張 鑫，桂 敏,2，劉 弟，張金峰，劉雅婷**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝作物研究所，云南 昆明 650205；3.云南農(nóng)業(yè)大學 煙草學院，云南 昆明 650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是指攜帶目標基因1 段cDNA 的重組病毒載體侵染植物后，可誘導植物發(fā)生基因沉默而出現(xiàn)表型突變，通過植物表型或生理指標的變化，進一步推測其基因功能的方法[1-2]。辣椒(Capsicum annuumL.)起源于中南美洲熱帶、亞熱帶地區(qū)，大約在16 世紀后期傳入中國。截至2019 年，辣椒在中國的種植面積超過2.26×106hm2，已是目前中國種植面積最廣的蔬菜之一。近年來，中國的辣椒總產(chǎn)量超過6.4×107t，平均產(chǎn)量接近3×104kg/hm2，農(nóng)業(yè)產(chǎn)值達2 500 億元[3]，在中國蔬菜作物中占有重要地位。利用VIGS 技術挖掘辣椒在抗逆境(病、蟲、非生物脅迫等)、生長發(fā)育以及代謝調(diào)控中的相關基因，對深入理解病原生物—辣椒相互作用、揭示辣椒品質(zhì)性狀形成機理、病蟲害防控、辣椒品種改良等具有重要意義。在VIGS 試驗中，往往需要沉默某基因使植株出現(xiàn)白化等明顯表型，以初步評估基因沉默效果，這種基因即為沉默標記基因，且以八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)基因最為常用。PDS 是類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶，催化無色的八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變成有色的類胡蘿卜素[4]；而類胡蘿卜素在植物中具有光保護作用[5]，其合成途徑被阻斷導致植物光保護功能喪失，引起植株白化。在辣椒中，除PDS基因外，還有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基基因(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small-subunit gene，rbcS)，沉默后葉片會出現(xiàn)變黃和褪綠[6]；在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，Chlorata42基因沉默10～12 d 后葉片變黃[7]；在矮牽牛(Petunia bybrida)中，查爾酮合酶(chalcone synthase，CHS)基因沉默1 個月后，純色牽?；ㄗ?yōu)殡s色花[8]。尋找新的辣椒沉默標記基因，對于辣椒VIGS 技術的補充、完善以及辣椒基因功能的研究具有重要意義。

自1995 年KUMAGAI 等[9]首次利用重組煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)在本氏煙(Nicotiana benthamiana)中成功沉默PDS基因以來，越來越多的病毒沉默載體被運用到VIGS技術中，包括馬鈴薯X 病毒(Potato virus X，PVX)[10]、番茄金色花葉病毒 (Tomato golden mosaic virus，TGMV)[11]、煙草脆裂病毒 (Tobacco rattle virus，TRV)[12]、大麥條紋花葉病毒 (Barley stripe mosaic virus，BMSV)[13]等。RATCLIFF 等[12]研究發(fā)現(xiàn)：相較于PVX 沉默載體，TRV 沉默載體引起的病毒侵染癥狀更輕，能夠在植物更多的組織中發(fā)揮沉默作用，且持續(xù)時間更長，沉默效率更高，其原因可能是TRV 沉默載體能夠侵入植物的生長點。相較于其他病毒沉默載體，TRV沉默載體寄主廣泛[14]，已被廣泛運用于驗證植物基因功能的科學研究中。

在高等植物中，作為類胡蘿卜素前體物質(zhì)的異戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)主要通過甲基赤蘚糖醇(methylerythritol phosphate，MEP)途徑合成。在MEP 途徑中，首先由1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸縮合形成1-脫氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate，DXP)，之后經(jīng)過一系列的酶促反應最終生成IPP[15]。而DXS 是MEP 生物合成途徑中的第1 個關鍵酶[16]，關鍵酶又被稱為限速酶，決定總反應的速度和方向，沉默關鍵酶基因可能會對代謝過程產(chǎn)生更大的影響。

