卜明 ，王璐，羅然，徐天賜，林宇，葛鵬玲，劉吉成

1.齊齊哈爾醫(yī)藥科學(xué)研究所 博士后科研工作站，黑龍江 齊齊哈爾 161006

2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 博士后流動(dòng)站，黑龍江 哈爾濱 150040

3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006

肝癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重危害居民健康的重要疾病[1]。當(dāng)前研究表明，化學(xué)療法仍是癌癥治療的最有效方法之一，但不良反應(yīng)嚴(yán)重限制了很多藥物的臨床應(yīng)用[2-3]。因此，開(kāi)發(fā)高效低毒的抗肝癌藥物已成為藥物研發(fā)的重要方向之一。在新藥研發(fā)的過(guò)程中，從中藥資源中篩選具有抗肝癌作用的天然活性成分，對(duì)于肝癌藥物的研發(fā)具有重要意義[4-5]。

羽扇豆醇是課題組前期在毒性中藥材狼毒大戟EuphorbiafischerianaSteud.中提取得到的五環(huán)三萜類化合物，同時(shí)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇在水果、蔬菜、中草藥中均有廣泛的分布[6]。羽扇豆醇用于抗炎、抗菌、抗風(fēng)濕等的治療[7-10]。近年來(lái)，羽扇豆醇的抗腫瘤作用被廣泛關(guān)注，已有研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇可抑制頭頸部腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，對(duì)肝癌、膀胱癌和乳腺癌有治療作用[11-17]。在以往研究的基礎(chǔ)上，近年來(lái)關(guān)于羽扇豆醇的研究主要包括它的生物合成途徑、衍生物合成和活性機(jī)理的探索[18]。相關(guān)報(bào)道以羽扇豆醇作為先導(dǎo)化合物，合成出的某些衍生物也具有很好的抗腫瘤活性，如羽扇豆醇-3β-硫酸鹽可抑制前列腺腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力[19]；羽扇豆醇氯醋酸鹽抑制肺癌A549較羽扇豆醇能力強(qiáng)[20]；羽扇豆醇-3-吡啶季銨鹽衍生物能夠顯著抑制結(jié)直腸癌增殖[21]。琥珀酸可使藥物具有良好的溶解性和穿透性。課題組前期成功制備羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯，如圖1所示，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抗增殖活性（IC50＝8.60 μmol/L）較母體羽扇豆醇（IC50＝43.62 μmol/L）顯著提升，具有深入研究?jī)r(jià)值。線粒體信號(hào)通路是治療多種癌癥的重要靶點(diǎn)，本研究通過(guò)觀察羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)人肝癌細(xì)胞的抗增殖作用，并基于線粒體凋亡途徑對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，以期為羽扇豆醇類抗腫瘤藥物的研制提供參考。

圖1 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯結(jié)構(gòu)式Fig.1 Lupinol-3β-succinate structural formula

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株

HepG2細(xì)胞株購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。將HepG2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2條件在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 藥物及主要試劑

羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院合成（由羽扇豆醇與琥珀酸酐通過(guò)酯化反應(yīng)制備，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%；羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯溶于DMSO溶液中，加熱至50 ℃促溶，制成40 mmol/L儲(chǔ)備液）；DMEM培養(yǎng)液（批號(hào)CM15019）購(gòu)自北京中科邁晨科技有限公司；特級(jí)胎牛血清（批號(hào)086-150）購(gòu)自南京維森特生物技術(shù)有限公司；青霉素-鏈霉素溶液（批號(hào)C0222）、胰酶消化液（批號(hào)C0203）、CCK-8試劑盒（批號(hào)C0038）均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞色素C（Cyt-C）抗體（批號(hào)4280T）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（批號(hào)2772）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體（批號(hào)4223T）、cleaved-半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）（批號(hào)9664）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)KGA1102）、JC-1細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（批號(hào)KGA1904）、活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)KGT010-1）、BCA蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)KGPBCA）均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 主要儀器

EM208S型電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；Power/PAC3000型電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活率

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞用胰酶消化并重懸后稀釋為1.0×104個(gè)/mL，按每孔200 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用不同濃度羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯（0、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）處理細(xì)胞24、48、72 h后，加入CCK8工作液（每孔20 μL），在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，然后使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(A給藥－A空白)/（A對(duì)照－A空白）

