王添寧 馮雅嵐 琚吉浩 吳 毅 張 均 馬 超,*

小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定與表達分析

王添寧1馮雅嵐2琚吉浩1吳 毅1張 均1馬 超1,*

1河南科技大學農(nóng)學院, 河南洛陽 471000;2武昌理工學院生命科學學院, 湖北武漢 430000

生長調(diào)控因子(growth-regulating factor, GRF)在植物的生長發(fā)育、逆境響應和激素信號轉(zhuǎn)導中起著重要的調(diào)控作用。系統(tǒng)分析小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在基因組上的分布、結(jié)構(gòu)、進化以及表達特性, 對于深入研究GRF家族的生物學功能和小麥的進化具有重要的意義。本研究利用生物信息學方法, 對烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾脫山羊草、粗山羊草、栽培二粒小麥和普通小麥5個物種的GRF成員進行全基因組鑒定, 并對其理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件以及表達特性進行了分析。結(jié)果表明, 烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾脫山羊草、粗山羊草、栽培二粒小麥和普通小麥中分別有15、12、19、29和53個GRF成員, 通過種間共線性分析發(fā)現(xiàn),分別有18個和29個成員與和具有共線性,分別有36個和37個成員與和具有共線性。啟動子順式作用元件預測發(fā)現(xiàn)基因具有基本的轉(zhuǎn)錄元件以及一些與生長發(fā)育和逆境響應的結(jié)合元件。RT-qPCR分析表明, 多數(shù)基因在外源IAA、GA和干旱脅迫條件下呈上調(diào)表達趨勢, 而在高溫脅迫條件下呈下調(diào)表達趨勢, 表明GRF家族成員在響應激素和逆境脅迫中有重要作用。系統(tǒng)進化分析表明, 小麥與其祖先物種之間的GRF成員存在保守且復雜的進化關(guān)系。上述結(jié)果為GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的進化及其功能研究提供了理論基礎(chǔ)。

小麥; 祖先物種; GRF; 生物信息學; 進化分析

轉(zhuǎn)錄因子是一類與RNA聚合酶II形成轉(zhuǎn)錄起始復合體, 從而參與調(diào)控基因表達的一大類基因, 在生物的生長發(fā)育、代謝繁殖、細胞分化和脅迫響應等多種生物學過程中起重要作用[1-3]。人們目前已經(jīng)在植物中發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄因子家族, 其中生長調(diào)控因子(growth-regulating factor, GRF)是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 并在其生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[4-5]?；蚴状卧谒局斜昏b定到, 命名為, 并發(fā)現(xiàn)該基因編碼一種可以參與赤霉素信號通路從而誘導水稻莖伸長的蛋白質(zhì)[6]。近年來, 隨著參考基因組的不斷發(fā)展, GRF轉(zhuǎn)錄因子家族在越來越多的物種被鑒定, 其中包括已經(jīng)在擬南芥中鑒定到的9個成員[7], 在玉米中鑒定到的14個成員[8], 以及在水稻中鑒定到的12個成員[9]。

GRF轉(zhuǎn)錄因子的N端區(qū)域中包含QLQ (Gln、Leu、Gln)和WRC (Trp、Arg、Cys)兩個保守結(jié)構(gòu)域[10-12]。QLQ結(jié)構(gòu)域具有蛋白互作特性, 可以與GRF互作因子GIF (GRF interacting factors)相互作用形成轉(zhuǎn)錄激活因子[13]; WRC結(jié)構(gòu)域包含一個核定位信號NLS (nuclear localization signal)區(qū)域和一個DNA結(jié)合基序(鋅指結(jié)構(gòu)), 可以與其靶基因的順式作用元件結(jié)合并調(diào)節(jié)下游基因的表達[14]?；蛟谟啄鄣闹参锝M織中高度表達, 如: 根尖、花芽和幼葉等, 而在成熟的組織中表達相對較弱[15-16]。另外基因在植物組織或器官的形成過程以及對環(huán)境脅迫的應答反應中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用, 例如有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體的植株矮化、葉片更小[7]; 水稻中表達被抑制也會導致植株矮化和花序發(fā)育延遲[17], 而的過量表達則會導致植株穗長、粒長和粒重的增加[18]。另外王平等在人參中鑒定到20個基因成員, 這些成員可能與赤霉素誘導以及響應高溫脅迫密切相關(guān)[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)基因在植物的氮代謝中起到重要作用, 大白菜中基因通過調(diào)控側(cè)根數(shù)量和參與氮吸收及同化基因的表達, 加速植物生長和硝態(tài)氮同化[20]。近期有研究人員提出可以利用生長因子GRF和GIF、BBM來提高基因組編輯植物的再生效率[21]。也有較多的學者提出, miRNA396- GRF-GIF作用網(wǎng)絡在作物育種和改良中具有潛在的應用價值[22-23]。

小麥()是由3個亞基因組(A、B、D)整合形成的異源六倍體(AABBDD)植物[24-25], 其具有龐大且復雜的基因組, 大小約為16.23 GB[26]。普通小麥是由二倍體植物烏拉爾圖小麥()、擬斯卑爾脫山羊草()和粗山羊草()以及四倍體植物栽培二粒小麥()進化而來的[27-28]。由于小麥種植面積占世界谷類作物的三分之一, 是最重要的糧食作物之一。盡管GRF轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)在玉米[8]、水稻[9]、大豆[29]和谷子[30]等多種植物中被鑒定, 但對于基因在小麥及其祖先物種間的基因擴展機制以及特定的進化關(guān)系還知之甚少。因此, 本研究利用生物信息學, 對小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族進行鑒定, 并對上述5個物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、種內(nèi)和種間差異進行比較分析, 旨在從物種進化的角度進一步深入研究小麥GRF轉(zhuǎn)錄因子的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上獲取擬南芥、烏拉爾圖小麥(, A基因組供體, GCF_003073215.2)、擬斯卑爾脫山羊草(, B基因組可能的供體, GCA_ 021437245.1)、粗山羊草(, D基因組供體, GCF_002575655.2)、栽培二粒小麥(, 染色體組型AABB, GCA_900231445.1)和普通小麥(, 染色體組型AABBDD, GCF_018294505.1)的基因組序列、氨基酸序列以及基因注釋文件(gff文件)。以擬南芥AtGRF氨基酸序列為參考進行BLASTP比對(-value<1e–5)獲得同源序列。登錄Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載GRF家族的隱馬爾科夫模型文件QLQ結(jié)構(gòu)域(PF08880)和WRC結(jié)構(gòu)域(PF08897), 利用HMM3.0進行保守結(jié)構(gòu)域比對, 同時利用Pfam搜索、SMART(http://samrt.embl-heidelberg.de/)和HMMER (https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmscan)驗證候選蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)和亞細胞定位分析