目前，TRV 介導的VIGS 體系已經(jīng)成功沉默CaPDS基因并使辣椒植株出現(xiàn)明顯的白化[6,17]。如果沉默CaDXS基因，阻斷類胡蘿卜素前體IPP的生成，進而降低辣椒類胡蘿卜素的含量，辣椒同樣可能產(chǎn)生白化表型。但利用TRV 沉默體系沉默CaDXS基因，辣椒能否出現(xiàn)白化以及與沉默CaPDS基因的辣椒表型有何區(qū)別還未見報道。本研究應用TRV 誘導的基因沉默技術，分別沉默辣椒的CaPDS和CaDXS基因，比較分析沉默CaPDS和CaDXS基因的辣椒表型，評估CaDXS基因作為辣椒沉默標記基因的潛力并驗證Ca-DXS基因在辣椒類胡蘿卜素合成過程中的功能，為尋找新的辣椒沉默標記基因和VIGS 技術的完善提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究供試辣椒品種為蕭新19 號，購自安徽蕭新種業(yè)有限公司，其生長條件為23 ℃光照16 h，21 ℃黑暗8 h。

大腸桿菌感受態(tài)細胞(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，目錄號：CD-501)購自北京全式金生物技術 (TransGen Biotech)股份有限公司；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 感受態(tài)細胞(GV3101 Chemically Competent Cell，目錄號：AC1001)購自上海唯地生物技術有限公司。病毒載體pTRV1 和pTRV2均由云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院陳小姣惠贈；pTRV2-CaPDS 由劉雅婷教授課題組構(gòu)建。含有上述3 種載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101 菌株均保存于云南農(nóng)業(yè)大學作物種質(zhì)創(chuàng)新及可持續(xù)利用重點實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 第1 條鏈的合成

采用TRNzol Universal 總RNA 提取試劑[ 天根生化科技(北京)有限公司 ]提取蕭新19 號辣椒的總RNA；提取完成后，用無酶水溶解，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ肏iScript II 1st Strand cDNA Synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將辣椒的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用無酶水溶解，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 辣椒DXS基因沉默片段的PCR 擴增

根據(jù)NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已公布的辣椒DXS基因mRNA 序列(GenBank 登錄號：NM_001398343.1)，利用Solanaceae Genomics Network (https://solgenomics.net/)的VIGS Tool (https://vigs.solgenomics.net/)[18]分析確定該基因的最佳沉默片段范圍；利用NCBI 在線引物設計工具Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)，在最佳沉默片段的范圍設計引物(表1)并添加酶切位點和保護堿基。以辣椒的cDNA為模板，用高保真PCR 酶(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，2×Phanta Flash Master Mix Dye Plus)進行PCR 反應擴增CaDXS基因沉默片段。PCR 反應程序為：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，59 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 s，34 個循環(huán)；72 ℃延伸1 min。PCR 反應結(jié)束后，產(chǎn)物于-20 ℃保存。所有引物的合成和DNA 序列的測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 本研究使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.3CaDXS基因沉默載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

擴增CaDXS基因沉默片段的PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，用SteadyPure PCR 反應液純化試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司)對CaDXS基因的沉默片段進行純化回收。采用New England Biolabs 公司的限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI-HF?和KpnIHF?雙酶切pTRV2 質(zhì)粒載體和CaDXS基因沉默片段，回收純化酶切產(chǎn)物。采用DNA 連接試劑盒Ver.2.1 (寶日醫(yī)生物技術有限公司)連接雙酶切的pTRV2 質(zhì)粒載體和CaDXS基因沉默片段，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞[19]。挑取陽性單克隆，經(jīng)菌落PCR 檢測后測序鑒定PCR產(chǎn)物，測序驗證正確的單克隆進行菌落液體振蕩培養(yǎng)，-70 ℃保存?zhèn)溆貌⑻崛≈亟M沉默載體pTRV2-CaDXS；沉默載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細胞中，-70 ℃保存?zhèn)溆肹20]。

1.2.4 農(nóng)桿菌的準備和注射

將攜帶pTRV1、pTRV2、pTRV2-CaPDS 和pTRV2-CaDXS 載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101 菌液在YEB 液體培養(yǎng)基(50 μg/mL 卡那霉素和50 μg/mL利福平)中28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h；以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入農(nóng)桿菌浸潤緩沖液[21](10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2和200 μmol/L 乙酰丁香酮)重新懸浮菌體，調(diào)整菌液濃度至OD600值為0.8。將攜帶pTRV1 載體的農(nóng)桿菌與攜帶pTRV2、pTRV2-CaPDS、pTRV2-CaDXS 載體的農(nóng)桿菌分別按體積比1∶1 混合，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光靜置3 h。用注射器針頭輕劃辣椒葉片背面，去掉針頭后將菌液注入辣椒第1、2 片真葉，并設置3 個處理。①TRV：注射TRV1 和TRV2 沉默空載的植株對照組；② TRV-CaDXS：注射TRV1和TRV2-CaDXS 的植株處理組；③TRV-CaPDS：注射TRV1 和TRV2-CaPDS 的植株處理組。注射菌液后的辣椒植株置于23 ℃避光處理12 h，再置于23 ℃光照16 h、21 ℃黑暗8 h 的植物光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 實時熒光定量PCR 檢測CaDXS基因和CaPDS基因的沉默效率

