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日本沼蝦StAR 基因克隆及其低氧脅迫下表達(dá)分析

2024-03-25 07:43:16趙倩倩孫盛明
水產(chǎn)學(xué)報 2024年3期
關(guān)鍵詞:精巢沼蝦類固醇

鄭 誠,薛 程,趙倩倩,孫盛明,2*

(1.上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室,上海 201306;2.上海海洋大學(xué),水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室,上海 201306)

類固醇激素能夠在動物的性別分化發(fā)育中起到關(guān)鍵作用,其合成以膽固醇為前體,通過一系列類固醇合成酶進(jìn)行催化,最后形成性類固醇激素和皮質(zhì)醇素[1]。StAR編碼的類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白是一種在線粒體膜上的轉(zhuǎn)運蛋白,首次由 Clark等[2]從小鼠(Mus musculus)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中純化分離得到,其主要功能是完成膽固醇從線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運過程,這不僅是類固醇激素合成的起始階段,也是類固醇激素合成過程中關(guān)鍵的調(diào)控步驟[3]。迄今為止,StAR已經(jīng)在多種魚類研究中相繼報道,如虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[4]、波紋絨須石首魚(Micropogonias undulatus)[5]和塞內(nèi)加爾鰨(Solea senegalensis)[6]。已有研究表明,StAR在青鳉(Oryzias latipes)幼魚孵化后才有表達(dá),要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他類固醇合成酶基因的表達(dá)[7],而尖齒胡鲇(Clarias gariepinus)StAR在性別分化時期中也極其微量的表達(dá)[8]。針對上述問題有學(xué)者發(fā)現(xiàn),尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)StAR具有2 種亞型StAR1 和StAR2,并觀察到StAR2 可能是由StAR1 重復(fù)產(chǎn)生的旁系同源基因,StAR2 負(fù)責(zé)在雌性決定/分化早期尼羅羅非魚的性腺中產(chǎn)生雌激素(即雌二醇),并在性腺組織轉(zhuǎn)錄組分析中表明StAR2 可能是雌二醇(estradiol,E2)產(chǎn)生以誘導(dǎo)卵巢分化的必要因素,而兩者都參與了雄激素11-酮基睪酮(11-keto testosterone,11-KT)的產(chǎn)生以促進(jìn)睪丸分化和維持[9]。

目前在水生動物類固醇激素研究中主要聚焦在魚類,而經(jīng)濟(jì)甲殼動物的類固醇激素合成路徑及其機(jī)制研究卻鮮有問津,甲殼動物是否與魚類存在相似的類固醇合成途徑及其關(guān)鍵節(jié)點蛋白,這是值得深入探討的問題,為此本實驗以日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)為研究對象,探討日本沼蝦StAR在類固醇激素合成中的具體功能。日本沼蝦俗稱青蝦、河蝦,隸屬于十足目(Decapoda)長臂蝦科(Palaemonidae)沼蝦屬(Macrobrachium),是我國重要淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類之一。近年來,相關(guān)課題組在日本沼蝦人工養(yǎng)殖技術(shù)和群體遺傳多樣性方面的研究均取得了一定進(jìn)展[10-13],然而日本沼蝦對養(yǎng)殖水體溶解氧含量要求較高,日本沼蝦不耐低氧的生物學(xué)特性已經(jīng)成為高密度集約化養(yǎng)殖的限制因素[14-15]。低氧(hypoxia)是指水環(huán)境中溶解氧(DO)濃度低于2.8 mg/L 的現(xiàn)象[16],其對水生動物生長、存活和繁殖的影響已有大量報道[17-19]。已有研究表明,低氧也會干擾魚類內(nèi)分泌系統(tǒng),會通過減少類固醇生成相關(guān)基因表達(dá)量,從而抑制類固醇激素合成和性腺發(fā)育[20-21],那么低氧是否針對甲殼動物也發(fā)揮內(nèi)分泌干擾物的作用,從而影響日本沼蝦StAR基因表達(dá)與定位,這值得我們深入研究。

本實驗通過對日本沼蝦StAR基因的克隆、序列特征與原核表達(dá)分析,探討低氧下日本沼蝦StAR基因表達(dá)模式,并采用Western blot 與免疫組化技術(shù)驗證了低氧脅迫下日本沼蝦StAR 蛋白在精巢組織中的表達(dá)與定位,研究結(jié)果為探究低氧下日本沼蝦類固醇激素合成途徑及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗方法及樣品采集