利用ExPASy-ProtParam (https://web.expasy.org/ protparam/)計算GRF蛋白的氨基酸長度和分子量等基本理化性質(zhì)。利用軟件ProtComp 9.0 (https://linux1. Softbe-rry.com/berry.phtml)預測GRF的亞細胞定位。在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取GRF基因組序列, 并利用網(wǎng)站NPS-SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)進行GRF的二級結(jié)構(gòu)預測以及利用網(wǎng)站SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)進行GRF的三級結(jié)構(gòu)預測。

1.3 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進化分析

利用Clustal W工具對5個物種GRF蛋白序列進行多重比對, 利用MEGA11[31]工具采用鄰接法 (Neighbor-Jointing, NJ)構(gòu)建5個物種的系統(tǒng)發(fā)育進化樹(bootstrap, 1000), 利用TBtools[32]軟件進行可視化分析。使用貝葉斯方法, 利用MrBayes v3.1 (Ronquist和Huelsenbeck 2003)設置4鏈(chains, 4), 一百萬代(ngen, 1,000,000), 每100代進行取樣建樹(samplefreq=100), 舍棄25萬代運行程序[33]。

1.4 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取基因結(jié)構(gòu)注釋文件, 使用TBtools軟件對其進行染色體定位和基因結(jié)構(gòu)分析可視化, 利用MEME[34](https://meme-suite.org/ meme/)基于Motif分析家族成員序列保守特性, 并使用TBtools軟件對其進行可視化。

1.5 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族啟動子順式作用元件預測

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取基因的核酸序列, 使用TBtools軟件獲取5個物種基因上游2000 bp的啟動子序列, 提交至PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行啟動子順式作用元件預測, 并使用TBtools軟件對其進行可視化分析。

1.6 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族共線性分析和Ka/Ks分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取5個物種基因序列, 利用MCScanX[35]進行共線性分析(-value<1e–5), Advance Circos進行可視化分析, 并利用MCScanX的默認參數(shù)分析栽培二粒小麥與烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾脫山羊草之間的共線性關(guān)系, 以及普通小麥與栽培二粒小麥、粗山羊草之間的共線性關(guān)系, 并獲得了他們之間的共線性基因?qū)?。在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取基因的核酸序列, 并使用TBtools軟件的a/sCalculator程序計算非同義替換(non- synonymous substitution,a)、同義替換(synonymous substitution,s)及a/s值, 進行選擇壓力分析。

1.7 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族部分成員表達特性分析

選用烏拉爾圖小麥(PI428198)、擬斯卑爾脫山羊草(611)、粗山羊草(HN2203)、栽培二粒小麥(PI79899)和普通小麥 (中國春)為試驗材料, 選擇籽粒飽滿大小一致的種子, 經(jīng)過蒸餾水沖洗后, 進行營養(yǎng)缽種植, 在室溫下待種子發(fā)芽后置于光照培養(yǎng)箱中, 在22℃、光/暗周期為16 h/8 h的條件下培養(yǎng)。待其生長至二葉一心期時進行外源激素和逆境脅迫處理, 外源激素包括: 生長素(100 μmol L–1IAA, 葉面噴施50 mL)、赤霉素(100 μmol L–1GA, 葉面噴施50 ml)、脫落酸(100 μmol L–1ABA, 葉面噴施50 mL)、玉米素(100 μmol L–1ZT, 葉面噴施50 mL); 逆境脅迫包括: 鹽脅迫(200 mmol L–1NaCl, 澆灌100 mL)、低溫(培養(yǎng)箱4℃)、高溫 (培養(yǎng)箱38℃)、干旱(20% PEG-6000, 澆灌100 mL)處理, 以正常生長為對照(CK), 所有處理重復3次。在處理后12 h, 分別取不同物種及不同處理的幼葉, 立即置于液氮保存, 用于實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, RT-qPCR)分析。使用TRIZOL (TaKaRa, 9108Q)試劑提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA (TaKaRa, RR047Q)。利用軟件Primer Premier 5設計引物,()和()為內(nèi)參基因, 各基因引物序列(見表1)。其中反應體系與程序參考ChamQ Universal SYBR qPCR masier Mix (Vazyme)試劑盒說明書, 采用2–ΔΔCt法計算相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定

根據(jù)擬南芥GRF的蛋白序列, 利用BLASTP和HMM進行比對搜索, 在5個物種中總共得到342個GRF家族成員, 通過合并去重后得到209個GRF候選成員, 利用NCBI CD-search去除結(jié)構(gòu)域不完整成員, 最終5個物種共獲得128個GRF家族成員, 其中烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾脫山羊草、粗山羊草、栽培二粒小麥和普通小麥中分別有15、12、19、29和53個GRF家族成員。根據(jù)NCBI基因注釋將其命名為“物種名-基因編號-染色體位置”。使用TBtools軟件對5個物種GRF蛋白的理化性質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)(附表1), 5個物種GRF蛋白序列長度為107～627個氨基酸, 分子量為12.19～67.05 kD。GRF蛋白理論等電點在4.25～10.83, 其中40個位于酸性位置, 1個位于中性位置, 其余均位于堿性位置。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)在39.77～77.10, 其中只有TuGRF8- UN (XM_048695887.1)不穩(wěn)定指數(shù)小于40, 屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)范圍為44.09～87.25。平均疏水指數(shù)范圍為–0.983～ –0.274, 依據(jù)平均疏水指數(shù)是正值為疏水蛋白、負值為親水蛋白、介于–0.5～0.5之間為兩性蛋白的原則, 其中有33個是兩性蛋白, 其他為親水蛋白。

