王素娟，田曉平，趙巧輝，王天云

(1.鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司,河南 鄭州 450016;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

噬菌體展示技術(shù)是將編碼外源蛋白或多肽的DNA片段插入能編碼噬菌體衣殼蛋白的基因中,從而將蛋白或多肽展示在噬菌體表面的一種技術(shù)[1-4]。噬菌體展示技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了表型與基因型相結(jié)合,也實(shí)現(xiàn)了蛋白的多樣化展示與高通量篩選,從而在抗體藥物研發(fā)、小分子多肽研究及分子診斷領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[5-7]。醛固酮(aldosterone,ALD)是一種在血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)和血漿中K+含量增加、Na+減少等生理刺激下由腎上腺皮質(zhì)分泌的鹽皮質(zhì)激素[8-10]。研究發(fā)現(xiàn),ALD在體內(nèi)水平的升高可誘發(fā)原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldosteronism,PA)、糖尿病、慢性腎臟病等多種代謝性相關(guān)疾病。目前,臨床上常使用放射免疫法或化學(xué)發(fā)光免疫法來檢測(cè)血清或血漿中腎素活性、AngⅡ和ALD水平[11-12],但檢測(cè)過程中可出現(xiàn)假陽性率高的現(xiàn)象;特別是在腎素水平低至無法檢測(cè)的情況下,ALD水平也會(huì)受到影響而低于正常水平[12-14]。因此,為更好地實(shí)現(xiàn)ALD在ALD相關(guān)代謝性相關(guān)疾病早期診斷中的靈敏度與準(zhǔn)確性,尋找高親和力、高競(jìng)爭(zhēng)性的特異性ALD抗體十分重要。本研究利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建單鏈片段(single-chain variable fragment,ScFv)噬菌體文庫,篩選高親和力、高競(jìng)爭(zhēng)性的兔ALD單抗,以期為后續(xù)ALD診斷試劑盒的研發(fā)提供原材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株、菌種及載體質(zhì)粒

5只健康清潔級(jí)新西蘭大白兔,雌性,6周齡,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部;人胚胎腎(HEK) 293細(xì)胞株購自美國Thermo Fisher公司,大腸桿菌TG1菌株購自湖南豐暉生物科技有限公司;噬菌粒載體pcomb3xss由本實(shí)驗(yàn)室保存;超級(jí)噬菌體(superPhage)購自美國Phageomics公司,并由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存。

1.1.2 主要試劑與儀器

ALD、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司,TRIzol試劑購自瑞士Roche公司,限制性核酸內(nèi)切酶SifI、KasI、BamHI購自美國Thermo公司,SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix、T4 DNA Ligase購自美國Invitrogen公司,PrimeSTAR?Max DNA polymerase購自日本TaKaRa公司,ALD-血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)由鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司偶聯(lián)合成并保存,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;1 mm電擊杯購自美國BIO-RAD公司,電轉(zhuǎn)儀購自美國BIO-RAD公司,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購自美國Thermo公司,超凈工作臺(tái)購自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;落地式離心機(jī)購自美國Thermo公司,酶標(biāo)儀購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

1.2 動(dòng)物免疫組織的獲取

將抗原ALD-KLH稀釋至 2 mg·L-1,采用背部多點(diǎn)注射方法對(duì)5只新西蘭大白兔進(jìn)行首次免疫,免疫劑量為每只1 mg;每隔2周進(jìn)行1次免疫,且免疫劑量減少50%。從第3次免疫開始,每次免疫1周后采集大白兔耳緣靜脈血,使用包被0.25 mg·L-1ALD-BSA抗原的化學(xué)發(fā)光板,采用間接法和免疫競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定血清滴度;根據(jù)結(jié)果擇優(yōu)選取效價(jià)高、特異性好的大白兔;然后,采用放血處死法將其處死,摘取其脾臟和骨髓等組織保存在液氮中備用。

1.3 ScFv噬菌體文庫的構(gòu)建

1.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

從液氮中取出脾臟和骨髓,并在低溫下研磨至粉末,采用TRIzol試劑一步法提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度,并根據(jù)濃度取100 ng總RNA,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠鑒定RNA質(zhì)量;按照SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增