性腺成熟的日本沼蝦購于上海海洋大學(xué)附近的東海農(nóng)場,暫養(yǎng)于上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院E 樓循環(huán)水養(yǎng)殖玻璃缸(100 cm×50 cm×60 cm)中,實驗室暫養(yǎng)7 d [水溫(25±2) °C,pH (7.72±0.20),溶解氧充足,每天早晚定時喂食商品飼料]后,用于急性低氧脅迫實驗。對照組和實驗組 [對照組溶解氧,(6.6±0.2) mg/L;實驗組溶解氧設(shè)置濃度參照已有文獻(xiàn)報道[17,22],(2.0±0.2) mg/L]分別設(shè)置3 個玻璃缸,每個玻璃鋼放20 尾健康活潑的雄性日本沼蝦[(3.5±0.4) g]。對實驗組養(yǎng)殖缸充氮氣使得水體溶解氧濃度調(diào)節(jié)至2.0 mg/L,后續(xù)每隔2~3 h 采用便攜式溶氧儀(YSI 公司ProODO/T Cable Assy,美國)定期監(jiān)測溶解氧含量,具體方法參照Sun 等[23]。低氧脅迫實驗均在脅迫階段1、3、6、12、24、48、96 h 分別采集精巢組織,每個時間點在對照組和低氧處理組分別取6 尾蝦的精巢組織,同時解剖健康日本沼蝦獲取腦、鰓、肝胰、心臟、肌肉、腸道及精巢等組織,立刻放入液氮中,轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。

1.2 RNA 提取與cDNA 合成

使用TRIzol 法提取RNA,使用NanoDrop 2000C (Thermo Scientific,美國)測定OD260/OD280的值,比值控制在1.8~2.0,之后通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織總 RNA 的完整性。后續(xù)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)將所提RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,保存于-40 °C 冰柜中備用,用于隨后StAR不同組織和不同低氧階段的表達(dá)分析。

1.3 日本沼蝦StAR 基因 cDNA 全長克隆

根據(jù)本實驗室已構(gòu)建的日本沼蝦精巢cDNA文庫,通過組裝拼接和比對分析,獲得一個類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白StAR序列片段。以性腺 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,獲得cDNA 序列片段后,應(yīng)用Primer premier 5.0 軟件分別設(shè)計5′ RACE 和3′RACE 的特異性擴(kuò)增引物(表1),以日本沼蝦精巢cDNA 為模板,結(jié)合套式聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出StAR基因的5'端和3'端。聚合酶鏈反應(yīng)體系為50 μL,反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,56 ℃30 s,72 ℃ 30 s,35 次循環(huán);72 ℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 產(chǎn)物,經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后,將陽性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 實驗所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.4 日本沼蝦StAR 基因序列與進(jìn)化分析

利用cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆獲得StAR基因cDNA 全序列,運用生物信息學(xué)手段通過NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行序列開放閱讀框(ORF)分析、使用 DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸同源序列比對,通過MEGA5.0 軟件采用鄰近法 (Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)法構(gòu)建進(jìn)化樹、通過SMART(https://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析,利用EXPASY Proteomics Server(https://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸序列參數(shù),分別通過TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和NovoPro(https://novopro.cn/tools/signal)進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測等分析。

1.5 日本沼蝦StAR 基因的組織表達(dá)分析

本研究采用了半定量RT-PCR 方法檢測了StAR在腦(BR)、鰓(GI)、肝胰腺(HP)、心臟(HE)、肌肉(MU)、腸道(IE)及精巢(TE)中的表達(dá)分布。設(shè)計StAR的特異性引物StAR-RT-F 和StAR-RT-R,以β-actin為內(nèi)參,進(jìn)行PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系20 μL,包 含TaKaRa 的Premix EXTaq(ExTaqTM version 2.0 plus dye)10 μL,各組織cDNA 模板(0.1~1.0 μg/μL)1 μL,上下游引物各0.4 μL,RNase free H2O 9.2 μL。反應(yīng)程序為98 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35 個循環(huán),將所擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%核酸凝膠電泳得出結(jié)果。