表1 本試驗所用引物

2.2 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位分析

對5個物種GRF蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測發(fā)現(xiàn)(附表2), 128個家族成員的二級結(jié)構(gòu)中均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲是GRF家族成員二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件, 其利于蛋白質(zhì)特殊構(gòu)象的形成。利用SWISS- MODEL對5個物種GRF5蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測,發(fā)現(xiàn)結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)相符, 如圖1所示。同一類GRF在不同物種中具有相似的三級結(jié)構(gòu), 例如GRF5, 栽培二粒小麥GRF5蛋白三級結(jié)構(gòu)與其祖先物種擬斯卑爾脫山羊草和烏拉爾圖小麥的三級結(jié)構(gòu)存在部分相同, 另外在同號染色體上普通小麥與其祖先物種的GRF5蛋白三級結(jié)構(gòu)相似, 這表明栽培二粒小麥和普通小麥蛋白的三級結(jié)構(gòu)可能由其祖先物種進化而來。亞細胞定位預測表明(附表1), 5個物種的128個成員中有12個定位于葉綠體, 9個定位于線粒體, 2個定位于細胞液, 其他均定位于細胞核中。其中在定位于葉綠體或線粒體的21個成員中, 普通小麥有10個成員, 而其他每個物種只有2～4個成員, 這表明他們可能與葉綠體和線粒體的功能有關(guān), 并且隨著進化過程, 有更多的基因參與調(diào)控葉綠體或線粒體的功能。

2.3 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化分析

為分析GRF家族成員在不同物種間的進化關(guān)系,利用MEGA 11軟件和MrBayes v3.1采用鄰接法和貝葉斯方法對5個物種的128個GRF家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖2)?；诨虻慕Y(jié)構(gòu)功能與系統(tǒng)發(fā)育的拓撲結(jié)構(gòu)分析, 將GRF家族成員進一步劃分為5組(I～V), 每組成員分布不均勻, 其成員數(shù)量分別為34、27、21、21和25個。除粗山羊草中超過三分之一的GRF家族成員和擬斯卑爾脫山羊草中的1個家族成員分布在第I組外, 其他物種均勻分布在I～V組。利用貝葉斯方法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹中, 樹的分支長度表示進化距離, 從水平方向上分支的長度來看, 隨時間變化, 分支越長物種中的基因變化就越大。從圖中可以看出, III～V組的進化距離較長, 這些家族成員的進化時間較早。I和II組中存在15個家族成員進化較晚, 進化速率較慢。另外, 第III組的全部成員均位于6號和7號染色體上, 第V組的成員均位于2號和6號染色體上, 5個物種的GRF家族成員均沒有在3號染色體上分布, 表明分布在同一組的基因可能存在進化關(guān)系, 在進化樹II組中GRF3亞家族的進化距離存在比較遠的情況, 這可能是成員在進化的過程中發(fā)生了較大的遺傳變異,從而出現(xiàn)了2個分支; IV組中的GRF6亞家族與GRF3亞家族相同, 也出現(xiàn)了進化距離較大的2個分支; 其他的亞家族成員距離都比較近, 遺傳變異較小。同時通過分組發(fā)現(xiàn), 相同的亞家族成員在同一分支上, 幾個亞家族又在一組里, 例如II組中包含GRF3、GRF4和GRF5亞家族, 這3個亞家族成員的進化距離較近, 而與其他亞家族距離較遠。-()、-()和-() 3個成員之間屬于直系同源關(guān)系, 這些亞家族的成員隨著進化分支進入到不同的物種, 并保留了原有的序列信息。

2.4 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

通過對5個物種基因的染色體定位發(fā)現(xiàn), 5個物種在2號、4號和6號染色體上定位的基因較多, 分別含有28、24和35個成員, 在5號染色體上定位到的基因較少, 僅含有7個成員, 其中包含粗山羊草的3個家族成員和普通小麥的4個家族成員, 另外在3號染色體上沒有定位到基因(圖3)。66.4%基因的位置在進化的過程中較為保守,分別被定位在2號、4號和6號染色體上, 而在3號染色體上沒有被定位到基因, 表明基因在進化過程中出現(xiàn)分布不均的情況, 并且隨著小麥的進化被遺傳了下來。同時在小麥的3個亞基因組(A、B和D)中發(fā)現(xiàn), 在被鑒定到的亞家族中, A基因組有18個家族成員, 包含所有的GRF亞家族成員, B基因組有15個成員, 未鑒定到GRF5, D基因組有20個成員, 未鑒定到GRF9; 另外, GRF1、GRF4和GRF10亞家族成員只在6號的3個染色體組(6A、6B和6D)上各鑒定到1個, GRF11和GRF12只在2號的3個染色體組(2A、2B和2D)上各鑒定到1個。

圖2 小麥及其祖先物種GRF家族成員的系統(tǒng)進化樹

(圖3)

利用MEME進行Motif預測(圖4), 共鑒定出5個GRF蛋白基序(Motif1～Motif5), 長度分別在15～41個氨基酸之間。其中Motif1、2和3幾乎在第II～V組的每個蛋白中均被鑒定到, 分別鑒定到88、92和75個蛋白, 而Motif4在第II、III組大多數(shù)蛋白中被鑒定到, 分別鑒定到22個和20個蛋白, Motif5在第V組的25個蛋白中被鑒定到, 另外第I組全部34個蛋白均鑒定到Motif1, 25個蛋白鑒定到Motif3, 僅有4個蛋白鑒定到Motif4。由此發(fā)現(xiàn)各個亞家族都有其獨特的蛋白基序, 說明基因在進化過程中存在內(nèi)部分化。

