陳夢，陳瑤，楊向竹，趙丕文*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 102488

2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

乳腺癌已成為全球發(fā)病率最高的癌癥類型，2020年乳腺癌已躍升成為全球女性癌癥發(fā)病率和死亡率首位，嚴重威脅著女性的健康和生命[1-2]。手術(shù)和化療是目前臨床治療乳腺癌的常用手段，但是不良反應(yīng)較大，治療效果也有待提高。中藥的藥理作用廣泛，對乳腺癌的治療具有積極的意義，在術(shù)后干預(yù)過程中也體現(xiàn)出較大的優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景。

丹參為唇形科草本植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，味苦，性微寒，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛等功效，在臨床具有廣泛的應(yīng)用[3-4]。丹參及其有效成分抗乳腺癌的作用已經(jīng)被多項研究證實[5-7]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[8]篩選丹參的成分、乳腺癌靶點及丹參治療乳腺癌的核心靶點，并通過分子對接技術(shù)驗證活性成分與靶點的親和力，探討丹參治療乳腺癌的作用機制，為臨床治療提供進一步的理論參考。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及靶點的獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索丹參的有效成分及對應(yīng)的靶點。在UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）中將靶點蛋白轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一的基因名稱。

1.2 疾病靶點預(yù)測與藥物-疾病交集靶點的篩選

在GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）、TTD（https://db.idrblab.net）中以“breast cancer”為檢索詞獲取乳腺癌相關(guān)的靶點信息。將藥物與疾病的靶點基因?qū)隕xcel，映射得到藥物與疾病的共同靶點，通過在線作圖網(wǎng)站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

建立相關(guān)疾病、藥物、藥物成分與交集靶點相關(guān)的network和type文件，導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建完整的“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，探究丹參及活性成分治療乳腺癌的多個靶點的作用機制。將疾病-藥物交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org），研究物種選擇“homo sapiens”進行搜索，導(dǎo)出TSV格式的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)集，用Cytoscape 3.8.0軟件可視化，得到蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點的degree表示節(jié)點之間的連接數(shù)，degree越大，成為核心化合物、核心靶蛋白的可能性越高。

1.4 基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）對藥物-疾病交集靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。通過微生信在線繪圖網(wǎng)站（www.bio informatics.com.cn）繪制GO和KEGG富集圖。

1.5 藥物活性成分與核心靶點的分子對接

選取PPI網(wǎng)絡(luò)圖譜中degree值較大的靶點蛋白，通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）獲取蛋白的三維結(jié)構(gòu)，作為對接受體。通過Pub Chem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載丹參主要活性化合物的3D結(jié)構(gòu)，通過Open babel 3.1.1軟件轉(zhuǎn)化為pdb格式，作為對接配體。通過AutoDock Tools 1.5.7軟件對分子進行去水、加氫等前處理，設(shè)置活性口袋，導(dǎo)出gpf格式的數(shù)據(jù)。通過AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接驗證，以pdbqt格式導(dǎo)出，在PyMol 2.6.0中進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 丹參化學(xué)成分與靶點的篩選

利用TCMSP篩選丹參的活性成分和靶蛋白，設(shè)置口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，收集到65種關(guān)鍵化學(xué)成分，見表1。剔除無對應(yīng)信息的成分后，共得到59個活性成分，將篩選出的靶基因輸入到UniProt數(shù)據(jù)庫進行名稱校正，得到114個對應(yīng)靶點。

表1 丹參的活性成分Table 1 Active ingredients of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma

2.2 乳腺癌相關(guān)靶點與交集靶點的篩選

在GeneCards中獲得乳腺癌相關(guān)靶點2 023個，在OMIM中獲得499個，在TTD中獲得184個，刪除重復(fù)靶點，共獲得2 488個疾病靶點。通過在線作圖網(wǎng)站進行韋恩圖繪制，獲得藥物-疾病共有靶點67個，見圖1。

圖1 丹參與乳腺癌靶點的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and breast cancer targets

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物與疾病的交集靶點及丹參活性成分通過Cytoscape軟件制作可視化的網(wǎng)絡(luò)圖譜，見圖2。結(jié)合圖譜緊密度選取木犀草素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ作為拮抗乳腺癌的主要活性成分。

圖2 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.2 “Drug-ingredient-disease-target” network

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物與疾病交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，再通過Cytoscape網(wǎng)絡(luò)可視化，節(jié)點的顏色、大小均與degree值呈正相關(guān)，見圖3。degree值排名前20位的蛋白靶點分別為蛋白激酶B1（Akt1）、腫瘤抑制基因（TP53）、表皮生長因子受體（EGFR）、腫瘤壞死因子（TNF）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、雌激素受體1（ESR1）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）、白細胞介素6（IL-6）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、B細胞淋巴瘤2樣1（BCL2L1）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）、核因子κB抑制因子A（NFκBIA）、鼠雙微染色體（MDM2）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（CASP9）、髓樣細胞白血病蛋白（MCL1），見表2。

圖3 丹參-乳腺癌相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma-breast cancer related targets