1.6 qRT-PCR

qRT-PCR 使用YEASEN 的染料法熒光定量試劑盒,設(shè)計StAR的特異性引物StAR-RT-F 和StAR-RT-R,內(nèi)參為β-actin,反應(yīng)體系20 μL,包含Hieff UNICON?Power qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA 9.2 μL(RNase free H2O 稀釋),反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃10 s,60 ℃ 30 s,共40 個循環(huán)。每個處理設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)平行樣,并且進(jìn)行3 次生物重復(fù)。熔解曲線由 BIO-RAD iQ5 的實時分析軟件分析,熒光定量實驗數(shù)據(jù)用2-△△CT法分析并計算相對表達(dá)水平,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(mean ± SE,n=3)。作圖采用Graphpad prism 軟件,方差分析和多重比較采用SPSS 19.0 軟件和t檢驗法,顯著性差異水平設(shè)為P<0.05。

1.7 多克隆抗體制備

質(zhì)粒構(gòu)建及StAR 蛋白純化 選擇日本沼蝦StAR序列合適區(qū)域設(shè)計特異性引物并通過 PCR擴(kuò)增出足夠量的 PCR 產(chǎn)物,目的片段 PCR 擴(kuò)增后回收凝膠電泳產(chǎn)物,并與表達(dá)載體 pET-28a 同時用NdeI、XhoI 進(jìn)行雙酶切,構(gòu)建重組質(zhì)粒連接液轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)中,檢測篩選出陽性克隆進(jìn)行測序驗證,獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)細(xì)胞,熱激后涂布在含有對應(yīng)抗生素的平板上進(jìn)行培養(yǎng),挑取單克隆到含有抗生素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),并當(dāng)OD 值達(dá)到 0.6 時,加入IPTG 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4 h 后取出菌液,超聲波破碎,4 ℃、10 000 r/min 離心10 min,分離上清液和沉淀,進(jìn)行后續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 驗證及蛋白純化。

多克隆抗體制備及抗體效價檢測 初免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏完全佐劑混勻乳化,二免、三免、四免抗原為蛋白抗原與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化。一免二免間隔20 d,之后都間隔14 d,總共4 次,免疫結(jié)束后進(jìn)行采血離心獲得抗體血清,使用ELISA 法檢測抗血清效價,以免疫前的兔血清作為陰性對照,梯度稀釋含有抗體的血清,利用酶標(biāo)儀(Multiskan FC,Thermo Scientific,美國)檢測 450 nm 條件下各樣品的OD 值。當(dāng)處理組/陰性對照組的光吸收值比值≥2時判定為陽性,抗體效價即為 ELISA 反應(yīng)陽性血清最大稀釋度。

1.8 Western blot 分析

采用Western blot 方法分析低氧下日本沼蝦精巢中StAR 表達(dá)模式[9],根據(jù)本實驗StAR 蛋白分子量配置10%的分離膠及5%的濃縮膠,將已定量蛋白上樣(20 μg/孔)并進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜采用NC 膜濕轉(zhuǎn)法。使用3% BSATBST 稀釋一抗[實驗組為本實驗室制備的StAR抗體;對照組是β-Actin 抗體[β-Actin (13E5) Rabbit mAb (Cell Signaling Technology,美國)],使用5%脫脂奶粉-TBST 稀釋HRP 山羊抗兔IgG (武漢博士德生物工程有限公司),利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(Tanon 5 200 Multi,中國)進(jìn)行拍照觀察。

1.9 免疫組織化學(xué)

在低氧脅迫實驗中1、3、6、12、24、48 h分別選取2 尾雄性日本沼蝦,解剖取出精巢組織,4%多聚甲醛固定組織后用無水乙醇脫水,石蠟包埋后切片,對切片做免疫組化實驗。首先對切片進(jìn)行脫蠟復(fù)水操作,然后放到EDTA 抗原修復(fù)液中100 ℃ 20 min,并自然冷卻至室溫,用PBST洗去修復(fù)液。之后加3%的 H2O2-甲醇溶液室溫下孵育10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性;用3%~5%的BSA 溶液封閉30 min,去除封閉液后便用自制StAR 抗體[1∶100 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋]進(jìn)行孵育,4 ℃過夜;用PBS 漂洗3 遍,每次5 min;加反應(yīng)增強(qiáng)液PV-9 000(ZSGBBIO,中國),37 ℃孵育20 min;洗去并滴加HRP 山羊抗兔IgG(1∶1 000 PBS 溶液稀釋,體積比),室溫孵育2 h;洗二抗用PBS 漂洗3 遍,每次5 min;加顯色劑DAB 10~30 s;之后充分水洗,染蘇木素、水洗、乙醇分化、脫水透明并封片,靜置后熒光顯微鏡(ECLIOSE Ci-L,Nikon)下拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1 日本沼蝦 StAR 基因cDNA 序列特征

