劉滿菊，王小穩(wěn)，陳丹，邰亞輝，孫曉敏

作者單位：鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院西區(qū)門診部，河南 鄭州450000

肺炎支原體肺炎（MPP）占兒童社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%［1］，難治性肺炎支原體肺炎（RMPP）病兒臨床癥狀或影像學(xué)表現(xiàn)難以改善甚至繼續(xù)進(jìn)展，可導(dǎo)致預(yù)后不良［2］。RMPP的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，過(guò)度免疫反應(yīng)是肺炎支原體（MP）感染引起的多系統(tǒng)癥狀和RMPP的重要因素［3］。Toll樣受體（TLR）是一種模式識(shí)別受體，激活后通過(guò)銜接蛋白MyD88發(fā)出信號(hào)，對(duì)促炎細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)揮作用，并將免疫細(xì)胞募集到感染部位。研究表明，TLR是MP的重要受體，其中TLR2可能與MP感染引起的過(guò)度炎癥密切相關(guān)［4］。還有研究顯示，RMPP病兒血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平顯著高于非RMPP病兒［5］。本研究旨在探討TLR2對(duì)兒童肺炎支原體肺炎肺部炎癥表現(xiàn)和TNF-α的調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1月至2022年1月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院診治的MPP病兒27例，其中RMPP病兒12例、非RMPP病兒15例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①入院時(shí)有肺炎的體征和癥狀；②胸片上有肺炎浸潤(rùn)；③鼻咽抽吸物中檢測(cè)出MP陽(yáng)性（≥1.0×104DNA copies）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞14歲；②鼻咽分泌物經(jīng)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)為呼吸道合胞病毒、流感病毒、腺病毒、副流感病毒陰性，核酸檢測(cè)為沙眼衣原體等其他病原體；③鼻咽分泌物細(xì)菌培養(yǎng)和雙陰性血培養(yǎng)陽(yáng)性。RMPP根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)診斷［6］：①持續(xù)發(fā)熱7 d或更長(zhǎng)時(shí)間，②持續(xù)高熱、頑固刺激性咳嗽，或出現(xiàn)肺外并發(fā)癥等多系統(tǒng)損害，③使用抗生素治療后咳嗽和胸片浸潤(rùn)增加。選取非感染病兒12例作為對(duì)照。入院后收集外周血2 mL，半徑10 cm、1 000×g下離心10 min，血清保存在-80 ℃冰箱備用。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病兒監(jiān)護(hù)人均簽署了知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件 標(biāo)準(zhǔn)MP菌株來(lái)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），菌株在支原體肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2天刷新一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)5～6 d后，培養(yǎng)基顏色從紅色變?yōu)辄S色，表明MP處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞（CCTCC）在10%胎牛血清（FBS）的Duibeco改良eagIe培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)。使用人中性粒細(xì)胞分離試劑盒在采集后2 h內(nèi)從外周血樣中提取中性粒細(xì)胞。用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞治療 在顯微鏡下對(duì)每個(gè)非感染病兒的外周血中性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將其分為陰性對(duì)照（NC）組和MP刺激組。每份約106個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中。MP通過(guò)肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量。定量后用磷酸鹽緩沖液（PBS）懸浮洗滌2次，最后用RMPI-1640培養(yǎng)基重新懸浮至濃度108個(gè)細(xì)胞/mL。MP刺激組以100∶1的感染率向中性粒細(xì)胞添加1 mL MP混懸液，NC組向中性粒細(xì)胞中添加1 mL RMPI-1640培養(yǎng)基。然后在37 ℃，5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)室中培養(yǎng)6 h。

將A549細(xì)胞接種在10%FBS的DMEM培養(yǎng)基6孔板中。增長(zhǎng)到面積的50%時(shí)，MP刺激組添加1 mL 108/mL MP混懸液，NC組加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。NF-κB抑制組在培養(yǎng)基中補(bǔ)充100 μmol/L的NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（PDTC）預(yù)處理1 h，同時(shí)加入1 mL 108/mL MP混懸液。MyD88抑制組用100 μmol/L的MyD88抑制劑NBP2-29328預(yù)處理24 h。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%密度時(shí)，加入1 mL 108/mL MP混懸液培養(yǎng)12 h。