當TRV-CaDXS 和TRV-CaPDS 處理組的葉片出現(xiàn)白化后，分別從處理組和注射沉默空載的對照組各取3 株辣椒的第5、6 片真葉，提取RNA 作為3 個生物學重復，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR 的每個生物學重復針對內(nèi)參基因、CaDXS基因和CaPDS基因進行4 個技術重復。反轉(zhuǎn)錄(HiScript?III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR)和qPCR 試劑(TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。以辣椒泛素結(jié)合蛋白(ubiquitin-conjugating protein，UBI-3)基因作為內(nèi)參基因[22]，所用引物序列見表1，在ABI 7500 熒光定量PCR 儀上進行實時熒光定量PCR 反應。采用2-ΔΔCt法[23]計算CaDXS和CaPDS基因的相對表達量，并用GraphPad Prism 8 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaDXS 基因沉默片段的擴增

辣椒DXS基因沉默片段的PCR 擴增獲得單一清晰的目的條帶，片段為389 bp，與預期大小一致(圖1)。

圖1 CaDXS 基因沉默片段的PCR 擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of silencing fragment of CaDXS gene

2.2 沉默CaPDS 和CaDXS 基因的辣椒葉片表型

農(nóng)桿菌注射到辣椒葉片10 d 后，注射葉葉柄斷裂。注射21 d 后，TRV 處理的辣椒植株葉片未白化；沉默CaPDS基因的辣椒第5、6 片真葉靠近葉柄處的局部開始出現(xiàn)白化現(xiàn)象；沉默Ca-DXS基因的辣椒第5、6 片真葉開始出現(xiàn)褪綠現(xiàn)象。注射約30 d，沉默CaDXS基因的辣椒葉片也逐漸出現(xiàn)明顯的白化(圖2a)；沉默CaPDS基因的辣椒葉片，其白化面積從靠近葉柄處逐漸蔓延擴大(圖2b)。注射33 d，沉默CaPDS基因的辣椒新生葉幾乎白化，第5、6 片真葉大部分白化，局部有綠色；沉默CaDXS基因的辣椒第5、6 片真葉出現(xiàn)明顯且均勻的白化(圖2c)。沉默Ca-PDS和CaDXS基因的辣椒均有4 株白化；相較于沉默CaPDS基因，沉默CaDXS基因的辣椒約晚9 d 出現(xiàn)白化，白化程度不夠徹底；TRV 處理的辣椒植株葉片則始終未出現(xiàn)白化，且沉默CaPDS和CaDXS基因的辣椒植株相較于TRV 處理的辣椒植株偏小(圖2c)。

圖2 沉默CaPDS 和CaDXS 基因的辣椒葉片表型Fig.2 Phenotypes of the leaves of chili pepper plants by CaPDS and CaDXS gene silenced

2.3 CaDXS 和CaPDS 基因的沉默效率

CaDXS基因在沉默辣椒中的表達量顯著低于對照組(P＜0.05)，沉默效率為86.80%；CaPDS基因在沉默辣椒中的表達量極顯著低于對照組(P＜0.001)，沉默效率為93.08% (圖3)。

圖3 處理組和對照組CaDXS 和CaPDS基因的相對表達水平Fig.3 Relative expression levels of CaDXS and CaPDS gene in treated group and control group

3 討論

辣椒表型觀察和實時熒光定量PCR 結(jié)果表明：CaDXS和CaPDS基因均被成功沉默。李杰等[24]使用TRV 沉默載體分別沉默辣椒番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene β-cyclase，Lcyb)基因、蕓薹素唑耐受因子1 (brassinazole-resistant 1，BZR1)基因和CaPDS基因，結(jié)果表明：CaPDS、CaLcyb和CaBZR1基因表達量均顯著降低，且沉默組辣椒葉片的類胡蘿卜素含量顯著低于正常對照植株；在沉默組中，類胡蘿卜素含量從低到高依次為沉默CaPDS、CaLcyb、CaBZR1基因的辣椒；觀察沉默21 d 后的表型，沉默CaPDS基因的葉片出現(xiàn)白化，沉默CaLcyb基因的葉片顏色變淺，沉默CaBZR1基因的植株生長受到抑制，表明類胡蘿卜素含量越低，葉片顏色變化越明顯。已報道的沉默標記基因通過阻斷類胡蘿卜素或葉綠素的合成影響葉色，通過阻斷與花色形成密切相關的類黃酮等物質(zhì)合成影響花色。