2.2 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以5.0×105個(gè)/mL的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，使用不同濃度羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯（0、4、8、16 μmol/L）處理細(xì)胞48 h后，PBS洗滌，加入AO、EB染色液各5 μL，室溫避光孵育5 min，使用激光共聚焦顯微鏡觀察各組細(xì)胞的凋亡形態(tài)并拍照。收集、洗滌細(xì)胞，加入Annexin V-FITC、PI染液，于室溫下暗處孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.3 DCFH-DA法檢測(cè)ROS變化

細(xì)胞按照2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行分組給藥和培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞洗滌后，加入無(wú)血清稀釋的DCFH-DA探針，37 ℃孵育20 min后，使用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS含量，使用激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。

2.4 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位變化

細(xì)胞按照2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行分組給藥和培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞洗滌后，加入稀釋的JC-1染色液，37 ℃孵育30 min后，用1×Buffer洗去多余的染色液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化，使用激光共聚焦顯微鏡拍照觀察。

2.5 Western blotting法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

按照2.2項(xiàng)下的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組給藥和培養(yǎng)。收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后冰浴30 min，低溫高速離心20 min提取總蛋白。蛋白進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳分離，結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h后，使用TBST緩沖液洗PDVF膜3次；加入稀釋后的一抗4 ℃孵育過(guò)夜。使用TBST緩沖液洗膜后，加入二抗在常溫下孵育2 h，洗膜后ECL發(fā)光液顯色，利用BIO-RAD曝光；運(yùn)用Image J V1.8.0圖像分析軟件檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算蛋白條帶相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

3 結(jié)果

3.1 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照相比，給藥作用24、48、72 h后，HepG2細(xì)胞的存活率均顯著下降（P＜0.01），并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度相關(guān)性。羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯作用HepG2細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為（20.61±0.32）、（8.60±0.28）、（6.73±0.16）μmol/L，見(jiàn)圖2。通過(guò)比較，藥物作用48 h比作用24 h效果顯著提升，而藥物作用72 h較48 h只有略微提升，故后期實(shí)驗(yàn)選用羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯干預(yù)的梯度濃度及作用時(shí)間設(shè)置為4、8、16 μmol/L作用48 h。

圖2 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響（，n=3）Fig.2 Effect of lupinol-3β-succinate on HepG2 cell viability (,n=3)

3.2 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

AO/EB雙染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯處理后HepG2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈現(xiàn)出綠色熒光的非凋亡狀態(tài)細(xì)胞數(shù)量減少，呈現(xiàn)出紅色熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，并且具有濃度相關(guān)性，見(jiàn)圖3。采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，4、8、16 μmol/L的羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯作用HepG2細(xì)胞48 h后，進(jìn)入早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例顯著增加，并呈現(xiàn)出顯著的藥物濃度相關(guān)性（P＜0.01、0.001），見(jiàn)圖4。

3.3 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞ROS的影響

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，不同濃度的羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)，見(jiàn)圖5。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，4、8、16 μmol/L的羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯作用細(xì)胞48 h后，HepG2細(xì)胞的ROS熒光強(qiáng)度值顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞ROS的影響（，n=3）Fig.6 Effect of lupinol-3β-succinate on ROS in HepG2 cells (,n=3)

3.4 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位結(jié)果如圖7所示，對(duì)照組呈現(xiàn)紅色熒光，說(shuō)明此時(shí)線粒體膜電位處于正常狀態(tài)。與對(duì)照組比較，4、8、16 μmol/L的羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯作用HepG2細(xì)胞48 h后，紅色熒光逐漸變?nèi)踔料ВG色熒光逐漸加強(qiáng)，融合的Merge圖亦呈現(xiàn)變綠色的趨勢(shì)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)膜電位水平顯示，受藥物濃度影響HepG2細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位水平顯著下降（P＜0.01），見(jiàn)圖8。

圖7 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響（免疫熒光，×400）Fig.7 Effect of lupinol-3β-succinate on mitochondrial membrane potential of HepG2 cells (immunofluorescence,×400)

圖8 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位影響的流式細(xì)胞圖（，n=3）Fig.8 Flow cytometry of effects of lupinol-3β-succinate on mitochondrial membrane potential of HepG2 cells (,n=3)