1.2.4 TNF-α表達(dá)測(cè)量 使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，在450 nm處測(cè)量吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清TNF-α表達(dá)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）RT-qPCR方法如以往研究所述［7］，用TRIzol試劑分離外周血中性粒細(xì)胞RNA，并使用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用基因特異性引物和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix預(yù)混液（低ROX）在AppliedBiosystems7500系統(tǒng)上運(yùn)行RT-qPCR。使用人TLR基因的引物序列檢測(cè)靶基因表達(dá)水平，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）mRNA水平，并使用2-ΔΔCt方法測(cè)定相對(duì)表達(dá)。見表1。

表1 TLR基因的引物序列

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法 為了檢測(cè)A549細(xì)胞中p-p65和Myd88的蛋白表達(dá)，使用總蛋白提取試劑盒提取A549細(xì)胞蛋白。用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。在Tris/HCl緩沖系統(tǒng)中使用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠對(duì)等量的蛋白質(zhì)（30 μg蛋白質(zhì)/泳道）進(jìn)行電泳，然后將電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯微孔膜。隨后在室溫下用5%脫脂乳密封膜2 h，并與稀釋1/1 000的GAPDH、NF-κBp65和MyD88抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。再用含有TBST的Tris緩沖鹽洗滌5次后，使用合適的第二抗體和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)完成免疫檢測(cè)。使用Image Lab成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶的光密度掃描，確定每個(gè)條帶的積分光密度值（IOD），并進(jìn)行光密度掃描分析。

1.2.7 流式細(xì)胞分析 A549細(xì)胞在6孔板中生長(zhǎng)至接近匯合，并用MP（MOI 1∶100）培養(yǎng)12 h，然后在胰蛋白酶孵育后收獲。將細(xì)胞懸浮液在300×g下離心10 min，并將顆粒細(xì)胞重新懸浮在PBS中（在80μL PBS中最多107個(gè)有核細(xì)胞）。向細(xì)胞懸浮液中加入20 μL FcR阻斷試劑，持續(xù)10 min。然后，加入2.5 μL APC標(biāo)記的抗人TLR4抗體和2.5 μL PE標(biāo)記的TLR2抗體，將混合物在2～8 ℃的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)10 min。在1～2 mL PBS中洗滌細(xì)胞，并在半徑3 cm、300×g下離心10 min。將獲得的A549細(xì)胞重新懸浮在300 μL PBS中，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 siRNA介導(dǎo)的基因敲除 使用核糖體提取試劑盒將特異性人TLR2 siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染匯合30%～50%的A549細(xì)胞48 h，然后在37 ℃，5%二氧化碳下感染MP（MOI=1∶100）24 h，通過(guò)ELISA試劑盒測(cè)定上清液中的細(xì)胞因子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以描述，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析（SNK-q檢驗(yàn)），計(jì)數(shù)資料采用例（%）描述，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。所有檢驗(yàn)均為雙尾，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病兒一般資料及MPP病兒臨床特征比較MPP組男11例、女4例，年齡（4.60±1.76）歲，RMPP組男8例、女4例，年齡（5.35±1.11）歲，NC組男6例、女6例，年齡（5.18±1.54）歲，三組病兒性別年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RMPP病兒胸腔積液和肺不張發(fā)病率高于MPP（P＜0.05），其他臨床特征兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 MPP病兒15例與RMPP12例臨床特征比較

2.2 MPP病兒血清TNF-α和中性粒細(xì)胞TLR mRNA水平 MPP病兒血清TNF-α水平高于NC組，且RMPP組高于MPP組（P＜0.05）。RMPP組外周血中性粒細(xì)胞TLR1和TLR2mRNA高于MPP組（P＜0.05）。MPP組TLR2 mRNA高于NC組（P＜0.05）。TLR4和TLR6 mRNA表達(dá)三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 RMPP、MPP和NC組病兒TNF-α和TLR mRNA水平比較/

表3 RMPP、MPP和NC組病兒TNF-α和TLR mRNA水平比較/

注：NC為對(duì)照，MP為肺炎支原體，RMPP為難治性肺炎支原體，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，TLR為Toll樣受體。①與NC組比較，P＜0.05。②與MPP組比較，P＜0.05。

