盧 鑫,張 琳,王鐵良,周曉華

(1. 濟源職業(yè)技術(shù)學院 醫(yī)學護理學院,濟源 459000;2. 河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,鄭州 450002)

1817年人們發(fā)現(xiàn)硒元素后,硒一直被作為一種有毒有害的元素進行研究,直到1957年SCHWARZK等研究發(fā)現(xiàn)硒具有營養(yǎng)作用,進而改變了人們對硒的認知。作為人體必須的微量元素之一,硒具有清除自由基、拮抗重金屬、調(diào)控基因表達、防癌抗癌、增強人體免疫功能等作用[1-3]。研究證明不同形態(tài)的硒對人體毒性、生物效應及防癌作用不同,硒的化學形態(tài)決定硒的可利用價值[4-6]。與無機硒比,有機硒毒性小,生物利用度高[7-8]。農(nóng)作物噴灑無機硒和土壤施無機硒肥是富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)最常見的方式。大豆是硒富集的理想載體,富硒大豆可以通過轉(zhuǎn)運蛋白或磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運作用將外源無機硒吸收,進一步在植物體內(nèi)代謝合成硒代半胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)和甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)等有機硒[9-11]。

目前,富硒農(nóng)產(chǎn)品中硒元素總量測定技術(shù)比較成熟[12-17],各種形態(tài)硒的檢測技術(shù)還沒有統(tǒng)一的國家標準。近年來隨著儀器聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展,硒形態(tài)的分析方法研究比較活躍[18-27]。高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HPLC-HG-AFS)、毛細管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(CE-ICP-MS)、高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-ESI-MS/MS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)等成為了研究熱點。其中,HPLC-HG-AFS具有分析成本低、儀器普及率高、靈敏度好等優(yōu)點,尚未見應用在分析富硒大豆中有機硒形態(tài)的報道。因此,本工作提出了HPLC-HG-AFS測定富硒大豆中硒代氨基酸SeCys、SeMet和MeSeCys含量(以硒計,下同)的方法,該方法簡單、準確,結(jié)果令人滿意。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SA-50型高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀,配100 μL進樣環(huán)的自動進樣器;Milli-Q Syhthesis型超純水系統(tǒng);HH-4型精密恒溫液浴槽;KQ-500E型超聲儀;H-2050R型高速離心機。

單標準儲備溶液:1 g·L-1,稱取MeSeCys、SeMet、SeCys標準品各10 mg(精確到0.01 mg),分別加入0.5 mol·L-1鹽酸溶液1 mL、適量水溶解,并用水定容至10 mL,搖勻,配制成1 g·L-1單標準儲備溶液,保存在0～4 ℃的冰箱中,備用。使用時用水稀釋至所需質(zhì)量濃度。

混合標準儲備溶液:1.00 mg·L-1,分別移取適量的MeSeCys、SeMet、SeCys單標準儲備溶液,用水稀釋并定容,配制成1.00 mg·L-1的混合標準儲備溶液。

混合標準溶液系列:取適量的混合標準儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度為5,10,20,40,60,100 μg·L-1的混合標準溶液系列,現(xiàn)配現(xiàn)用。

鏈霉蛋白酶:S10014-250 mg,9036-06-0,BR(規(guī)格)7 000 U·mg-1;脂肪酶:S10036-25 g,9001-62-1,BR(規(guī)格)20 000 U·mg-1;MeSeCys、SeMet標準品的純度均為98%;SeCys標準品的純度為99%;檸檬酸、磷酸氫二銨、碘化鉀、四丁基溴化銨均為優(yōu)級純;甲醇、乙腈均為色譜純;硼氫化鉀、鹽酸、氫氧化鉀、硝酸、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)均為分析純;試驗用水為超純水。

大豆樣品來自濟源市農(nóng)業(yè)科學院科技人員種植的富硒大豆、市售富硒/普通大豆。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agela MP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);進樣量100 μL;流量1.0 mL·min-1;蠕動泵轉(zhuǎn)速60 r·min-1;柱溫25 ℃;流動相 含2%(體積分數(shù),下同)甲醇和0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨的40 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH 7.0),等度洗脫。