通過RACE-PCR 技術(shù)對日本沼蝦StAR基因cDNA 序列進(jìn)行拼接后,獲得全長為3 361 bp 的序列(圖1),其中 5′-UTR 323 bp,3′-UTR 2 129 bp,開放閱讀框909 bp,編碼302 個氨基酸,編碼蛋白質(zhì)分子量為35.29 ku,理論等電點為6.03,通過NovoPro 網(wǎng)站對日本沼蝦的StAR 氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其信號肽不存在。日本沼蝦StAR基因cDNA 序列已經(jīng)提交到GenBank,登錄號為MW263908。

圖1 日本沼蝦StAR 基因cDNA 序列及其編碼的氨基酸序列紅色堿基代表該序列的起始密碼子和終止密碼子,黑框的為加尾信號,polyA 尾用下劃線標(biāo)出。Fig.1 Nucleotides and deduced amino acid sequences of StAR gene cDNA of M.nipponenseThe red bases represent the start and stop codons of the sequence,the black box is the tailing signal,the polyA tail is underlined.

2.2 StAR 氨基酸序列比對及進(jìn)化分析

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找并下載不同物種StAR 氨基酸序列,與克隆得到的日本沼蝦StAR序列使用 DNAMAN 軟件進(jìn)行氨基酸同源序列比對(圖2),通過MEGA5.0 軟件采用鄰近法 (Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,日本沼蝦 StAR 與三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)相似性最高,并與魚類、兩棲類、哺乳類形成了不同分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3),這與日本沼蝦的分類地位相一致。

圖2 日本沼蝦StAR 和其他物種StAR 氨基酸同源序列比對日本沼蝦(MW263908),三疣梭子蟹 (MPC99197.1),凡納濱對蝦 (XP_027230069.1),日本囊對蝦(XP_042893986.1);三角標(biāo)注的為保守的磷酸化位點。Fig.2 Alignment results of StAR amino acid sequences of M.nipponense and other seven speciesM.nipponense (MW263908),P.trituberculatus (MPC99197.1),L.vannamei (XP_027230069.1),M.japonicus (XP_042893986.1);conserved phosphorylation sites are marked with triangles.

圖3 日本沼蝦StAR 與其他物種StAR 的系統(tǒng)進(jìn)化樹所涉及物種及GenBank 登錄號:日本沼蝦 MW263908,虹鱒 NP001117674,斑馬魚 NP571738,大西洋鱈AAP44112,雞AAK50433.2,美洲牛蛙ACJ53927,砂質(zhì)犀角蟾AMD33476,人 NP000340,大型溞 XP_032788316.1,花鱸 AFN73130.1,三疣梭子蟹 MPC99197.1,尼羅羅非魚 StAR2 XP003445653,青鳉StAR2 ENSORLP00000011263,塞爾加爾鰨 StAR2 EU921450,凡納濱對蝦XP_027230069.1,日本囊對蝦XP_042893986.1,家蠶 AAL51081.1,蜣螂 XP_022906085.1。Fig.3 Phylogenetic tree based on the sequence of M.nipponense StAR and StAR from other speciesthe species involved and the GenBank accession number: M.nipponense MW263908,O.mykiss NP001117674,Danio rerio NP571738,Gadus morhua AAP44112,Mus musculus AAK50433.2,Lithobates catesbeianus ACJ53927,Rhinella arenarum AMD33476,Homo sapiens NP000340,Daphnia magna XP_032788316.1,Lateolabrax japonicus AFN73130.1,P.trituberculatus MPC99197.1,Oreochromis niloticus StAR2 XP003445653,Oryzias latipes StAR2 ENSORLP00000011263,Solea senegalensis StAR2 EU921450,L.vannamei XP_027230069.1,M.japonicus XP_042893986.1,Bombyx mori AAL51081.1,Onthophagus taurus XP_022906085.1.

