徐 鵬,林明偉,董功航,張建興,郝 俊
1.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽外科,廣東 深圳 518104;2.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院體檢科,廣東 深圳 518104;3.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院甲狀腺乳腺外科,廣東 深圳 518104;4.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胃腸外科,廣東 深圳 518104
胰腺癌占全部惡性腫瘤的1%~2%,早期難以發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)時多已屬于晚期。轉(zhuǎn)移率高,手術(shù)率低,僅10%~20%的患者能做根治手術(shù),術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)80%以上。死亡率高,1 年生存率不到10%,5 年生存率低于4%,晚期胰腺癌中位生存期僅為3 個月左右[1]。胰腺癌侵犯周圍臟器或脫落的癌細(xì)胞種植于腹膜,這是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源,治療上不僅要清除病灶及可能受侵的淋巴結(jié),還應(yīng)完全殺滅脫落的癌細(xì)胞。持續(xù)腹腔熱灌注化療(HIPEC)是一種用于腫瘤的溫?zé)峄煼桨福浅浞只旌匣熕幬锱c熱灌注液后在恒溫狀態(tài)下持續(xù)循環(huán)地直接灌注到腹腔內(nèi),綜合機(jī)械灌洗、化療、熱療等作用,持續(xù)一段時間后直接消除腫瘤患者在惡性腫瘤根治術(shù)后腹腔中殘留的癌性病灶,或者局部殺滅腹腔中已轉(zhuǎn)移的癌性病灶[2]。研究[3-4]表明,在惡性腫瘤根治術(shù)中實施HIPEC 化療可在極大程度上降低腹腔、盆腔中腫瘤的播散率,提升患者的總生存率。為提升HIPEC 化療在腫瘤臨床中的使用價值,需對其在腫瘤具體治療中加強(qiáng)研究,如探索在腹腔內(nèi)溫?zé)峄熤杏行Ь植考訜岬膯栴},以求局部溫?zé)峄煾吆侠硇?、安全性。本研究建立HIPEC 化療對胰腺癌細(xì)胞體外作用模型,探究5-FU HIPEC 化療下促進(jìn)胰腺腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,并探尋HIPEC 在胰腺癌Panc-1 細(xì)胞株凋亡過程中所發(fā)揮抗癌細(xì)胞協(xié)同作用的機(jī)制與熱療的最佳溫度,為胰腺癌化療提供依據(jù),現(xiàn)報告如下。
本研究采用的人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1來源于中山醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的分子生物學(xué)實驗室。5-氟尿嘧啶(5-FU)與二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司,DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素與鏈霉素購自美國Gibco公司,Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司。器械包括臺式高速離心機(jī)(型號TGL16G)、生物潔凈工作臺(型號BCM-1OOOA 型)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號BNA-311 型)、雪花制冰機(jī)(產(chǎn)自日本三洋公司,型號SIM-F124)、超純水制造系統(tǒng)(型號Mi1i-Q)、流式細(xì)胞儀(型號Epics-XL2型)、微量加樣器(產(chǎn)自德國Eppendorf公司)。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 在無菌培養(yǎng)瓶接種人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1,后加入含有100 mg/mL 鏈霉素、100 μ/mL 青霉素、10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液,之后將其放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱,提前設(shè)置培養(yǎng)溫度為恒溫37 ℃、相對濕度為95%、CO2濃度為5%,培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)48 h,達(dá)到對數(shù)生長期。使用濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化,3 min后終止反應(yīng),行吹打操作,將其制備成單細(xì)胞懸液,每毫升準(zhǔn)確計數(shù),其中細(xì)胞濃度為1×105個/mL,備用[5]。