依據(jù)基因組注釋文件, 獲得了5個物種基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。由圖4可知, 所有基因均具有完整的CDS, 并且所有成員均包含不同數(shù)量的外顯子和內(nèi)含子, 但在數(shù)量和位置上存在差異, 例如普通小麥基因()包含5個外顯子, 而栽培二粒小麥基因()只有1個外顯子, 表明不同成員之間可能存在功能的差異。另外不同基因存在保守的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu), 表明他們之間可能具有較近的進化關(guān)系。只有93個基因含有上下游調(diào)控區(qū) (UTR), 基因中UTR的缺失可能會影響基因的調(diào)控功能。而且在系統(tǒng)發(fā)育樹上距離較近的成員間基因結(jié)構(gòu)存在一定的保守性, 具有相同的外顯子和內(nèi)含子。

2.5 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族啟動子順式作用元件預測

基因的表達調(diào)控與其啟動子順式作用元件關(guān)系密切, 對5個物種基因的啟動子區(qū)段順式作用元件進行預測發(fā)現(xiàn)(圖5), 其上游2 kb區(qū)域的啟動子順式作用元件主要包括光響應元件Box 4、AE-box、ACE和Sp1, 逆境響應元件如參與低溫反應的LTR和參與干旱反應的MBS, 激素響應元件如赤霉素反應元件P-box和GARE-motif、脫落酸反應元件ABRE和茉莉酸反應元件CGTCA-motif, 以及其他與生長調(diào)控相關(guān)的元件如厭氧誘導必需元件ARE、生物及非生物脅迫響應元件as-1等。在5個物種的全部128個家族成員中,()含有最少的啟動子元件結(jié)合位點, 僅含1個(Sp1), 而()含有最多的啟動子元件結(jié)合位點, 含有24個?；蛴休^多的關(guān)于赤霉素、生長素以及參與干旱脅迫的反應元件結(jié)合位點, 并且相同基因類別具有極其相似的元件結(jié)合位點, 這說明在不同物種中同類別基因可能參與調(diào)控相同的逆境反應, 但又存在一些差別, 表明在進化過程中基因的調(diào)控模式被遺傳了下來,基因的功能較為保守, 但由于時間的推移, 在進化過程中可能有環(huán)境等因素的差異, 導致其調(diào)控模式并不完全相同, 例如在GRF2亞家族中, 只有擬斯卑爾脫山羊草中存在AE-box啟動子順式作用元件, 這可能由于在進化中該元件并未遺傳下來, 而ACE、ARE、as-1和MBS元件在5個物種中都存在, 證明GRF2家族成員的這些功能在進化過程中得到了很好的保留。

圖4 小麥及其祖先物種GRF基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

圖5 小麥及其祖先物種GRF基因啟動子順式作用元件

2.6 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族共線性分析

為明確基因在不同物種間的擴展規(guī)律, 通過MCScanX對基因家族進行共線性分析(圖6), 結(jié)果顯示了5個物種中分別存在618、4449、1668、24,996、76,238個共線性區(qū)域(包含UN染色體), 這些區(qū)域是通過片段復制而來, 同時也表明在進化過程中所出現(xiàn)的多倍體化的特點, 5個物種中分別有2、3、3、20和65個基因定位在共線性區(qū)域內(nèi), 這些片段復制是在進化過程中基因家族擴張的主要途徑。圖中最外一圈表示這5個物種中的基因密度普遍較大, 而圖中的最內(nèi)圈表示染色體未知堿基的分布, 在烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾脫山羊草和粗山羊草的染色體上存在較多的未知堿基, 這與中間環(huán)帶中線的波動相印證。并且同一GRF家族的不同亞基因組成員之間都存在著染色體共線性, 且不同亞基因組的基因在進化樹上距離較近, 并聚類在同一分支中, 它們來源于同一物種中的染色體片段復制, 屬于旁系同源基因?qū)? 例如GRF12亞家族在不同亞基因組的成員()、()和()之間都存在著共線性, 且分布在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支上。

隨物種進化方向, 分別對烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾脫山羊草與栽培二粒小麥以及栽培二粒小麥、粗山羊草與普通小麥進行基因組共線性分析(圖7), 并且對共線性的基因進行選擇壓力分析(附表3)。發(fā)現(xiàn)分別有18個和29個基因與和具有共線性, 分別有36個和37個基因與和具有共線性。不同物種間的共線性表明這些成員在物種間的進化過程中得到了保留與復制。同時這些基因的片段復制使得普通小麥中具有了更豐富的家族成員, 也使得小麥中GRF家族的功能更加豐富, 有利于植物自身的生長。另外發(fā)現(xiàn)有1個基因?qū)/s比率大于1, 認為基因在進化過程中受到正選擇效應, 可加速基因進化; 其他基因的a/s比率均小于1, 認為基因經(jīng)過了純化選擇, 而且受到正向選擇的成員其蛋白質(zhì)可能已經(jīng)在進化中發(fā)生了改變。

圖6 小麥及其祖先物種GRF基因的染色體位置及共線性關(guān)系

所有共線性區(qū)域和基因由灰線連接, 紅線表示基因的片段重復基因?qū)Α?/p>

All syntenic blocks and genes are linked by the grey lines, and red lines represent the fragment-repeat gene pair of thegenes.

2.7 小麥及其祖先物種GRF轉(zhuǎn)錄因子家族表達模式分析

為研究基因在5個物種中對不同外源激素和非生物脅迫的響應, 采用RT-qPCR的方法分析了16個基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達模式。由圖9可知, 在4種激素處理下基因表達量在不同物種間呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。在外源IAA處理下, 基因-、和表達量顯著上調(diào), 其中這3個基因表達量分別較CK上調(diào)0.7、1.5和6.9倍, 烏拉爾圖小麥、普通小麥和栽培二粒小麥-較CK顯著下調(diào)。在外源ABA處理下, 普通小麥、和以及栽培二粒小麥、和表達量顯著上調(diào), 較CK分別上調(diào)13.2、5.7和7.5倍以及14.5、29.0和1.7倍, 發(fā)現(xiàn)普通小麥和栽培二粒小麥基因?qū)τ贏BA激素的響應較為強烈。而、、、和這5個基因表達量則顯著下調(diào)。根據(jù)啟動子順式作用元件分析, 在上調(diào)和下調(diào)的基因中均發(fā)現(xiàn)有關(guān)于ABA誘導的ABRE作用元件, 猜測這可能與基因的功能不同有關(guān)。在外源GA處理下,中除、和表達量略有降低外, 其他基因均呈不同程度的上調(diào)表達, 其中上調(diào)倍數(shù)最大的前3個基因分別是、和, 分別上調(diào)15.7、5.6和4.1倍, 而中除、和外, 其他基因均呈不同程度的下調(diào)表達, 其中下調(diào)倍數(shù)最大的前3個基因分別是、和,分別下調(diào)1.0、1.0和0.8倍。根據(jù)啟動子順式作用元件分析, 上調(diào)的基因中有P-box和GARE兩個GA響應元件, 而下調(diào)基因中沒有發(fā)現(xiàn)。在外源ZT處理下,、、、、和表達量均呈顯著上調(diào)變化, 其中上調(diào)最為明顯, 其表達量較CK上調(diào)8.3倍(圖8)。