設(shè)計(jì)連接輕鏈可變區(qū)(variable region of light chain,VL)和重鏈可變區(qū)(variable region of heavy chain,VH)的連接肽(linker)上下游引物:上游引物序列為5′-CCTTCTAGATCTCCTTGGTGGGGGTGGTGGCGGGCTCGTAGGATCTCCAGCTCGGTCCC-3′,下游引物序列為5′-AGGAGACCACCGCCACCGAGCCCGCCACCACCCCCACCCAGTCGGTGGAGGAG-3′;設(shè)計(jì)可引入酶切位點(diǎn)并能完成ScFv片段擴(kuò)增的上下游引物:上游引物序列為5′-CTGCTGCTGGGCCCAGGCGGCC-3′,下游引物序列為5′-GAGGAGGAGGGCCGGCCTGGCC-3′。利用實(shí)驗(yàn)室保存的PCR上下游簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增其VL和VH片段。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板2.5 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃變性15 s,56 ℃變性15 s,72 ℃變性25 s,共30個(gè)循環(huán);然后,核酸純化回收目的片段,按摩爾比11進(jìn)行合并。

1.3.3 單鏈ScFv制備

使用引物ScFv-1/linker-1、ScFv-2/linker-2分別擴(kuò)增回收產(chǎn)物。反應(yīng)條件為:95 ℃變性15 s,56 ℃變性15 s,72 ℃變性25 s,共20個(gè)循環(huán);回收目的片段1。使用引物ScFv-1/ScFv-2進(jìn)行VL與VH的相互搭橋拼接和擴(kuò)增;反應(yīng)條件為:95 ℃變性15 s,68 ℃變性 1 min 15 s,共10個(gè)循環(huán),回收目的片段2。將目的片段2與噬菌粒載體Pcomb3xss分別使用限制性內(nèi)切酶SifI酶切,連接后電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1菌株(圖1);然后,用2xYT培養(yǎng)液進(jìn)行梯度倍比稀釋,并涂布含氨芐抗性的平板,37 ℃培養(yǎng)過夜;計(jì)數(shù)單克隆菌落并計(jì)算庫容。剩余培養(yǎng)后的菌液加入體積分?jǐn)?shù)80%的甘油凍存至-80 ℃冰箱,作為初級(jí)抗體庫。隨機(jī)挑取氨芐抗性平板上的10個(gè)單克隆進(jìn)行PCR鑒定并測(cè)序,用IMGT軟件進(jìn)行序列分析。

圖1 ALD噬菌體文庫構(gòu)建示意圖

1.4 噬菌體文庫淘選

使用輔助噬菌體superPhage侵染初級(jí)抗體庫,37 ℃侵染0.5 h后,30 ℃過夜震蕩培養(yǎng)后;次日,5 000 r·min-1離心收集上清,獲得重組噬菌體抗體。將抗原ALD-BSA稀釋至20 mg·L-1,包被至免疫管中,4 ℃過夜孵育;將噬菌體抗體上清使用20 g·L-1脫脂奶粉封閉后加入免疫管中,室溫孵育2 h,用的Gly-HCl(pH=2.5)進(jìn)行洗脫,加入Tris-HCl(pH=7.4)中和洗脫液至pH=7.0后,再加入宿主菌TG1(OD600=0.5),振蕩培養(yǎng)1 h;然后,加入superPhage侵染30 min,再振蕩培養(yǎng)1 h,5 000 r·min-1離心,然后用2xYT-A+K+輕懸細(xì)胞沉淀,30 ℃過夜培養(yǎng)。采用同樣方法篩選,逐輪降低抗原包被濃度,篩選至少3輪。自2輪淘洗開始,利用ALD-BSA抗原與噬菌體文庫特異結(jié)合的原理,對(duì)洗脫下來的噬菌體應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)進(jìn)行多克隆滴度測(cè)定,并將培養(yǎng)后的菌液梯度稀釋后涂布平板上,計(jì)數(shù)單克隆,計(jì)算出庫量及產(chǎn)出比(投入量/產(chǎn)出量),鑒定噬菌體文庫質(zhì)量;挑取6個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定,使用IMGT軟件分析監(jiān)控淘洗序列多樣性。

1.5 噬菌體單克隆的制備及檢測(cè)

1.5.1 噬菌體單克隆的制備

挑取出庫平板上200個(gè)單克隆菌株,接種于含氨芐抗生素的2xYT培養(yǎng)基中,37 ℃、250 r·min-1震蕩過夜培養(yǎng);次日,按120比例對(duì)接菌液于含氨芐抗生素的2xYT培養(yǎng)基中,3 h后加入superPhage侵染30 min,再振蕩培養(yǎng)1 h,更換2xYT-A+K+培養(yǎng)基,16 ℃、250 r·min-1過夜震蕩培養(yǎng)。

1.5.2 噬菌體單克隆檢測(cè)

將檢測(cè)抗原ALD-KLH稀釋至0.1 mg·L-1,然后包被在化學(xué)發(fā)光板上,4 ℃孵育過夜,用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌2遍后,BSA 37 ℃封閉 2 h;洗滌后加入制備好的單克隆噬菌體,37 ℃孵育0.5 h;洗滌后加入二抗M13-HRP,37 ℃孵育0.5 h;洗滌后加入顯色試劑,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。

