楊睿，李占江，陳騰飛

作者單位：鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，河南 鄭州450000

肺癌是世界范圍內發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］，其中非小細胞腺癌是最常見的類型，已進入個體化治療時期［2］。但病人3年總生存率仍然較低。叉頭蛋白轉錄因子3（FOXO3），主要參與細胞的生長、增殖、分化和轉化等過程［3］。FOXO3基因表達在癌組織中下調，常被稱為腫瘤抑制器［4］。YTH結構域家族蛋白2（YTHDF2）作為RNA甲基化的閱讀器蛋白，在腫瘤發(fā)展中起到重要作用［5］。但在肺癌中的表達及其對肺腺癌的影響目前報道尚少。因此，本研究主要分析YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中的表達，及與病人臨床病理特征和累積生存率的影響，以期為肺腺癌的預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年5月鄭州大學第一附屬醫(yī)院行手術治療的肺腺癌病人癌組織及對應的癌旁組織（距離癌組織5 cm以上）80對，其中男52例，女28例。納入標準：原發(fā)性肺腺癌；臨床及病理資料完整。排除標準：拒絕參加此次調查研究者；隨訪時間少于1個月者；有精神疾病史病人；其他部位腫瘤及心、腦、肝、腎等嚴重疾病病人。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 生物學分析 采用Ualcan網(wǎng)站，使用其中的癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫對YTHDF2、FOXO3基因的表達分析、生存預后，并進行可視化。

1.2.2 免疫組織化學檢測 按照常規(guī)取材肺腺癌組織標本及癌旁正常組織標本，使用免疫組織化學試劑盒（北京博奧派克生物科技有限公司）進行染色，具體操作按照說明書進行。

1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 強度評分：未染色：0分；略染色：1分；明顯染色：2分；深棕色：3分。陽性細胞數(shù)比例：隨機觀察不少于5個視野，計數(shù)500個細胞中染色陽性細胞數(shù)，陽性細胞數(shù)目＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，≥50%為3分。強度評分×陽性細胞數(shù)比例為染色評分，根據(jù)評分結果分為兩組：分數(shù)＜4即為低表達、分數(shù)≥4即為高表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.2軟件進行統(tǒng)計學分析。陽性細胞數(shù)目為計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 YTHDF2及FOXO3在肺腺癌中及癌旁正常組織中的表達差異 比較TCGA數(shù)據(jù)庫中515例肺腺癌組織和59例癌旁正常組織中YTHDF2、FOXO3基因的表達水平，結果顯示YTHDF2、FOXO3基因在肺腺癌組織和癌旁正常組織中表達差異有統(tǒng)計學意義（58.39±21.21比49.06±17.36，13.16±4.33比23.24±7.63，t=3.26、15.38，P=0.001、＜0.001）。

2.2 YTHDF2、FOXO在肺腺癌組織及癌旁正常組織中的免疫組化結果 免疫組化結果顯示，YTHDF2、FOXO3基因主要定位于細胞質或細胞核，見圖1。YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中的高表達率分別為26.25%（21/80）、18.75%（15/80），明顯低于癌旁正常組織中的82.50%（66/80）、88.75%（71/80）（χ2=51.02、78.84，均P＜0.001）。

圖1 YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌組織及癌旁正常組織中的表達（免疫組織化學法×100）

2.3 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3表達相關性 GEPIA數(shù)據(jù)庫中分析顯示，肺腺癌中YTHDF2與FOXO3基因表達水平的對數(shù)值呈正相關性（R=0.36，P＜0.05）。

2.4 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白表達情況與病人臨床病理參數(shù)之間的關系 YTHDF2蛋白表達情況與肺腺癌病人年齡、淋巴結轉移和分化程度相關（P＜0.05）；與TNM分期、性別無關（P＞0.05）；FOXO3蛋白表達情況與肺腺癌病人性別和分化程度相關（P＜0.05）；與TNM分期、年齡、淋巴結轉移無關（P＞0.05）。見表1。

表1 YTHDF2、FOXO3蛋白與肺腺癌臨床病理特征的關系/例（%）

2.5 肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白表達情況與肺腺癌病人3年生存情況的關系 病例隨訪的方式：采用電話或信件隨訪，隨訪時間從出院至最近一次隨訪，隨訪期限為3年。肺腺癌組織中YTHDF2蛋白高表達組和低表達組病人3年累積生存率分別為53.30%、14.00%，經(jīng)Log-Rank比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=24.60，P＜0.001）；FOXO3蛋白高表達組和低表達組病人3年累積生存率分別為64.50%、12.20%，經(jīng)Log-Rank比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=18.20，P＜0.001）。