2.3 重組質(zhì)粒酶切驗證及融合蛋白表達(dá)檢測

根據(jù)引物設(shè)計的酶切位點對篩選得到的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切處理,并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果與預(yù)期條帶符合(圖4-a),驗證后命名為 pET28a-StAR。將重組質(zhì)粒培養(yǎng)誘導(dǎo),收集菌體制樣準(zhǔn)備SDS-PAGE 檢測,結(jié)果顯示,出現(xiàn)分子量約34 ku 的目的條帶,且與預(yù)期分子量大小一致(圖4-b)。融合蛋白經(jīng)過純化,SDSPAGE 電泳檢測理論分子量相接近位置出現(xiàn)明顯條帶,可初步確定融合蛋白成功得到了純化(圖4-c)。

圖4 重組質(zhì)粒酶切驗證及融合蛋白表達(dá)(a) M.marker,1.雙酶切后的目的基因,2.構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒;(b) M.protein marker,1.誘導(dǎo)前總蛋白,2.20°C 上清液,3.20°C 沉淀,4.37°C 上清液,5.37°C 沉淀;(c) M.protein marker,1.純化后蛋白。Fig.4 Recombinant plasmid digestion verification and fusion protein expression detection(a) M.marker,1.target gene after double digestion,2.constructed expression plasmid;(b) M.protein marker,1.total protein before induction,2.supernatant at 20 °C,3.20 °C pellet,4.37 °C supernatant,5.37°C pellet;(c) M.protein marker,1.purified protein.

2.4 抗體血清效價檢測

通過ELISA 法檢測,抗體效價值≥2.5×陰性值,制備的日本沼蝦StAR 多克隆抗體的效價為 ≥5.12×105(表2),可以進(jìn)行后續(xù)的Western blot 和免疫組化實驗。

表2 ELISA 法檢測StAR 抗體血清效價Tab.2 Detection of StAR polyclonal anti-serum titer by ELISA method

2.5 日本沼蝦StAR 基因表達(dá)分析

不同組織中表達(dá)分析 本研究采用了半定量RT-PCR 方法檢測在腦、鰓、肝胰腺、心臟、肌肉、腸道、精巢中的表達(dá)分布,結(jié)果顯示,日本沼蝦StAR在肝胰腺和心臟中表達(dá)較低外,其他組織表達(dá)均為較高水平,這表明StAR在日本沼蝦組織中分布廣泛(圖5)。

圖5 日本沼蝦StAR 基因組織分布1.腦,2.鰓,3.肝胰腺,4.心臟,5.肌肉,6.腸道,7.精巢。Fig.5 Distribution of StAR genes in M.nipponense1.brain,2.gill,3.hepatopancreas,4.heart,5.muscle,6.intestine,7.testis.

實時熒光定量PCR 與Western blot 分析

以小時為單位,通過 qRT-PCR 檢測日本沼蝦不同低氧階段的精巢 組織中StAR基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示,StAR表達(dá)量隨著低氧脅迫時間增加總體呈降低趨勢,與對照常氧組相比,低氧脅迫組日本沼蝦StAR表達(dá)量在48 h 之前仍保持顯著升高(P<0.05),而在低氧96 h 時StAR表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖6-a)。Western blot 結(jié)果證實StAR蛋白表達(dá)量在低氧96 h 也明顯降低,與PCR 結(jié)果所呈現(xiàn)的趨勢相似(圖6-b)。

圖6 低氧脅迫不同時間段精巢組織StAR 轉(zhuǎn)錄水平(a)和蛋白豐度(b)表達(dá)變化(b) 0.對照,1.低氧1 h,3.低氧3 h,6.低氧6 h,12.低氧12 h,24.低氧24 h,48.低氧48 h,96.低氧96 h。Fig.6 Temporal expression of StAR transcriptional levels (a) and protein abundance (b) in testis tissue under hypoxia stress at different time periods(b) 0.control,1.hypoxia 1 h,3.hypoxia 3 h,6.hypoxia 6 h,12.hypoxia 12 h,24.hypoxia 24 h,48.hypoxia 48 h,96.hypoxia 96 h.

免疫組化定位表達(dá)分析 利用制備的多克隆抗體為一抗,通過免疫組化實驗分析低氧下日本沼蝦精巢組織中 StAR 蛋白定位表達(dá)情況。結(jié)果顯示,StAR 蛋白在精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)(圖版),這與最早在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)相一致。