1.2.2 5-FU 工作濃度的設(shè)定 5-FU 工作濃度使用既往實驗結(jié)果,濃度為500 μg/mL。
1.2.3 實驗分組 本次共劃分為4 組,即空白對照組、化療組、熱療組、溫?zé)峄熃M。通過嵌套式的設(shè)計,設(shè)置每組的處理方式??瞻讓φ战M以37 ℃處理,但不使用5-FU化療藥,化療組使用5-FU 處置,藥物濃度為500 μg/mL,熱療組則使用不同溫度進(jìn)行溫?zé)崽幹?,而溫?zé)峄熃M既使用5-FU處置,濃度500 μg/mL,又使用不同溫度進(jìn)行溫?zé)崽幹?。其中,熱療組與溫?zé)峄熃M不同溫度均為40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃。
1.2.4 實驗各組處理方法 在6 孔無菌培養(yǎng)板中接種Panc-1細(xì)胞,達(dá)到對數(shù)生長期后,在培養(yǎng)板上設(shè)立空白對照組、實驗組,其中3 孔作為一個平行樣本。在進(jìn)行實驗前將原有的培養(yǎng)基除去,據(jù)實際情況分組,并實施相對應(yīng)的處置方案。不同組別處置方式不同。(1)空白對照組:將2 mL 培養(yǎng)液加入至每個培養(yǎng)孔中,并使用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,其中37 ℃為生理溫度。(2)化療組:每個培養(yǎng)孔中加入2 mL 含5-FU 培養(yǎng)液,其中化療藥濃度500 μg/mL,后放置在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。Panc-1 細(xì)胞與5-FU 的接觸時間是24 h。(3)熱療組:每個培養(yǎng)孔中加入2 mL 培養(yǎng)液,之后分別放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件為相對濕度95%、CO2濃度5%,而溫度為40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃(由CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行溫控調(diào)節(jié),且允許有±0.1 ℃的誤差),均孵育60 min。熱療完畢后,將其繼續(xù)放置在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)23 h。(4)溫?zé)峄熃M:每個培養(yǎng)孔中加入2 mL 含5-FU 培養(yǎng)液,其中,化療藥濃度500 μg/mL,即刻將其分別放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件為相對濕度95%、CO2濃度5%,而溫度為40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃,均孵育60 min。熱療完畢后,將其繼續(xù)放置在培養(yǎng)體系中培養(yǎng)23 h。
(1)細(xì)胞凋亡率檢測。處置完畢后,4 組的細(xì)胞均使用Annexin V/PI 雙標(biāo)記法及配套細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行檢測。判斷標(biāo)準(zhǔn):流式細(xì)胞術(shù)所測得的散點(diǎn)圖中,右上的第一象限為晚期壞死細(xì)胞與凋亡細(xì)胞,表示(++);左上的第二象限為死亡細(xì)胞,表示(—+);左下的第三象限為活細(xì)胞,表示(——);右下的第四象限為早期凋亡細(xì)胞,表示(+—)。胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1 細(xì)胞凋亡率取第一象限與第四象限檢測到的凋亡率之和。上述實驗組均為3 個復(fù)孔,細(xì)胞凋亡率的最終結(jié)果是3 個復(fù)孔的平均值。(2)熱療和化療聯(lián)合作用的觀察。選取熱療組、化療組與溫?zé)峄熃M,按照Veleriote 法對熱療聯(lián)合化療的相互作用進(jìn)行判定。其中,[C]=[E]為相加作用,[C]>[E]為協(xié)同作用,[D]>[C]>[H]為干擾作用,[E]>[C]>[D]或者[E]>[C]>[H]為次加作用。上述符號釋義:熱療組細(xì)胞凋亡率為[H],化療組細(xì)胞凋亡率為[D],溫?zé)峄熃M細(xì)胞凋亡率為[C],熱療與化療聯(lián)合預(yù)估細(xì)胞凋亡率為[E]。計算公式為[E]=[H]+[D]-[H]×[D][6]。