表2 Degree值前20位的作用靶點Table 2 Degree value of the first 20 protein targets

2.5 GO與KEGG富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行GO功能分析，根據(jù)P≤0.01，F(xiàn)DR≤0.05篩選GO分析條目，其中生物過程（BP）229條，細胞組成（CC）17條，分子功能（MF）49條。根據(jù)P值排序選取前10位的結(jié)果作圖，見圖4。BP主要是對轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、對細胞凋亡過程的雙向調(diào)節(jié)、對基因表達的正負向調(diào)控、對細胞增殖的正向調(diào)節(jié)等。CC主要是大分子復(fù)合物、核質(zhì)、胞漿、細胞質(zhì)、染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等。MF主要是酶結(jié)合、配體激活序列特異性DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、細胞因子活性和類固醇激素受體活性等。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行KEGG通路分析，根據(jù)P≤0.01，F(xiàn)DR≤0.05篩選出121條通路信息，根據(jù)P值排序選取前20位的結(jié)果作圖，見圖5。富集通路包括癌癥信號通路、前列腺癌、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt信號通路、小細胞肺癌、膀胱癌、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末化產(chǎn)物（AGE）/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路等。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接

根據(jù)PPI分析結(jié)果，選取degree值較高的靶點Akt1、TP53、EGFR、TNF、CASP3、VEGFA與丹參的主要活性成分木犀草素、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA進行分子對接模擬。分子對接的結(jié)果以結(jié)合能的大小表示受體與配體之間的結(jié)合活性，結(jié)合能＜0 kJ/mol即可判定配體與受體具有自發(fā)結(jié)合的能力。結(jié)合能越小，表明受體和配體親和力越高，發(fā)生作用的可能性越大。結(jié)合能＜-5.0 kJ/mol表明結(jié)合活性較高，結(jié)合能＜-7.0 kJ/mol表明結(jié)合活性很強[9]。結(jié)果顯示，丹參中活性成分與疾病靶蛋白結(jié)合能均＜-5.0 kJ/mol，說明結(jié)合能力均比較高，見圖6。通過Pymol軟件可視化，結(jié)果見圖7。

圖7 活性成分與核心靶點分子對接圖Fig.7 Macromolecular docking diagram of active ingredient and key target

3 討論

乳腺癌是目前全球女性癌癥發(fā)病和死亡的首要原因，是2020年確診數(shù)量最多的癌癥類型，乳腺癌首次成為全球發(fā)病率第1位的腫瘤疾病[10]，發(fā)病原因與細胞焦亡基因密切相關(guān)[11]。乳腺癌術(shù)后輔助中藥治療可明顯減輕不良反應(yīng)，降低復(fù)發(fā)率[12-13]。丹參最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》“丹參……破癥，除瘕，止煩滿，益氣”[14]，《中國藥典》2020年版記載其具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效[15]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參包括丹酚酸類化合物、醌類化合物等多種活性成分，其中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ等均具有拮抗乳腺癌的作用[16-18]。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法收集到丹參的有效活性成分59個，對應(yīng)靶點114個，預(yù)測到乳腺癌靶點2 488個，獲取疾病和活性成分的共同靶點67個。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出Akt1、TP53、EGFR、TNF、CASP3、VEGFA作為核心靶點。根據(jù)分子對接驗證，上述核心靶點與木犀草素、隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮ⅡA均具有良好的結(jié)合能力，構(gòu)象穩(wěn)定，因此推斷以上核心靶點即為丹參干預(yù)乳腺癌的關(guān)鍵作用靶點。Akt通路的過度表達或過度激活是乳腺癌常見的發(fā)病機制之一[19]，Akt1是Akt的異構(gòu)體之一，在人體組織中廣泛表達，可通過阻斷細胞周期、調(diào)控下游蛋白抑制乳腺腫瘤生長[20-21]。TP53基因編碼腫瘤抑制蛋白，在癌癥中是較為常見的突變基因[22-23]，30%～35%的浸潤性原發(fā)性乳腺癌中會發(fā)生該基因的突變，突變型TP53蛋白容易在癌細胞中積累，可以作為腫瘤惡性程度的重要參考指標[24-25]。EGFR是廣泛分布于人體組織細胞膜上的多功能糖蛋白，也是激素受體陽性乳腺癌、三陰性乳腺癌等的治療靶點[26-27]，當EGFR的信號傳導(dǎo)通路被改變時，容易引起上皮組織轉(zhuǎn)化，引發(fā)腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[28]。TNF是由巨噬細胞或T淋巴細胞分泌的小分子蛋白，包括TNF-α和TNF-β 2種亞型，可直接抑制腫瘤細胞或通過調(diào)節(jié)機體免疫功能來抑制腫瘤細胞，但細胞因子TNF在乳腺癌以往的研究中出現(xiàn)較少。CASP3是細胞凋亡過程中最關(guān)鍵的酶之一，與乳腺癌的發(fā)生關(guān)系密切。VEGFA不僅可以促進腫瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖和新生血管的形成，還能夠間接地參與腫瘤免疫反應(yīng)，因此對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移也有重要作用[29-30]?；谏鲜鲇懻摪l(fā)現(xiàn)核心靶點涉及細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多方面，表明丹參通過多靶點協(xié)同作用治療乳腺癌。

通過GO功能分析，發(fā)現(xiàn)丹參活性成分在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞凋亡的調(diào)節(jié)、基因表達調(diào)控、細胞增殖的調(diào)節(jié)、大分子復(fù)合物、核質(zhì)、細胞質(zhì)、染色質(zhì)、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合細胞因子活性等方面具有特異性作用。通過KEGG通路分析，丹參活性成分顯著富集在癌癥通路、前列腺癌、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、PI3K/Akt信號通路等，表明丹參具有較強的抗癌作用，同時對于血管疾病或炎癥等也具有一定的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法探討了丹參治療乳腺癌的主要成分和作用靶點，分析了多條通路協(xié)同作用的機制，為后續(xù)丹參治療乳腺癌的深入研究提供了指導(dǎo)方向，使其更好的應(yīng)用于臨床。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突