組別NC組MPP組RMPP組F值P值TLR6 mRNA/×10-3 51.29±13.77 48.77±15.15 49.29±13.77 1.23 0.136例數(shù)12 15 12 TNF-α/（ng/L）43.46±19.55 101.15±40.98①244.43±93.29①②5.91＜0.001 TLR1 mRNA/×10-4 4.49±1.98 6.36±2.78 14.49±6.16①②6.68＜0.001 TLR2 mRNA/×10-2 7.40±3.32 13.89±5.11①20.40±8.32①②4.77 0.016 TLR4 mRNA/×10-2 15.87±6.29 17.59±8.08 19.05±8.29 0.22 0.521

2.3 MP刺激增強(qiáng)TNF-α和TLR2表達(dá) MP刺激組的TNF-α和TLR2表達(dá)在中性粒細(xì)胞和A549細(xì)胞中顯著增加（P＜0.05）。見表4。

表4 中性粒細(xì)胞和A549細(xì)胞中兩組TNF-α、TLR2和TLR4表達(dá)/

表4 中性粒細(xì)胞和A549細(xì)胞中兩組TNF-α、TLR2和TLR4表達(dá)/

注：NC為對(duì)照，MP為肺炎支原體，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，TLR為Toll樣受體。

組別NC組MP刺激組t值P值A(chǔ)549細(xì)胞中性粒細(xì)胞TLR4 1 117.17±269.74 1 107.33±248.30 0.09 0.927例數(shù)12 12 TNF-α/（ng/L）10.10±1.80 19.50±1.30 14.66＜0.001 TLR2 3 078.32±760.64 3 760.17±772.06 2.18 0.040 TLR4 902.00±202.10 862.50±136.48 0.56 0.580 TNF-α/（ng/L）150.30±20.50 505.60±92.40 13.00＜0.001 TLR2 3 445.67±668.48 4 224.00±711.12 2.76 0.011

2.4 TLR2敲除抑制TNF-α表達(dá) 用靶向TLR2的siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，與siNC組相比，在TLR2沉默的細(xì)胞中MP刺激誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)受到顯著抑制（P＜0.05），見表5。

表5 ELISA測(cè)定對(duì)照組或MP感染的A549細(xì)胞中TNF-α的分泌/（ng/L，）

表5 ELISA測(cè)定對(duì)照組或MP感染的A549細(xì)胞中TNF-α的分泌/（ng/L，）

注：siNC為靶向TLR2的siRNA轉(zhuǎn)染的對(duì)照，siTLR-2為靶向TLR2的siRNA轉(zhuǎn)染的Toll樣受體2，MP為肺炎支原體。①與siNC組比較，P＜0.05。②與siNC+MP組比較，P＜0.05。

例數(shù)12 12 12 12 TNF-α 24.42±11.11 21.84±11.69 42.24±10.94①36.15±11.09①②4.52 0.034組別siNC組siTLR-2組siNC+MP組siTLR-2+MP組F值P值

2.5 MP刺激增強(qiáng)TLR相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)Western blotting結(jié)果顯示，MP刺激后A549細(xì)胞中MyD88和NF-κB p65表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），見圖1，表6。

圖1 肺炎支原體刺激的A549細(xì)胞中MyD88（A）和NF-κB p65（B）的蛋白質(zhì)印跡圖像

表6 肺炎支原體刺激的A549細(xì)胞中MyD88和NF-κB p65的表達(dá)變化/

表6 肺炎支原體刺激的A549細(xì)胞中MyD88和NF-κB p65的表達(dá)變化/

注：NC為對(duì)照，MP為肺炎支原體，PTDC為吡咯烷二硫代氨基甲酸銨，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。①與NC組比較，P＜0.05。

NF-κB p65/GAPDH 1.00±0.00 1.84±0.69①0.78±0.16①0.88±0.19①（0.22）0.521組別NC MP PDTC PDTC+MP t（F）值P值例數(shù)12 12 12 12 MyD88/GAPDH 1.00±0.00 1.68±0.28①13.74＜0.001

2.6 阻斷Myd88或NF-κB減弱MP刺激TNF-α表達(dá) 抑制MyD88或NF-κB后用MP刺激A549細(xì)胞顯示，PDTC和NBP2-29328均可顯著抑制MP誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)增加，見表7。