采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t 檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比(%)表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
5-FU 促胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1 細(xì)胞凋亡時,對溫度有較強(qiáng)的依賴性,在溫度為40~45 ℃時,促凋亡作用會伴隨溫度升高而增強(qiáng)。促凋亡作用在溫度為43~45 ℃時驟然增強(qiáng),且在溫度為45 ℃時,促凋亡作用達(dá)到最大。在溫度為43~45 ℃時,溫?zé)峄熃M相比于化療組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);在溫度為40~42 ℃時,溫?zé)峄熃M相比于化療組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1、圖1~4。
圖1 對照組(37 ℃)凋亡流式細(xì)胞散點(diǎn)圖
圖2 5-FU化療組(500 μg/mL)凋亡流式細(xì)胞散點(diǎn)圖
圖3 溫?zé)峤M(45 ℃)凋亡流式細(xì)胞散點(diǎn)圖
圖4 溫?zé)峄熃M(43 ℃、500 μg/mL)凋亡流式細(xì)胞散點(diǎn)圖
表1 溫?zé)峄煂θ艘认侔㏄anc-1細(xì)胞的促凋亡作用(±s)
表1 溫?zé)峄煂θ艘认侔㏄anc-1細(xì)胞的促凋亡作用(±s)
注:P1值為溫?zé)峄熃M與熱療組相比較,P2值為溫?zé)峄熃M與化療組相比較。
組別化療組溫?zé)峄熃MP2值37 ℃0 13.6±0.52 40 ℃0.50±0.32 16.54±0.67>0.05 41 ℃0.54±0.32 16.67±1.18>0.05 42 ℃0.82±0.14 17.83±1.26>0.05 43 ℃2.10±0.33 20.12±0.32<0.05 44 ℃5.07±0.32 23.34±1.31<0.05 45 ℃13.52±0.40 28.10±2.67<0.05 P1值<0.05
溫?zé)峄熃M人胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡率大于預(yù)估凋亡率,溫?zé)峄煶蕝f(xié)同作用,見表2。
表2 促人胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡率情況 %
目前,胰腺癌化療、放療是臨床除去手術(shù)之外療效顯著的兩大手段。有研究[7]表明,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是化療藥遏制癌癥病灶生長的作用機(jī)制之一,但誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡與否已成為抑制癌生長能力判斷的重要指標(biāo)。胰腺癌化療的常用藥物5-FU 可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制。HIPEC 結(jié)合溫?zé)岑煼ㄅc腹腔化療的優(yōu)勢,在治療胰腺癌及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面療效獨(dú)特,溫?zé)峄煏绊懸认侔┠[瘤細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜、大分子合成及DNA修復(fù)機(jī)制,同時,溫?zé)峄熯€會促進(jìn)癌細(xì)胞產(chǎn)生大量的溶酶體,激活溶酶體酶的活性,從而抑制癌生長能力,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡率加快[8]。