1.2.2 光譜條件

負高壓290 V;原子化器高度9 mm;燈電流90 mA;載氣、屏蔽氣為氬氣,流量分別為300,500 mL·min-1。

1.3 試驗方法

將富硒大豆樣品粉碎,過60目(孔徑0.25 mm)篩,作為待測樣品。按照NY/T 1285—2007《油料種籽含油量的測定 殘余法》對適量樣品進行脫脂處理;總硒測定依據(jù)GB 5009.93—2017《食品安全國家標準 食品中硒的測定》進行。

稱取0.1 g脫脂樣品于離心管中,加入5 mL pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液,超聲振蕩30 min,加入鏈霉蛋白酶15 mg,在37 ℃恒溫條件下振蕩酶解5 h,以轉(zhuǎn)速15 000 r·min-1離心8 min,取上清液過0.22 μm尼龍有機濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

常用的色譜柱DionexAS19無法分離SeMet和MeSeCys,對SeCys的響應值太弱;Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱無論等度洗脫還是梯度洗脫需要時間均較長,分離SeMet重復性差、靈敏度低;而Agela MP-C18色譜柱對有機硒有較好的分離效果[16,24]。因此,選用Agela MP-C18色譜柱用于3種硒代氨基酸的同時分離檢測。

試驗選取檸檬酸和磷酸氫二銨溶液作為流動相,考察了其對3種硒代氨基酸的分離效果。結(jié)果表明:以檸檬酸溶液為流動相時,無論等度洗脫還是梯度洗脫,SeCys和MeSeCys均未完全實現(xiàn)基線分離,分離色譜圖如圖1(a)所示。以40 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液為流動相時,可以實現(xiàn)3種硒代氨基酸的分離,但峰形不太理想。流動相中加入0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨、2%甲醇,不僅可以改變硒代氨基酸的峰形,還可以增強檢測的信號。試驗還進一步優(yōu)化了流動相的酸度。當流動相pH為7.0時,3種硒代氨基酸峰形明顯改善,峰形更尖、峰寬更窄,對稱性良好,在7 min內(nèi)可以完全分離,如圖1(b)所示。因此,試驗選擇含2%甲醇和0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨的40 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH 7.0)為流動相。

圖1 3種硒代氨基酸在不同流動相洗脫下的色譜圖

2.2 前處理條件的選擇

2.2.1 酶種類

試驗選取總硒含量較高的富硒大豆樣品(總硒量1.29 mg·kg-1)進行前處理優(yōu)化,比較了鏈霉蛋白酶和脂肪酶對富硒大豆硒形態(tài)提取的影響。分別稱取6份0.1 g脫脂樣品和富硒大豆鮮樣,雙平行,加入水5 mL以及pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液5 mL,超聲30 min后,再分別加入脂肪酶15 mg+鏈霉蛋白酶15 mg、鏈霉蛋白酶15 mg、脂肪酶15 mg,于37 ℃酶解,然后用高速離心機離心處理,脫脂樣品直接過0.22 μm有機濾膜,鮮樣過C18小柱后過0.22 μm有機濾膜,按照儀器工作條件進行測定。結(jié)果表明,只加脂肪酶的富硒大豆鮮樣和脫脂樣品都沒有出現(xiàn)目標峰,其余組別均為SeMet的色譜峰;兩種酶組合使用時,無論是富硒大豆鮮樣還是脫脂樣品,目標峰面積較鏈霉蛋白酶的幾乎沒有改變。因此,試驗選用鏈霉蛋白酶酶解,使用脫脂樣品進行試驗,不需過C18小柱,方便簡單,節(jié)省時間,降低成本。

2.2.2 酶用量

稱取0.1 g脫脂后的富硒大豆樣品5份,加入水5 mL以及pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液5 mL,超聲振蕩30 min后,分別加入鏈酶蛋白酶5,10,15,20,25 mg,于37 ℃酶解,然后用高速離心機離心后過0.22 μm有機濾膜,按照儀器工作條件進行測定,以SeMet的質(zhì)量分數(shù)為檢測指標,結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明,加入15 mg鏈霉蛋白酶時提取率已經(jīng)很高,再增加鏈霉蛋白酶量,提取到的SeMet量變化很小。考慮檢測成本因素,試驗選擇鏈霉蛋白酶的用量為15 mg。