表7 阻斷Myd88或NF-κB減弱MP刺激TNF-α表達(dá)/（ng/L，）

表7 阻斷Myd88或NF-κB減弱MP刺激TNF-α表達(dá)/（ng/L，）

注：NC為對(duì)照，MP為肺炎支原體。①與NC組比較，P＜0.05。②與MP組比較，P＜0.05。

阻斷Myd88阻斷NF-κB組別TNF-α例數(shù)TNF-α組別例數(shù)NC MP NBP2-29328 MP+NBP2-29328 F值P值10.42±1.13 19.98±1.48①14.42±1.11①②17.64±1.69①②4.05＜0.001 12 12 12 12 18.26±2.48 27.07±6.14①16.24±5.74②20.05±6.59②2.28 0.026 NC MP PDTC MP+PDTC 12 12 12 12

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)MPP發(fā)病率不斷上升，5歲以上兒童的感染率高達(dá)70%，MPP可導(dǎo)致急性呼吸道炎癥以及肺外綜合征，過(guò)度炎癥反應(yīng)易引起不良臨床結(jié)果［8］，了解炎癥介導(dǎo)的組織損傷的作用機(jī)制對(duì)預(yù)防和治療該病導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥具有重要意義。

上皮細(xì)胞具有分泌TNF-α的功能，黏附上皮細(xì)胞是MP致病的第一步，肺部炎癥和全身過(guò)度炎癥的發(fā)生可能是由MP和TNF-α共同刺激引發(fā)的中性粒細(xì)胞炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的［9］。本研究顯示，MPP病兒血清TNF-α水平明顯高于NC組，RMPP組明顯高于MPP組（P＜0.05）。中性粒細(xì)胞是重要的炎癥細(xì)胞，多形核中性粒細(xì)胞在MPP病兒的支氣管肺泡灌洗液和外周血中顯著增加［10］。在毒素誘導(dǎo)的肺損傷模型中，肺泡巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌TNF-α調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞募集［11］。之前的研究證實(shí)，MPP病兒外周血中性粒細(xì)胞顯著升高，尤其是RMPP病兒，因此中性粒細(xì)胞可能參與MPP的過(guò)度炎癥、肺炎和肺損傷［12］。本研究中，中性粒細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4和TLR6的mRNA水平在MPP病兒中顯著增加，且RMPP組高于MPP組（P＜0.05），此外中性粒細(xì)胞和A549細(xì)胞經(jīng)MP刺激后TNF-α和TLR2表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。TLR2在感染后氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，Ju等［13］發(fā)現(xiàn)缺乏或抑制TLR2不僅可以防止博萊霉素誘導(dǎo)的炎癥，還能通過(guò)逆轉(zhuǎn)博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化組織中的免疫抑制微環(huán)境來(lái)防止和逆轉(zhuǎn)進(jìn)行性肺纖維化。Jung等［14］確定TLR-2可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路導(dǎo)致NF-κB易位及TNF-α和IL-1β分泌，是介導(dǎo)博萊霉素刺激的肺部炎癥和纖維化的關(guān)鍵受體。NF-κB位于TLR信號(hào)下游的關(guān)鍵位置，參與炎癥分子的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤生長(zhǎng)抑制等多種生理和病理過(guò)程，活化的NF-κB調(diào)節(jié)IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，并引發(fā)炎癥反應(yīng)［15］。MyD88是TLR激活NF-κB的重要途徑，研究表明，TLR2-MyD88-NF-κB途徑與急性肺損傷、慢性阻塞性肺炎、哮喘、肺癌等肺部疾病的發(fā)生密切相關(guān)［16-17］。MP是一種無(wú)細(xì)胞壁微生物，細(xì)胞膜上的脂蛋白暴露于免疫細(xì)胞，因此TLR2是參與MP識(shí)別的最重要的TLR［18-19］。本研究側(cè)重于TLR2在MPP疾病中的作用，結(jié)果顯示，MP刺激后A549細(xì)胞中TLR2、MyD88和NF-κBp65水平明顯升高，而在抑制TLR2、MyD88或NF-κB后，MP誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)明顯降低。表明TLR2-MyD88-NF-κB途徑在MP誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生中起重要作用。

綜上所述，TLR2可能通過(guò)TLR2-MyD88-NF-κB途徑介導(dǎo)TNF-α的表達(dá)并參與了肺部炎癥反應(yīng)。TLR2的表達(dá)水平可作為潛在的MPP嚴(yán)重程度的判斷指標(biāo)。