在逆境脅迫條件下(圖9), 從整體上看16個基因?qū)τ诟珊得{迫均有不同的表達趨勢, 其中栽培二粒小麥和上調(diào)最為顯著, 其表達量較CK上調(diào)7.0倍和1.2倍, 發(fā)現(xiàn)其中都包含有MBS啟動子順式作用元件, 這可能是導致表達量上調(diào)的主要因素。在鹽脅迫條件下, 基因、、、和呈現(xiàn)出上調(diào)的表達趨勢, 其余均有不同程度的下調(diào)表達趨勢, 其中普通小麥下調(diào)最為顯著, 其表達量較CK下調(diào)0.7倍。在高溫脅迫下, 除、、和的表達量略有上調(diào)外, 其余均有不同程度的下調(diào), 其中下調(diào)最為顯著, 其表達量較CK下調(diào)0.9倍。在低溫脅迫下, 整體上16個基因呈現(xiàn)出上調(diào)的表達規(guī)律, 其中上調(diào)倍數(shù)最大的前3個基因分別是、和, 分別上調(diào)10.9、4.6和3.6倍, 下調(diào)倍數(shù)最大的前3個基因分別是、和, 分別下調(diào)0.9、0.5和0.4倍。在這些基因中都含有LTR順式作用元件, 因此表達量下調(diào)不顯著可能與其有關(guān)。這些基因在不同的物種中表達趨勢存在一定的區(qū)別, 這可能是與其在不同物種中表達模式不同有關(guān)。

圖8 16個GRF基因?qū)ν庠醇に仨憫谋磉_模式分析

*表示處理間存在顯著差異(< 0.05)。

* indicates significant differences between the stress conditions and the control condition at< 0.05.

圖9 16個GRF基因?qū)Νh(huán)境脅迫響應的表達模式分析

*表示處理間存在顯著差異(< 0.05)。

* indicates significant differences between the stress conditions and the control condition at< 0.05.

3 討論

GRF轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物器官發(fā)育、逆境響應、花期和產(chǎn)量等多個生物學過程。目前, GRF轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)在擬南芥[7]、水稻[9]、番茄[36]、大豆[37]、谷子[38]等作物中開展了大量的研究。作為一種植物特有的轉(zhuǎn)錄因子, GRF在植物生長發(fā)育中起著重要調(diào)控作用。研究表明GRF可以通過維持或者促進細胞分裂能力來促進植物器官的生長[39]。到目前為止, 在低等植物苔蘚中僅鑒定到GRF家族成員2個, 在高等植物的單子葉物種中, 鑒定到GRF家族成員的數(shù)量為8 (大麥)～19 (香蕉)個; 且通常表現(xiàn)為雙子葉植物GRF家族成員的數(shù)目大于單子葉植物,而多倍體也通常大于二倍體[40]。在本研究中, 通過搜索本地基因庫數(shù)據(jù), 在小麥及其祖先物種中共鑒定出GRF家族成員128個, 其中分別在烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾脫山羊草、粗山羊草、栽培二粒小麥和普通小麥中鑒定出15、12、19、29和53個基因, 并通過研究發(fā)現(xiàn)GRF家族成員的數(shù)量在進化過程中隨著多倍化出現(xiàn)了擴增的趨勢。四倍體栽培二粒小麥GRF家族成員的數(shù)量與其祖先物種二倍體烏拉爾圖小麥和擬斯卑爾脫山羊草的數(shù)量之和大致相同, 六倍體小麥家族成員數(shù)量比其祖先物種栽培二粒小麥和粗山羊草的數(shù)量之和多5個, 推測這種GRF成員數(shù)量的變化可能與增強生物體對復雜環(huán)境的適應性有關(guān)?；驍?shù)量的變化往往和基因進化相關(guān)聯(lián), 而基因結(jié)構(gòu)的異同也與其進化密不可分。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu), GRF家族成員被分為5組(I～V), 5個分組分別有34、27、21、21和25個成員, 通過比較不同物種在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置, 發(fā)現(xiàn)具有高度同源性和相似結(jié)構(gòu)的基因家族成員通常聚在一組, 這表明在同一分支上的家族成員可能具有相似的基因功能。另外發(fā)現(xiàn)GRF家族成員大多數(shù)分布在2號、6號和7號染色體上, 其余染色體上分布較少, 說明GRF在進化過程中出現(xiàn)了分布不均勻的情況, 并且被遺傳了下來。此外, 基于MEME分析, 各個組間的蛋白基序差異較大, 而同一分組不同分支的基因具有相似的蛋白基序, 并且?guī)缀跛谢蚨艰b定到了Motif1。說明GRF在進化過程中存在內(nèi)部分化, 基因之間可能存在功能的差異。這與在藜麥中GRF家族成員鑒定到的結(jié)果相似[39]。相同功能的基因往往存在相同的結(jié)構(gòu), 這也可能是進化與遺傳的結(jié)果, 而進化與遺傳也與他們之間的共線性關(guān)系聯(lián)系密切。