3 討論

肺癌已經(jīng)逐漸成為全球癌癥死亡的主要原因［6］。其中有87%被歸類為非小細胞肺癌，而肺腺癌和肺鱗狀細胞癌是主要的病理類型［7］。FOXO3是一種“腫瘤抑制因子”［8］，也是四種相關的FOXO轉錄因子之一，可保護細胞免受各種生理應激的影響［9］。FOXO3已被證明在DNA修復，生長停滯和細胞凋亡中具有重要作用［10］。研究表明FOXO3能夠激活促凋亡轉錄程序，并且可促進人類肺癌致癌物產生炎癥反應［11］。FOXO3定位于6號染色體，編碼673個氨基酸［12］。FOXO3在蛋白質中的水平受到絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）的影響。Akt能夠促進特定殘基上磷酸化FOXO3，并導致其胞質滯留和轉錄失活，同時Akt可被磷脂酰肌醇3-激酶信號激活［13］。FOXO3可以通過調節(jié)細胞增殖、遷移及血管生成參與癌癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3還參與許多化療藥物（吉非替尼等）的作用機制［14］。另有研究顯示敲除FOXO3基因會促使腫瘤的發(fā)生，從而發(fā)現(xiàn)FOXO3作為抑癌基因發(fā)揮作用［15］。然而，其他研究報道FOXO3在腫瘤發(fā)生中起相反的作用，可促進腫瘤細胞的轉移。例如，有研究表明FOXO3既能抑制也能促進乳腺癌細胞的進展，且調節(jié)FOXO3活性對于腫瘤生長和轉移至關重要［16］。

YTHDF2能夠識別和削弱mRNA穩(wěn)定性［17］。最新的報告稱YTHDF2是能夠降解兩種腫瘤啟動子并且能夠抑制腫瘤基因表達，增強干細胞自我更新能力［18］。癌細胞的代謝特征對于適應腫瘤微環(huán)境內的變化至關重要，通常有助于表觀遺傳可塑性［19］。Shen等［20］研究報道，YTHDF2在胃癌組織及細胞中均為低表達，其表達水平與胃癌分期及病人的生存期密切相關，可作為胃癌的預后標志物。另王月帆等［21］研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中YTHDF2高表達，且YTHDF2高表達病人具有更低的總體生存率和無復發(fā)生存率，YTHDF2可作為判斷肝癌病人預后的分子標志物。但YTHDF2、FOXO3蛋白在肺腺癌中的作用尚不明確，因此本研究分析肺腺癌組織和癌旁正常組織中YTHDF2、FOXO3蛋白的表達變化。

本研究免疫組化結果發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中YTHDF2、FOXO3蛋白高表達率均較癌旁正常組織低，F(xiàn)OXO3蛋白表達與TCGA數(shù)據(jù)庫中FOXO3基因表達的結果一致，而YTHDF2蛋白表達與TCGA數(shù)據(jù)庫中YTHDF2基因表達的結果不一致，考慮可能與本研究納入樣本量與TCGA數(shù)據(jù)庫中的樣本量相差較大有關，需擴大樣本進行驗證。另外，GEPIA數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中YTHDF2與FOXO3基因表達水平的對數(shù)值呈正相關。上述結果提示YTHDF2、FOXO3表達異常與肺腺癌的發(fā)生密切相關，F(xiàn)OXO3可能通過抑制轉錄因子的激活，從而降低相關基因的表達，抑制癌細胞的增殖。分析原因可能為YTHDF2、FOXO3蛋白具有DNA結合、轉錄活化和轉錄抑制等功能，與增生、分化、血管再生和侵襲等病理生理關系密切，是重要的細胞調控因子。本研究還發(fā)現(xiàn)，YTHDF2蛋白表達與肺腺癌病人年齡、淋巴結轉移和分化程度相關，而FOXO3蛋白表達與肺腺癌病人性別、分化程度相關，提示YTHDF2、FOXO3表達受多種因素影響，可能在肺腺癌病情進展中發(fā)揮作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF2蛋白、FOXO3蛋白低表達組病人具有更低的3年累積生存率，提示YTHDF2、FOXO3異常低表達病人可能更易發(fā)生預后不良，對于此類病人，應及時采取措施干預，以提高病人的3年累積生存率，并改善生存質量。

綜上所述，YTHDF2、FOXO3在肺腺癌組織中均呈低表達，與病人腫瘤分化程度和3年累積生存率有關，可作為評估預后的潛在標志物。但是本研究樣本量較少，可能存在一定的偏倚，后續(xù)還須擴大樣本繼續(xù)研究。