qiáng)度增加其電荷屏蔽作用為主要影響因素，故未顯示出先增加后降低的規(guī)律. 總體來(lái)說(shuō)，在QIC為0.429～0.461 mmol/mL 時(shí)，介質(zhì)在0.2 mol/L的NaCl緩沖溶液中能保持100 mg/mL的蛋白結(jié)合容量，具有一定的耐鹽性能.

Fig.11 Effects of salt concentrations on QSBC

2.4.4 蛋白回收率的測(cè)定 回收率是評(píng)價(jià)層析介質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù)，尤其對(duì)于聚合物基質(zhì)的層析介質(zhì)而言，其骨架本身有一定的疏水性，如聚苯乙烯微球通常需要親水修飾后才可用于層析介質(zhì)［42］. 而本文以聚丙烯酸酯類微球?yàn)榛|(zhì)，其基質(zhì)本身具有較好的親水性，經(jīng)過(guò)表面接枝水溶性的PMAA后，其對(duì)蛋白的非特異性吸附量達(dá)到了多糖基質(zhì)水平. 不同QIC介質(zhì)對(duì)蛋白回收率的測(cè)定結(jié)果如表1所示. 該類介質(zhì)對(duì)Lys 回收率均在96%以上，稍高于商品瓊脂糖基質(zhì)層析介質(zhì)（CM Sepharose FF）的回收率（95.1±3.2）%［43］.

Table 1 Recoveries of Lys by different media

2.4.5 緩沖溶液pH值對(duì)QSBC的影響 pH值的變化不僅影響蛋白分子表面電荷數(shù)量，而且影響弱陽(yáng)層析介質(zhì)中功能基團(tuán)（—COOH）的解離程度. 以FastSep-PMAA-0.436介質(zhì)為研究對(duì)象，測(cè)定了其在不同pH緩沖溶液中的QSBC. 結(jié)果表明，QSBC隨pH升高先增加后保持不變（圖12）. 究其原因是： 在水溶液中，隨pH值增加—COOH的解離程度提高［21］，當(dāng)pH值=8時(shí)，—COOH的解離程度達(dá)到99%，解離程度越高則蛋白吸附能力增加，所以其QSBC隨pH值升高而增加，隨著pH值繼續(xù)升高，此時(shí)羧酸分子全部解離，蛋白吸附位點(diǎn)數(shù)量并未繼續(xù)增加，同時(shí)緩沖溶液pH值越接近溶菌酶的等電點(diǎn)（pI=10.7），其表面凈電荷量相應(yīng)減少，二者均影響SBC，故QSBC隨pH增加不再繼續(xù)增加.

Fig.12 Effect of pH on QSBC

2.4.6 分離性能評(píng)價(jià) 溶菌酶作為一種抗菌蛋白在食品貯藏等方面發(fā)揮著重要作用，它在雞卵清中含量豐富（占蛋清總量的3.5%）［44］. 在雞卵清中除溶菌酶（pI=10.7）為堿性蛋白外，其它蛋白多為酸性蛋白，如卵蛋白（pI=4.0）、 雞蛋白蛋白（pI=4.6）和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（pI=6.6），可通過(guò)陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)容易將其與溶菌酶分離［45］.實(shí)驗(yàn)中以FastSep-PMAA-0.461 作為研究對(duì)象，分離純化了雞蛋清溶液中的溶菌酶，其分離譜圖如圖13 所示. 對(duì)圖13 中的流穿峰和洗脫峰分別進(jìn)行收集，采用12%的SDSPAGE 凝膠電泳［46］對(duì)其成分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖14所示，可見(jiàn)流穿峰中不含有溶菌酶，洗脫峰中除溶菌酶外不含有其它雜蛋白，表明利用制備的弱陽(yáng)離子層析介質(zhì)完成了對(duì)雞蛋清溶液中溶菌酶的分離，具有較好的分離純化能力.

Fig.13 Chromatographic diagram of egg white by FastSep-PMAA-0.461

Fig.14 SDS-PAGE analysis of lysozyme isolated from egg white using FastSep-PMAA-0.461Lane 1. molecular weight marker； lane 2. bovine serum albumin（BSA）；lane 3. lysozyme（Lys）； lane 4. egg white solution； lane 5. flow- through；lane 6. elution； lane 7. molecular weight marker.

3 結(jié) 論

以大孔聚丙烯酸酯類微球?yàn)榛|(zhì)，通過(guò)氧化還原引發(fā)表面接枝聚合，制備了大孔弱陽(yáng)離子交換層析介質(zhì). 系統(tǒng)研究了接枝聚合的各影響因素，包括單體濃度、 引發(fā)劑濃度及反應(yīng)溫度等因素，發(fā)現(xiàn)該類介質(zhì)的蛋白結(jié)合容量與IC密切相關(guān).QSBC和QDBC均隨QIC的增加而增加.QIC達(dá)到0.461 mmol/mL 時(shí)，QSBC為252.21 mg/mL，QDBC為157.25 mg/mL.QIC對(duì)介質(zhì)的耐鹽性有一定影響，在QIC為0.429～0.461 mmol/mL 時(shí)，介質(zhì)在0.2 mol/L 的NaCl 緩沖溶液中能保持100 mg/mL 的蛋白結(jié)合容量. 另外，QSBC值隨蛋白緩沖液的pH值增加先增加后保持不變以及不同QIC的弱陽(yáng)層析介質(zhì)蛋白回收率均大于96%. 將制備的介質(zhì)用于雞蛋清中溶菌酶的分離純化，一步純化即可獲得較高純度，該類介質(zhì)在蛋白等生物大分子分離純化領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景.