通過物種內(nèi)的共線性分析發(fā)現(xiàn), 在小麥及其祖先物種中都存在片段復制, 但是串聯(lián)復制較少, 推測這5個物種主要是通過片段復制來擴展家族成員的。同時, 烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾脫山羊草和粗山羊草中上述兩種復制事件都相對較少, 這與其基因組大小也有密切的聯(lián)系。栽培二粒小麥和普通小麥中存在較多的重復事件, 也是這兩個物種在進化中GRF家族成員擴張的主要原因。小麥在進化的過程中有很多的祖先基因被保留了下來, 通過種間的同源共線性基因分析發(fā)現(xiàn), 烏拉爾圖小麥和擬斯卑爾脫山羊草中的通過片段復制以加倍的方式遺傳到了栽培二粒小麥中, 從而造成了栽培二粒小麥中GRF家族成員的擴增, 并且栽培二粒小麥和粗山羊草中的也通過片段復制以加倍的方式遺傳到了普通小麥中, 這可能是小麥在進化過程中發(fā)生了基因組多倍化現(xiàn)象[41], 前人研究表明, 普通小麥由3個不同的二倍體物種經(jīng)過兩輪異源多倍化過程形成, 這使普通小麥在其適應性方面得到了極大的改善[42]。同時, 在物種間基因的遺傳復制大多是直接在自身染色體組上進行, 也有少部分基因出現(xiàn)了不同染色體亞組間的復制, 這可能也是基因進化的一種表現(xiàn)[43]。另外, 除了()和()基因?qū)Φ腶/s比率大于1, 其他基因?qū)Φ腶/s比率均小于1, 這說明在大多數(shù)情況下基因在進化過程中是相對保守的, 進化相對較慢。基于比較基因組分析, 雖然不同物種的基因組數(shù)量和染色體大小均不同, 但在數(shù)百萬年的進化過程中, 相關(guān)物種的基因順序仍然高度保守。通過比較5個物種的基因組序列, 發(fā)現(xiàn)在早期進化過程中存在一個或多個大規(guī)?；蚪M重復事件, 這些重復事件以及進化過程中的多倍化事件都將顯著影響基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達特性。

啟動子區(qū)域的順式作用元件通過對細胞內(nèi)外不同信號的響應來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄, 從而調(diào)控植物的生長發(fā)育等過程[44]。研究發(fā)現(xiàn), MBS、Sp1和AE-box等順式作用元件在玉米中參與干旱及低溫脅迫的誘導[45], ABRE順式調(diào)控元件在水稻中則受到干旱和脫落酸的誘導[46]。本研究發(fā)現(xiàn), 小麥及其祖先物種GRF家族成員的啟動子區(qū)域含有多種順式作用元件,主要包括MBS、ABRE和LTR等響應逆境脅迫的元件以及P-box和TGA-box等參與IAA和GA誘導的元件, 表明它們在逆境和激素信號通路中可能發(fā)揮著重要作用。前人研究表明, GRF通過參與GA信號通路調(diào)節(jié)了水稻莖稈的伸長生長[6], 并在小麥干旱脅迫下表現(xiàn)出強烈的反應[12]。本研究通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn), 在16個基因中, 有12個基因在高溫脅迫誘導下呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢, 這與前人研究結(jié)果一致, 推測可能是由于高溫對于小麥及其祖先生長的影響較大, 導致在植物中的表達下降; 值得注意的是, 外源GA使普通小麥和栽培二粒小麥的呈顯著上調(diào)表達趨勢, 這與在二穗短柄草[40]和水稻[47]中的結(jié)果相似, 表明基因參與植物的生長發(fā)育以及對逆境脅迫響應的調(diào)控模式是保守的。然而, 有關(guān)GRF在小麥及其祖先物種中的功能仍然需要進一步的研究。

4 結(jié)論

本研究在小麥及其祖先物種中共鑒定到128個GRF家族成員, 基于該基因的結(jié)構(gòu)功能與系統(tǒng)發(fā)育的拓撲結(jié)構(gòu)將其分為5組, 其中較多基因被定位在6號染色體上, 表明6號染色體上的家族成員在進化的過程中位置較為保守。GRF家族成員的內(nèi)含子數(shù)為1～5個且都有完整的基因結(jié)構(gòu), 另外不同的基因含有不同的啟動子, 這與基因功能有主要的關(guān)系。在5個物種之間都存在著共線性區(qū)域, 但不是都存在著基因的串聯(lián)復制。5個物種中GRF家族成員的表達特性存在特異性, 但大多數(shù)與赤霉素誘導有關(guān), 且對于干旱脅迫的響應較為明顯, 而且對于其他的激素和逆境脅迫也有不同程度的響應, GRF在5個物種的進化中較保守, 起到的功能較相似。

附表 請見網(wǎng)絡版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

[1] Feng K, Hou X L, Xing G M, Liu J X, Duan A Q, Xu Z S, Li M Y, Zhuang J, Xiong A S. Advances in AP2/ERF super-family transcription factors in plant., 2020, 40: 750–776.

[2] Claus S, Michael B. The regulation of transcription factor activity in plants., 1998, 3: 378–383.

[3] Karam B S, Rhonda C F, Luis O. Transcription factors in plant defense and stress responses., 2002, 5: 430–436.

[4] Du W X, Yang J F, Li Q, Su Q, Yi D X, Pang Y Z. Genome-wide identification and characterization of growth regulatory factor family genes in., 2022, 23: 6905.

[5] Wang F D, Qiu N W, Ding Q, Li J J, Zhang Y H, Li H Y, Gao J W. Genome-wide identification and analysis of the growth-regula-ting factor family in Chinese cabbage (L. ssp)., 2014, 15: 807.

[6] van der Knaap, Kim J H, Kende H. A novel gibberellin-induced gene from rice and its potential regulatory role in stem growth., 2000, 122: 695–704.

[7] Kim J H, Choi D, Kende H. Thefamily of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in., 2003, 36: 94–104.

[8] Zhang D F, Li B, Jia G Q, Zhang T F, Dai J R, Li J S, Wang S C. Isolation and characterization of genes encoding GRF transcription factors and GIF transcriptional coactivators in maize (L.)., 2008, 175: 809–817.