本研究結(jié)果表明,溫?zé)峄熓歉纳漂熜?、促?xì)胞凋亡的有效方案。但單一熱療仍存在一定問題,即溫度過高會導(dǎo)致人體正常細(xì)胞受損,且極易導(dǎo)致部分癌細(xì)胞出現(xiàn)耐熱性,因而不適合單一應(yīng)用。因此,在胰腺癌患者化療配合體內(nèi)熱療時,既需要關(guān)注溫度過低導(dǎo)致療效受影響的問題,又需要避免過高的溫度導(dǎo)致人體正常細(xì)胞受損,或?qū)е掳┘?xì)胞出現(xiàn)耐熱性的問題[9]。
本研究分析發(fā)現(xiàn),在5-FU 藥物濃度相同的情況下,在溫度為40~45 ℃時,各組促凋亡作用均高于37 ℃空白對照組。促凋亡作用在溫度為43~45 ℃時驟然增強(qiáng),且在溫度為45 ℃時促凋亡作用達(dá)到最大,結(jié)果表明熱療對化療具增敏效果。當(dāng)熱療溫度超過40~45 ℃時,人體難以耐受,會損傷正常細(xì)胞。在5-FU 藥物濃度相同的情況下,溫?zé)峄熃M殺傷胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1細(xì)胞的作用明顯強(qiáng)于熱療組,究其原因為熱度既能將胰腺癌細(xì)胞直接殺傷,又可進(jìn)一步提升癌細(xì)胞胞漿中5-FU 的藥物濃度,以此強(qiáng)化5-FU 的促細(xì)胞凋亡作用[10]。熱化療增強(qiáng)化療藥殺傷效果的這一特點(diǎn)在腫瘤臨床上具有顯著意義,一是熱化療可增強(qiáng)癌細(xì)胞或耐藥癌細(xì)胞對化療藥的敏感性,改善療效;二是熱化療可明顯降低化療藥物的實際用量,大幅度減弱因化療所產(chǎn)生的毒副作用[11]。
本研究依據(jù)Veleriote 法對溫?zé)峄煹淖饔眠M(jìn)行判定發(fā)現(xiàn),在溫度為41~45 ℃時,其呈現(xiàn)為協(xié)同作用,且相比于熱療加化療的促細(xì)胞凋亡作用,溫?zé)峄煹淖饔酶@著。在溫度為43~45 ℃時,相比于化療組,溫?zé)峄熃M的促細(xì)胞凋亡作用更強(qiáng),在溫度為40~43 ℃時,溫?zé)峄煹臒嵩雒粜Ч用黠@,且在溫度為43~45 ℃時,溫?zé)峄煹膮f(xié)同作用明顯,證實在溫度為43~45 ℃時,5-FU HIPEC 的促胰腺癌細(xì)胞凋亡的效果佳。因此,對臨床實際情況充分考慮后,建議43 ℃可作為最佳溫度[12]。
(1)胰腺癌屬于厭氧腫瘤,因其對放療、化療的敏感性偏低,但臨床實驗發(fā)現(xiàn)其對溫?zé)岬拿舾行云?,而HIPEC 化療正是利用胰腺癌細(xì)胞、正常組織細(xì)胞兩者間溫度耐受性的差異而實施的[13]。正常組織細(xì)胞可耐受高溫,溫度為45 ℃,而在溫度為40~43 ℃時,癌細(xì)胞或癌癥病灶會受溫度影響導(dǎo)致相關(guān)功能缺乏,難以散熱,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞被滅活、凋亡[14]。(2)熱療與腹腔灌注化療的作用相互協(xié)同。HIPEC 的化療方式能在極大程度上催化5-FU 與胰腺癌細(xì)胞DNA 兩者間的加聚反應(yīng),進(jìn)一步提升癌細(xì)胞對5-FU 的敏感性,強(qiáng)化5-FU 促胰腺癌細(xì)胞的凋亡傷作用,且溫?zé)峄熢跇O大程度上對化療后癌細(xì)胞的DNA修復(fù)加以抑制。除此之外,在溫度為43 ℃時,能進(jìn)一步將腫瘤細(xì)胞膜的穩(wěn)定狀態(tài)破壞,增加5-FU 的滲透深度,從既往的1~2 mm 延伸至5 mm,以此大幅度提升腫瘤細(xì)胞中化療藥物的濃度[15]。(3)在藥代動力學(xué)方面HIPEC化療的優(yōu)勢明顯。腹腔內(nèi)化療的給藥方式可促使腹腔中5-FU 的血藥濃度維持在較高水平,減低外周血藥濃度。故而,HIPEC 化療既可強(qiáng)化5-FU 對腹膜表面轉(zhuǎn)移癌的直接細(xì)胞毒性作用,又可大大降低胰腺癌患者的全身毒副作用[16-18]。(4)高濃度5-FU 經(jīng)過肝門靜脈吸收后進(jìn)入肝臟,對于晚期胰腺癌患者已轉(zhuǎn)移至肝臟的癌細(xì)胞及癌栓具有較強(qiáng)的殺傷作用[19]。(5)胰腺癌患者HIPEC 過程中,利用灌注液子阿腹腔中持續(xù)流動循環(huán)效果,對腹腔中游離的胰腺癌細(xì)胞、腹膜上種植轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞發(fā)揮機(jī)械性沖刷的作用,以此進(jìn)一步清除胰腺癌患者腹腔中微小轉(zhuǎn)移灶及殘留的癌細(xì)胞。
綜上所述,5-FU HIPEC 化療具有促胰腺癌Panc-1 細(xì)胞株凋亡的作用,43 ℃是溫?zé)峄焻f(xié)同作用的最佳溫度。