1.6 構(gòu)建真核表達(dá)載體HEK-293細(xì)胞表達(dá)

將篩選得到的克隆序列插入至pCMV3表達(dá)載體,提取質(zhì)粒后使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染;1周后,收取上清,應(yīng)用親和層析純化及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳鑒定其純度及表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 5只大白兔免疫血清效價(jià)

5只大白兔在第5次免疫后,間接法檢測(cè)其血清效價(jià)結(jié)果顯示,4#、5#大白兔血清在稀釋32 000倍后,吸光度值仍>10 000。免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)結(jié)果顯示,5#大白兔血漿樣本低值與高值的比值為21,優(yōu)于其他大白兔。結(jié)果見圖2。因此,選取5#大白兔進(jìn)行噬菌體文庫構(gòu)建。

A:間接法;B:免疫競(jìng)爭(zhēng)法。

2.2 ALD噬菌體文庫構(gòu)建與多樣性鑒定結(jié)果

常規(guī)PCR擴(kuò)增出VL及VH基因片段,大小350 bp左右;經(jīng)搭橋拼接成ScFv(VL+VH)后,瓊脂凝膠電泳分析可看到750 bp左右大小條帶(圖3),與最初設(shè)計(jì)的片段大小一致。ScFv經(jīng)酶切連接電轉(zhuǎn)至大腸桿菌TG1中,構(gòu)建一個(gè)庫容為4.73×108cfu·mL-1的噬菌體文庫;挑取10個(gè)克隆分析結(jié)果顯示,10條序列均不相同。

圖3 ALD噬菌體文庫ScFv拼接后瓊脂凝膠電泳條帶

2.3 ALD噬菌體文庫淘洗及多克隆檢測(cè)結(jié)果

噬菌體文庫3輪篩選結(jié)果顯示,出庫量和產(chǎn)出比逐輪升高(表1)。每輪測(cè)序6個(gè)單克隆,經(jīng)IMGT分析顯示,3輪淘洗6條序列均不相同。

表1 噬菌體文庫3輪篩選出庫量和產(chǎn)出比

2.4 ALD噬菌體文庫多克隆檢測(cè)結(jié)果

富集淘洗過程中,每輪使用化學(xué)發(fā)光免疫法對(duì)ALD噬菌體進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,淘洗3輪后,噬菌體文庫在校準(zhǔn)品和臨床樣本的檢測(cè)中競(jìng)爭(zhēng)梯度均較好,達(dá)到2倍梯度,結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 噬菌體文庫校準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)結(jié)果

圖5 噬菌體文庫臨床樣本競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)結(jié)果

2.5 ALD單克隆噬菌體檢測(cè)結(jié)果

3輪淘洗出庫平皿挑取300個(gè)單克隆,制備單克隆噬菌體,并使用化學(xué)發(fā)光免疫法進(jìn)行ELISA檢測(cè);結(jié)果顯示,300個(gè)克隆中陽性率達(dá)100%(圖6),校準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)陽性克隆42個(gè)(圖7),篩出率14%;42個(gè)陽性克隆進(jìn)一步進(jìn)行臨床樣本競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè),篩出16株單克隆符合要求(圖8);將16株進(jìn)行復(fù)測(cè),2次檢測(cè)結(jié)果一致(圖9)。AD185、AD277抗體在校準(zhǔn)品及臨床樣本競(jìng)爭(zhēng)中均表現(xiàn)出比陽性對(duì)照高出2倍的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

圖6 噬菌體單克隆檢測(cè)初篩

圖7 噬菌體單克隆校準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)

圖8 噬菌體單克隆競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)

圖9 噬菌體單克隆臨床樣本競(jìng)爭(zhēng)復(fù)測(cè)

2.6 HEK-293細(xì)胞真核表達(dá)載體表達(dá)及純化鑒定

將高競(jìng)爭(zhēng)性的6株抗體經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,純化后進(jìn)行10% SDS-PAGE還原膠電泳,結(jié)果顯示,在重鏈50 000及輕鏈25 000位置均有條帶,結(jié)果見圖10。