3 討論

綜合文獻(xiàn)報道,StAR 蛋白主要功能是完成膽固醇從線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運過程,這是類固醇激素合成過程中關(guān)鍵的調(diào)控步驟[24-26]。其中蛋白激酶A(PKA)介導(dǎo)的絲氨酸磷酸化的潛在位點,對于調(diào)節(jié)StAR 活性有重要意義[27],如人等哺乳動物中的StAR 蛋白Ser195和 Ser194的突變會降低類固醇生成的速率[28-29]。已有研究證實StAR基因在類固醇激素合成起始階段起關(guān)鍵性作用,而類固醇激素是性別分化與發(fā)育的關(guān)鍵[1-2],但迄今為止,StAR基因在甲殼動物中的相關(guān)研究鮮有報道,更少會在低氧脅迫條件下對該基因的表達(dá)進(jìn)行探討。本研究克隆得到日本沼蝦StAR基因 cDNA 全長序列,全長3 361 bp,其中開放閱讀框909 bp,編碼302 個氨基酸。其中Ser99、Ser135、Ser186和Ser200幾個磷酸化位點在甲殼類StAR 序列中相對保守,表明其可能參與調(diào)節(jié)StAR 活性。日本沼蝦StAR基因與甲殼類親緣關(guān)系最近,并與節(jié)肢動物門中昆蟲聚成一支,這基本上與傳統(tǒng)的動物系統(tǒng)發(fā)生和分類次序一致。從實驗結(jié)果中可以看出StAR基因在各組織都有表達(dá),但具有組織表達(dá)豐度差異性,其在精巢中表達(dá)較高,與硬骨魚類和哺乳類物種StAR基因組織表達(dá)模式相吻合[5,30-31]。

已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)低氧能夠抑制青鳉精巢發(fā)育和精子發(fā)生[32],并證實低氧作為一種特殊的應(yīng)激源發(fā)揮類似內(nèi)分泌干擾物的效應(yīng),會通過抑制斑馬魚StAR基因的表達(dá)從而抑制類固醇激素的生成[33-34]。研究表明,StAR基因在低等脊椎動物魚類雄性生殖中起到至關(guān)重要的作用[5,35],且在對尼羅羅非魚StAR基因研究中發(fā)現(xiàn),旁系同源基因StAR2 會影響卵巢發(fā)育分化,而StAR1 和StAR2都會參與11-酮基睪酮的合成從而在精巢發(fā)育分化中發(fā)揮重要作用[9,36]。本實驗qRT-PCR 結(jié)果顯示,低氧48 h 時日本沼蝦精巢組織中StAR基因表達(dá)量顯著高于對照,其原因可能是短期低氧脅迫下日本沼蝦能夠通過誘導(dǎo)StAR基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平上升,來抵消低氧應(yīng)激所帶來的負(fù)面效應(yīng)。然而,隨著低氧脅迫時間的增加,日本沼蝦精巢組織中StAR基因表達(dá)量總體呈現(xiàn)下降趨勢,表明長期低氧脅迫能夠顯著降低日本沼蝦的StAR基因的轉(zhuǎn)錄水平,可能會影響性激素分泌,這與模式動物小鼠與斑馬魚的研究結(jié)果相類似[21,34]。

本實驗還構(gòu)建了StAR 的原核表達(dá)系統(tǒng)以及抗體制備,選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成為表達(dá)StAR 蛋白的首選,其優(yōu)點在于操作簡單,為在蛋白水平驗證StAR 在低氧脅迫響應(yīng)的表達(dá)模式奠定了基礎(chǔ)。通過Western blot 實驗結(jié)果也證實,低氧脅迫48 h 前日本沼蝦StAR 蛋白表達(dá)量水平與對照組相比較高,但其表達(dá)量水平隨低氧脅迫時間增加呈現(xiàn)下降趨勢,這與低氧條件會抑制小鼠間質(zhì)細(xì)胞StAR 表達(dá)水平導(dǎo)致睪酮合成減少等研究結(jié)果相一致[37-38],可能是由于長期低氧脅迫會誘導(dǎo)精巢中生殖細(xì)胞凋亡,精巢中精母細(xì)胞及精子數(shù)量顯著降低[23],從而導(dǎo)致在精巢中StAR 表達(dá)量降低。此外,本研究通過免疫組化實驗,檢測到 StAR 蛋白在低氧下日本沼蝦精巢組織中的精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá),鑒于精巢間質(zhì)細(xì)胞與雄激素合成以及分泌調(diào)節(jié)密切相關(guān)[39-40],這表明日本沼蝦StAR基因可能在類固醇合成路徑及精子發(fā)生過程中均發(fā)揮重要作用,但具體作用途徑及其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究系統(tǒng)分析了StAR基因的序列結(jié)構(gòu)域、組織表達(dá)特征以及低氧脅迫后該基因的表達(dá)模式;并進(jìn)行StAR基因原核表達(dá)及其抗血清的制備,采用Western blot 與免疫組化在蛋白水平進(jìn)行表達(dá)與定位分析,為解析低氧下日本沼蝦類固醇激素合成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

(作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突)

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