圖2 酶用量對SeMet質(zhì)量分數(shù)的影響

2.2.3 提取劑

稱取0.1 g脫脂樣品5份,分別加入水、10%(體積分數(shù),下同)硝酸溶液、15%(體積分數(shù),下同)鹽酸溶液、pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液、20%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液5 mL,超聲振蕩30 min后,再分別加入15 mg鏈霉蛋白酶,于37 ℃酶解,用高速離心機離心后過0.22 μm有機濾膜,按照儀器工作條件測定。結(jié)果表明,10%硝酸溶液、15%鹽酸溶液提取率較低,而20%甲醇溶液、水和pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液提取率較高,其中pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液提取率最高。這是因為硒代氨基酸以游離態(tài)和蛋白形態(tài)存在于農(nóng)作物中,水可以將樣品中游離硒代氨基酸提取出來,但不能提取蛋白形態(tài)的氨基酸。酸盡管可以打破蛋白中連接氨基酸間的肽鍵,釋放氨基酸,但酸解過程需要控制條件,否則蛋白會被過度分解。Tris-HCl緩沖液可以先得到游離態(tài)和蛋白形態(tài)硒代氨基酸,然后在鏈霉蛋白酶作用下得到硒代氨基酸。因此,試驗選用pH 7.5的130 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液作為提取劑。

2.2.4 提取條件

稱取0.1 g脫脂樣品,以硒代氨基酸總量為指標值,對提取劑濃度(A)、提取劑用量(B)、提取劑酸度(C)、提取時間(D)等4個因素按正交表L9(3)4進行試驗,正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

結(jié)果表明:SeMet是富硒大豆中硒的主要賦存形態(tài)。由極差R可知,以3種硒代氨基酸總和為指標值,提取因素影響由大到小依次為C、A、B、D,A2B2C3D2為正交試驗的最優(yōu)組合。考慮提取時間過長會影響硒形態(tài)的穩(wěn)定性和工作效率,試驗選擇提取時間為30 min。綜合考慮,試驗選擇3種硒代氨基酸的提取條件是提取劑濃度為130 mmol·L-1,提取劑用量為5 mL,提取劑的pH為7.5,提取時間為30 min。

2.3 保留時間、標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以3種硒代氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明:3種硒代氨基酸在5～100 μg·L-1內(nèi)與其對應的峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)不小于0.999 5;3種硒代氨基酸的保留時間、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 保留時間、線性參數(shù)和檢出限

在空白樣品中加入5 μg·L-1的混合標準溶液,采用逐級稀釋法,以3倍基線噪聲測定硒代氨基酸的檢出限。當取樣量為0.1 g,定容體積為5 mL時,檢出限換算結(jié)果見表2。

2.4 精密度和回收試驗

選取總硒含量較高的富硒大豆樣品(總硒量1.29 mg·kg-1),脫脂后按照試驗方法測定3種硒代氨基酸的本底值,并分別進行低、中、高3種濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定7次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n=7)

由表3可知,3種硒代氨基酸的回收率為85.5%～103%,測定值的RSD不大于3.0%,說明方法準確度和精密度均較高。

2.5 樣品分析

在優(yōu)化的儀器工作條件下,采用試驗方法測定一些市售富硒大豆和普通大豆中硒代氨基酸的含量,結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果

結(jié)果表明:富硒大豆中硒賦存形態(tài)為SeMet,含量(以硒計)占總硒量比率在85.5%～94.5%內(nèi)。這與液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[24]測定大豆中硒形態(tài)含量的結(jié)論一致。市售富硒大豆1的色譜圖見圖4。由保留時間可知富硒大豆中硒賦存形態(tài)為SeMet。

圖4 市售富硒大豆1中SeMet的色譜圖

本工作優(yōu)化了大豆樣品中硒代氨基酸的前處理條件,提出了HPLC-HG-AFS測定富硒大豆中不同形態(tài)硒代氨基酸含量的方法,結(jié)果表明富硒大豆中硒主要賦存形態(tài)為SeMet。該方法簡單、準確,所用設(shè)備價格適中,便于推廣,對發(fā)展富硒功能農(nóng)業(yè)、監(jiān)測食品安全、評估市售富硒大豆產(chǎn)品品質(zhì)具有一定的現(xiàn)實意義。