本研究沉默的2 個基因和沉默擬南芥Chlorata42基因的共同點是改變?nèi)~色，但不同點在于本研究的2 個沉默標記基因處于類胡蘿卜素合成途徑，擬南芥Chlorata42基因處于葉綠素合成途徑。沉默Chlorata42基因的擬南芥葉片出現(xiàn)黃化，其原因可能是沉默基因阻礙鎂螯合酶復合物的形成，進而減弱葉綠素的合成[25-26]。TURNAGE等[25]和BURCH-SMITH 等[7]先后利用甘藍曲葉病毒(Cabbage leaf curl virus，CbLCV)沉默載體和TRV 沉默載體沉默擬南芥Chlorata42基因，Cb-LCV 沉默載體誘導的擬南芥新葉在沉默21～28 d后黃化，而TRV 沉默載體誘導的新葉在沉默10～12 d 后黃化。

與改變?nèi)~色的沉默標記基因不同，沉默CHS基因改變的是花色。沉默CHS基因的植株呈現(xiàn)花色變白的現(xiàn)象，可能是阻礙了對花色形成起主要作用的類黃酮物質(zhì)(如花青素)的生物合成[27-29]。TRV 沉默載體沉默毛花獼猴桃(Actinidia eriantha)紅色花瓣中的AeCHS基因，約20 d 出現(xiàn)花瓣漂白現(xiàn)象，花青素含量顯著降低[30]。利用改良的中國番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV) 衛(wèi)星DNA 沉默載體沉默矮牽牛PbCHS基因，1 個月后純色牽牛花變?yōu)殡s色花[8]。因此，利用VIGS 技術研究基因功能時，應考慮基因表達的組織特異性。

沉默rbcS基因的植株出現(xiàn)變黃和褪綠可能是由于沉默該基因?qū)е潞送?1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco)全酶成分的缺乏。rbcS基因編碼穩(wěn)定Rubisco 全酶結(jié)構(gòu)所必需的小亞基[31]，而Rubisco 是植物光合作用反應固定CO2的關鍵酶并參與光呼吸途徑[32]。研究表明：煙草rbcS 反義突變體AL5 中的Rubisco 含量僅為正常煙草的20%，總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量也僅為正常煙草的50%[33]；也有研究表明：TRV 載體沉默本氏煙的rbcS基因后，Rubisco 大、小亞基含量均顯著降低，總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量也顯著降低，葉片變黃[34]。以上研究表明：rbcS含量的降低導致Rubisco 含量降低，但Rubisco 含量降低的植株中總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量也降低的機制尚不清楚。

本研究表明：沉默CaDXS基因的辣椒出現(xiàn)明顯白化的時間晚于沉默CaPDS基因的辣椒。分析其原因可能是沉默CaDXS基因?qū)е翫XP 減少，該物質(zhì)減少造成的影響在生物合成途徑中逐級傳遞至類胡蘿卜素。CaDXS處于類胡蘿卜素生物合成途徑的上游，CaPDS基因處于下游，沉默Ca-DXS基因后，需要更長的時間才能將DXP 減少的影響傳遞至類胡蘿卜素，故沉默CaDXS基因的辣椒出現(xiàn)明顯白化的時間較晚。相較于沉默Ca-PDS基因的辣椒，沉默CaDXS基因的辣椒白化不夠徹底可能與生物合成途徑中的代謝調(diào)節(jié)有關。沉默較上游的CaDXS基因可能導致更多種類胡蘿卜素前體減少，但辣椒細胞可能通過調(diào)整更多的代謝途徑增加對類胡蘿卜素各種前體的合成，以減緩類胡蘿卜素生物合成的受影響程度。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了TRV 介導的CaDXS基因沉默載體。CaDXS基因沉默后出現(xiàn)白化現(xiàn)象，說明該基因可作為辣椒基因沉默試驗候選的標記基因，擴大了辣椒沉默標記基因的范圍，為豐富辣椒沉默標記基因提供了參考。相較于沉默Ca-DXS基因的辣椒，沉默CaPDS基因的辣椒植株白化表型出現(xiàn)得更早且明顯，因此CaPDS基因比CaDXS基因更合適作為辣椒沉默的標記基因。