[9] Choi D, Kim J H, Kende H. Whole genome analysis of thegene family encoding plant-specific putative transcription activators in rice (L.)., 2004, 45: 897–904.

[10] Huang W D, He Y Q, Yang L, Lu C, Zhu Y X, Sun C, Ma D F, Yin J L. Genome-wide analysis of growth-regulating factors (GRFs) in., 2021, 9: e10701.

[11] Yi W, Luan A P, Liu C Y, Wu J, Zhang W, Zhong Z Q, Wang Z P, Yang M Z, Chen C J, He Y H. Genome-wide identification, phylogeny, and expression analysis of GRF transcription factors in pineapple ()., 2023, 14: 1159223.

[12] Zan T, Zhang L, Xie T T, Li L Q. Genome-Wide identification and analysis of the growth-regulating factor () gene family and GRF-Interacting factor family inL., 2020, 58: 1–20.

[13] Kim J H, Kende H. A transcriptional coactivator,, is involved in regulating leaf growth and morphology in., 2004, 101: 13374–13379.

[14] Kim J H. Biological roles and an evolutionary sketch of the GRF-GIF transcriptional complex in plants., 2019, 52: 227–238.

[15] Liang G, He H, Li Y, Wang F, Yu D Q. Molecular mechanism of microRNA396 mediating pistil development in., 2014, 164: 249–258.

[16] Liu X, Guo L X, Jin L F, Liu Y Z, Liu T, Fan Y H, Peng S A. Identification and transcript profiles of citrus growth-regulating factor genes involved in the regulation of leaf and fruit development., 2016, 43: 1059–1067.

[17] Kuijt S J H, Greco R, Agalou A, Shao J, Hoen C C J, Overn?s E, Osnato M, Curiale S, Meynard D, van Gulik R, de Faria M S, Atallah M, de Kam R J, Lamers G E M, Guiderdoni E, Rossini L, Meijer A H, Ouwerkerk P B F. Interaction between the growth-regulating factor and knotted1-like homeobox families of transcription factors., 2014, 164: 1952–1966.

[18] Li S C, Gao F Y, Xie K L, Zeng X H, Cao Y, Zeng J, He Z S, Ren Y, Li W B, Deng Q M, Wang S Q, Zheng A P, Zhu J, Liu H N, Wang L X, Li P. The OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1 regulatory module determines grain size and yield in rice., 2016, 14: 2134–2146.

[19] Wang P, Xiao Y, Yan M, Yan Y, Lei X J, Di P, Wang Y P. Whole- genome identification and expression profiling of growth- regulating factor () and GRF-interacting factor () gene families in Panax ginseng., 2023, 24: 334.

[20] Zhang S W, Li G G, Wang Y D, Anwar A, He B, Zhang J W, Chen C M, Hao Y W, Chen R Y, Song S W. Genome-wide identification ofgenes in flowering Chinese cabbage and preliminary functional analysis ofin nitrogen metabolism., 2023, 14: 1144748.

[21] Yarra R, Krysan P J. GRF-GIF duo and GRF-GIF-BBM: novel transformation methodologies for enhancing regeneration efficiency of genome-edited recalcitrant crops., 2023, 257: 60.

[22] Liu Y T, Guo P, Wang J, Xu Z Y. Growth-regulating factors: conserved and divergent roles in plant growth and development and potential value for crop improvement., 2022, 113: 1122–1145.

[23] Daniela L, Javier F P. MicroRNA miR396, GRF transcription factors and GIF co-regulators: a conserved plant growth regulatory module with potential for breeding and biotechnology., 2020, 53: 31–42.

[24] Montenegro J D, Golicz A A, Bayer P E, Hurgobin B, Lee H, Chan C K, Visendi P, Lai K, Dole?el J, Batley J, Edwards D. The pangenome of hexaploid bread wheat., 2017, 90: 1007–1013.

[25] Etienne P, Pierre S, Jér?me S, Cyrille S, Frédéric C, Philippe L, Abraham K, Monika M, Shahryar K, Wolfgang S, Evans L, Daryl S, Andrzej K, Michael A, Sonia V, Hélène B, Kellye E, Rudi A, Jan S, Hana S, Jaroslav D, Michel B, Catherine F. A physical map of the 1-Gigabase bread wheat chromosome 3B., 2008, 322: 101–104.

[26] Zhang M, Qiu X B. Genetic basis of genome size variation of wheat., 2023, 23: 285–285.

[27] El B M, Murat F, Veyssiere M, Molinier M, Flores R, Burlot L, Alaux M, Quesneville H, Pont C, Salse J. Reconciling the evolutionary origin of bread wheat ()., 2017, 213: 1477–1486.

[28] 魏益民. 中國小麥的起源、傳播及進化. 麥類作物學報, 2021, 41: 305–309. Wei Y M. Origin, spread and evolution of wheat in China., 2021, 41: 305–309 (in Chinese with English abstract).

[29] Chen F, Yang Y Z, Luo X F, Zhou W G, Dai Y J, Zheng C, Liu W G, Yang W Y, Shu K. Genome-wide identification of GRF transcription factors in soybean and expression analysis offamily under shade stress., 2019, 19: 1–13.

[30] Chen H L, Ge W N. Identification, molecular characteristics, and evolution ofgene family in foxtail millet (L.)., 2022, 12: 727674.

[31] Tamura K, Stecher G, Kumar S. MEGA11: molecular evolutionary genetics analysis version 11., 2021, 38: 3022–3027.

[32] Chen C J, Chen H, Zhang Y, Thomas H R, Margaret H F, He Y H, Xia R. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data., 2020, 13: 1194–1202.

[33] Li C, Li Q G, Dunwell J M, Zhang Y M. Divergent evolutionary pattern of starch biosynthetic pathway genes in grasses and dicots., 2012, 29: 3227–3236.

[34] Timothy L B, Charles E. Fitting a Mixture Model by Expectation Maximization to Discover Motifs in Biopolymers. Menlo Park, California: AAAI Press, 1994. pp 28–36.

[35] Wang YP,Tang HB,Debarry JD, Tan X, Li JP, Wang XY, Lee TH, Jin HZ, Marler B, Guo H, Kissinger JC, Paterson AH. MCScanX: a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity., 2012, 40: e49.