3.5 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯組的凋亡抑制蛋白Bcl-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖9。

圖9 羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=3）Fig.9 Effect of lupinol-3β-succinate on apoptosis-related protein expression in HepG2 (,n=3)

4 討論

狼毒大戟是大戟科多年生草本植物，其根可入藥，中醫(yī)記載其為毒性中藥，常以“以毒攻毒法”用于癌癥、結(jié)核及腹水性疾病的治療。對(duì)于狼毒大戟的毒性，李時(shí)珍在《本草綱目》中提及：“狼毒，觀其名，知其毒矣”[22]。課題組前期研究中從狼毒大戟根部分離得到五環(huán)三萜類化合物羽扇豆醇，經(jīng)多項(xiàng)體外細(xì)胞及體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的抑制活性[23-24]，具有深入研究?jī)r(jià)值。但羽扇豆醇的水溶性很低，限制了其進(jìn)一步研究。琥珀酸是一種常見(jiàn)結(jié)構(gòu)修飾基團(tuán)，可使藥物具有良好的溶解性和穿透性，課題組前期以琥珀酸對(duì)羽扇豆醇的C-3位羥基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，成功制備羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抗增殖活性較母體羽扇豆醇顯著提升。

肝癌是嚴(yán)重威脅人們生命健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且生存時(shí)間短、預(yù)后不良[25]。雖然分子靶向藥物治療取得了一定的療效，但是毒副作用及耐藥性的問(wèn)題仍然存在。因此從傳統(tǒng)天然藥用植物中挖掘具有潛在藥用研究?jī)r(jià)值的新結(jié)構(gòu)，并通過(guò)結(jié)構(gòu)改造進(jìn)一步得到低毒、高效的抗肝癌藥物具有重要意義。基于線粒體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的重要信號(hào)通路，本研究通過(guò)觀察羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抗增殖作用，并基于線粒體凋亡途徑對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，以期為羽扇豆醇類抗腫瘤藥物的研制提供參考。

本研究結(jié)果表明羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出呈濃度相關(guān)性地抑制作用。羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯作用HepG2細(xì)胞48 h的IC50值為（8.60±0.28）μmol/L，是母體羽扇豆醇[IC50＝（43.60±0.17）μmol/L]的5.03倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明引入琥珀酸酯結(jié)構(gòu)對(duì)羽扇豆醇的抗增殖活性具有顯著提升作用。

本研究中對(duì)羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯的抗HepG2細(xì)胞增殖機(jī)制研究主要圍繞線粒體相關(guān)信號(hào)通路開(kāi)展。由于線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的敏感靶點(diǎn)，而腫瘤細(xì)胞中的氧化還原平衡又是異常的[26]，所以線粒體功能受損對(duì)ROS觸發(fā)的凋亡至關(guān)重要。研究表明，藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒性作用的一個(gè)主要原因就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS而引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激效應(yīng)[27]。同時(shí)，過(guò)量的ROS能夠增加線粒體的通透性，從而降低線粒體的膜電位，導(dǎo)致Cyt-C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。另外，在腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，蛋白水解酶Caspase家族同樣發(fā)揮著重要作用，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的Cyt-C將在ATP和dATP的協(xié)助下形成凋亡復(fù)合體，繼而激活蛋白水解酶Caspase-9，使其發(fā)生自身裂解形成cleaved Caspase-9，而裂解的Caspase-9進(jìn)一步激活蛋白水解酶Caspase-3，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，觸發(fā)線粒體信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞凋亡[28]。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI雙染、DCFH-DA染色、JC-1染色等流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)相關(guān)凋亡指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯作用于HepG2細(xì)胞后，可以使細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著增加，線粒體膜電位下降，并呈現(xiàn)濃度相關(guān)性的誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，采用Western Blotting法檢測(cè)羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯作用HepG2細(xì)胞后相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平的變化，研究結(jié)果顯示，羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡作用可以呈現(xiàn)濃度相關(guān)性的下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax、Cyt-C、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)。

綜上所述，羽扇豆醇-3β-琥珀酸酯在體外可以顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。其作用機(jī)制可能與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑相關(guān)。本研究為天然源五環(huán)三萜類化合物的抗肝癌作用研究及成藥性研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突