圖10 高競(jìng)爭(zhēng)性的6株抗體SDS-PAGE電泳條帶

3 討論

ALD是鹽皮質(zhì)激素中一種重要的類固醇激素,研究表明,其除了調(diào)節(jié)體內(nèi)鈉鉀平衡,還與繼發(fā)性高血壓的典型代表PA有關(guān)[15-17]。PA是由于腎上腺皮質(zhì)增生或腫瘤分泌過多ALD而引起潴鈉排鉀,血容量上升,導(dǎo)致血壓升高同時(shí)腎素活性被抑制的一種疾病;而ALD分泌過多則會(huì)導(dǎo)致心血管疾病、腎功能損害、胰島素抵抗等[18-19]。研究表明,ALD的合成主要受腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)、鉀離子的調(diào)節(jié),同時(shí)也受促腎上腺皮質(zhì)激素調(diào)控,而RAAS通常在血管內(nèi)容量耗盡或腎動(dòng)脈灌注減少的情況下被激活,通過促進(jìn)遠(yuǎn)端腎小管和集合管中鈉和水的再吸收,使血管內(nèi)容量增加[20-21]。ALD過度激活腎鹽皮質(zhì)激素受體可導(dǎo)致血管內(nèi)容量擴(kuò)張,最終導(dǎo)致高血壓伴或不伴低血鉀的風(fēng)險(xiǎn)[22-24]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),ALD水平異常不僅誘發(fā)高血壓,還容易導(dǎo)致心血管疾病、慢性腎病、糖尿病、肥胖等疾病的產(chǎn)生[18,25-26]。因此,機(jī)體內(nèi)ALD水平的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)預(yù)防高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性慢性疾病至關(guān)重要。

ALD檢測(cè)方法從最初的紙層析生化反應(yīng)比色法到放射免疫技術(shù),再發(fā)展到2008年利用質(zhì)譜法開發(fā)的金標(biāo)準(zhǔn),但質(zhì)譜法難度高、價(jià)格昂貴,因此,化學(xué)發(fā)光免疫法便應(yīng)運(yùn)而生[17,27]。目前,意大利DiaSorin公司在2012年底推出的ALD檢測(cè)試劑盒是唯一通過CDFA認(rèn)證的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光平臺(tái)的進(jìn)口試劑盒,但其成本昂貴;因此,急需研發(fā)一款靈敏度高、特異性好的試劑盒以改變現(xiàn)狀。本研究通過將抗原ALD-KLH 背部注射5只新西蘭大白兔進(jìn)行首次免疫,取脾臟和骨髓等組織,使用常規(guī)PCR擴(kuò)增出VL及VH基因片段,大小350 bp左右,經(jīng)搭橋拼接成ScFv(VL+VH)后,瓊脂凝膠電泳分析可看到 750 bp左右大小條帶,與最初設(shè)計(jì)的片段大小一致。ScFv經(jīng)酶切連接電轉(zhuǎn)至大腸桿菌TG1中,構(gòu)建一個(gè)庫容為4.73×108cfu·mL-1的噬菌體文庫;挑取10個(gè)克隆,分析結(jié)果顯示,10條序列均不相同,說明該文庫多樣性較好,達(dá)到繼續(xù)篩選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)噬菌體文庫進(jìn)行3輪篩選結(jié)果顯示,出庫量和產(chǎn)出比逐輪升高,說明噬菌體文庫得到了富集。然后,每輪測(cè)序6個(gè)單克隆,經(jīng)IMGT分析后,均為不同的抗體序列,說明文庫保持了較高的序列多樣性。經(jīng)3輪淘洗出庫平皿挑取300個(gè)單克隆,制備單克隆噬菌體,ELISA結(jié)果顯示,300個(gè)克隆中陽性率達(dá)100%,校準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)陽性克隆42個(gè),篩出率14%,42個(gè)陽性克隆進(jìn)一步進(jìn)行臨床樣本競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè),篩出16株單克隆符合要求,將16株進(jìn)行復(fù)測(cè),2次檢測(cè)結(jié)果一致;送測(cè)序列經(jīng)IMGT軟件分析,優(yōu)選6條抗體序列進(jìn)行構(gòu)建表達(dá);將高競(jìng)爭(zhēng)性的6株抗體經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,純化后進(jìn)行10% SDS-PAGE還原膠電泳,結(jié)果顯示,在重鏈50 000及輕鏈25 000位置均有條帶,表明已成功篩選構(gòu)建出高競(jìng)爭(zhēng)性且表達(dá)量較好的抗體。

4 結(jié)論

通過噬菌體展示技術(shù)可成功篩選出ALD抗體,這為小分子抗體的發(fā)現(xiàn)提供了一種參考方法。篩選出的AD185、AD277抗體在校準(zhǔn)品及臨床樣本競(jìng)爭(zhēng)中,均表現(xiàn)出比陽性對(duì)照高出2倍的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),為ALD檢測(cè)試劑盒原材料的開發(fā)提供了可能性,對(duì)ALD檢測(cè)靈敏度的提高有重要意義。