[36] Khadiza K, Arif H K R, Park J, Ujjal K N, Chang K K, Ki-Byung L, Ill S N, Mi-Young C, Hikmet B. Molecular characterization and expression profiling of tomato GRF transcription factor family genes in response to abiotic stresses and phytohormones., 2017, 18: 1056.

[37] Noon J B, Hewezi T, Baum T J. Homeostasis in the soybean miRNA396-GRF network is essential for productive soybean cyst nematode infections., 2019, 70: 1653–1668.

[38] 張立全, 張浩林, 李叢叢, 姚磊, 魏建華, 張杰偉. 谷子GRF基因家族鑒定與分析. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2021, 34: 2340–2347.Zhang L Q, Zhang H L, Li C C, Yao L, Wei J H, Zhang J W. Genome-wide analysis and identification of GRF gene family in foxtail millet ()., 2021, 34: 2340–2347 (in Chinese with English abstract).

[39] 時丕彪, 何冰, 費月躍, 王軍, 王偉義, 魏福友, 呂遠大, 顧閩峰. 藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及表達分析. 作物學報, 2019, 45: 1841–1850. Shi P B, He B, Fei Y Y, Wang J, Wang W Y, Wei F Y, Lyu Y D, Gu M F. Identification and expression analysis of GRF transcription factor family of., 2019, 45: 1841–1850 (in Chinese with English abstract).

[40] 馬超, 宋鵬, 尚申申, 楊夏夏, 楊金華, 韓群威, 李記民, 馮雅嵐. 二穗短柄草GRFs基因家族的鑒定及表達模式分析. 核農(nóng)學報, 2020, 34: 1152–1162. Ma C, Song P, Shang S S, Yang X X, Yang J H, Han Q W, Li J M, Feng Y L. Whole genome identification and analysis of GRFs gene family in., 2020, 34: 1152–1162 (in Chinese with English abstract).

[41] Jiao Y N, Wickett N J, Ayyampalayam S, Chanderbali A S, Landherr L, Ralph P E, Tomsho L P, Hu Y, Liang H Y, Soltis P S, Soltis D E, Clifton S W, Schlarbaum S E, Schuster S C, Ma H, Leebens-Mack J, de Pamphilis C W. Ancestral polyploidy in seed plants and angiosperms., 2011, 473: 97–100.

[42] 趙旭博, 李愛麗, 毛龍. 植物多倍化過程中小分子RNA調(diào)控基因表達機制研究進展. 作物學報, 2013, 39: 1331–1338. Zhao X B, Li A L, Mao L. Progress on gene regulatory mechanisms by small RNAs during plant poly-ploidization., 2013, 39: 1331–1338 (in Chinese with English abstract).

[43] Panchy N, Lehti-Shiu M, Shiu S H. Evolution of gene duplication in plants., 2016, 171: 2294–2316.

[44] Kong F L, Wang J, Cheng L, Liu S Y, Wu J, Peng Z, Lu G. Genome-wide analysis of the mitogen-activated protein kinase gene family in., 2012, 499: 108–120.

[45] Tao Y, Wang F T, Jia D M, Li J T, Zhang Y M, Jia C G, Wang D P, Pan H Y. Cloning and functional analysis of the promoter of a stress-inducible gene () in maize., 2015, 33: 200–208.

[46] Lee S C, Kim S H, Kim S R. Drought induciblepromoter is activated by OsDREB1A and OsDREB1D., 2013, 56: 115–121.

[47] Lee S J, Lee B H, Jung J H, Park S K, Song J T, Kim J H. Growth- regulating factor and GRF-interacting factor specify meristematic cells of gynoecia and anthers., 2018, 176: 717–729.

Whole genome identification and analysis of GRFs transcription factor family in wheat and its ancestral species

WANG Tian-Ning1, FENG Ya-Lan2, JU Ji-Hao1, WU Yi1, ZHANG Jun1, and MA Chao1,*

1Henan University of Science and Technology, Agronomy College, Luoyang 471000, Henan, China;2Wuchang University of Technology, College of Life Science, Wuhan 430223, Hubei, China

Growth-regulating factors (GRFs) play important roles in plant growth, stress response, and hormone signal transduction. Systematic analysis of the distribution, structure, evolution, and expression characteristics of the GRF transcription factor family members in the genome of wheat and its ancestral species is of great significance for in-depth research on the biological functions of GRF family and the evolution of wheat. In this study, bioinformatics methods were used to identify the whole genome of GRF members from five species (,,,, and), and their physical and chemical properties, phylogenetic relationships, gene structure, promoter-regulatory element, and expression characteristics were also analyzed. The results showed that there were 15, 12, 19, 29, and 53 GRF members in,,,, and, respectively. Through interspecific colinearity analysis, we found that 18 and 29 members ofwere colinear withand, and 36 and 37 members ofwere colinear withand, respectively. The prediction of promoter-regulatory element found thatgene had basic transcription elements and some binding elements with growth, development, and stress response. RT-qPCR analysis revealed that mostgenes up-regulated under exogenous IAA, GA, and drought stress, but down-regulated under high temperature stress, indicating that members of the GRF family exerted a crucial influence in hormone response and stress. Phylogenetic analysis evidenced that there was a conserved and complex evolutionary relationship between the GRF members of wheat and its ancestral species. The above results provide a theoretical basis for the evolution and functional research of the GRF transcription factor family.

wheat; ancestral species; GRF; bioinformatics; phylogenetic analysis

10.3724/SP.J.1006.2024.31046

本研究由國家自然科學基金項目(32372227), 河南省自然科學基金項目(222300420430)和河南省高等學校青年骨干教師培養(yǎng)計劃 (2021GGJS050)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32372227), the National Natural Science Foundation of Henan Province (222300420430), and the Training Program for University Young Key Teachers in Henan Province (2021GGJS050).

馬超, E-mail: machao840508@163.com

E-mail: haust6626wtn@163.com

2023-08-04;

2023-10-23;

2023-11-10.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231108.1632.004

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