李 倩,王向軍,張 丹

(鄭州海關(guān)技術(shù)中心,鄭州 450003)

胂是砷化氫分子中的氫原子部分或全部被羥基取代而成的衍生物。有機(jī)胂類飼料添加劑可以刺激畜禽動物生長,改善畜禽肉質(zhì),且具有廣譜的抗菌性[1-7]。有機(jī)胂類藥物雖然比無機(jī)砷毒性小很多,但由于不合理的使用,在畜禽產(chǎn)品中的蓄積作用會間接對人類健康造成影響[8-12]。

隨著分析技術(shù)的提高,發(fā)展了部分有機(jī)胂形態(tài)分析的方法[13-17],但在凈化富集技術(shù)、靈敏度和分離度上仍有問題,國內(nèi)外報道的文獻(xiàn)中也鮮有飼料中多種有機(jī)胂形態(tài)的液相色譜檢測方法。目前現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)中,國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22146—2008《飼料中洛克沙胂的測定 高效液相色譜法》采用高效液相色譜法測定飼料中洛克沙胂,但該標(biāo)準(zhǔn)只能檢測洛克沙胂;采用SN/T 2316—2019 《出口動物源食品中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷殘留量的檢測方法》方法分析時易被無機(jī)砷干擾,且針對的是動物源食品基質(zhì)。本工作采用高效液相色譜法同時測定飼料中阿散酸、硝苯胂酸、洛克沙胂、卡巴胂等4種有機(jī)胂的含量,適用性廣,具有良好的穩(wěn)定性。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀,配有四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(DAD);XP 205型電子天平(精確度0.01 mg);PL-J60型超聲波清洗器;Sigma 3-30KS型離心機(jī);LabTech EV341型旋蒸儀;24孔固相萃取儀;Millipore Q型超純水儀;混合型陰離子交換MAX柱(60 mg/3 mL)。

阿散酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:100 mg·L-1。

硝苯胂酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:100 mg·L-1。

洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液:100 mg·L-1。

卡巴胂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100 mg·L-1,稱取10.0 mg卡巴胂標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.3%),用水溶解并定容至100 mL的容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的卡巴胂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:10 mg·L-1,分別移取1 mL上述阿散酸、硝苯胂酸、洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液和卡巴胂標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于10 mL容量瓶中,用水定容,配制成質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.05,0.1,0.2,0.5,1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

磷酸二氫鉀、甲酸為優(yōu)級純;甲醇為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流量 1 mL·min-1;柱溫 25 ℃;檢測波長 260 nm;進(jìn)樣量 20 μL;流動相A為甲醇,B為含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液,體積比為7…93,等度洗脫。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取1 g飼料于離心管中,加入10 mL 30%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液,振蕩5 min,于40 ℃超聲提取30 min,以轉(zhuǎn)速6 000 r·min-1離心5 min,取上清液。重復(fù)提取一次,合并上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至3～4 mL,過混合型陰離子交換MAX柱,用5%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水溶液淋洗,3 mL含7%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的甲醇溶液洗脫,于40 ℃氮吹至干,用1 mL 30%甲醇溶液溶解,過0.45 μm濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)比較了Agilent Poroshell 120 EC-C18(250 mm×4.6 mm,4 μm)、Agilent Zorbax SB-Aq(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)3種色譜柱對4種有機(jī)胂的分離效果,結(jié)果見圖1。

圖1 色譜柱對4種有機(jī)胂分離的影響

結(jié)果表明:Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱在分離時,峰存在拖尾,且阿散酸、卡巴胂出現(xiàn)雙峰甚至三峰現(xiàn)象;Agilent Zorbax SB-Aq色譜柱能夠較好分離阿散酸和卡巴胂,但洛克沙胂和硝苯胂酸分離度不夠;而Agilent Zorbax SB-C18色譜柱能夠完全分離4種有機(jī)胂。因此,試驗(yàn)選擇Agilent Zorbax SB-C18色譜柱進(jìn)行分離。

2.2 流動相體積比的選擇

試驗(yàn)比較了流動相體系中甲醇與含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液的體積比分別為15…85,10…90,7…93時對4種有機(jī)胂的分離效果,結(jié)果見圖2。

圖2 流動相體積比對4種有機(jī)胂分離的影響

由圖2可知:當(dāng)甲醇與含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液的體積比為15…85時,阿散酸和卡巴胂的色譜峰不能完全分開;當(dāng)甲醇與含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液的體積比為10…90時,在20 min內(nèi)4種有機(jī)胂色譜峰能出完,且能完全分離,但存在一定的基質(zhì)干擾;當(dāng)甲醇與含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液的體積比為7…93時,4種有機(jī)胂色譜峰能完全分離且基質(zhì)干擾較小。因此,試驗(yàn)以體積比為7…93的甲醇-含0.1%甲酸的20 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液的混合液為流動相。

2.3 凈化柱的選擇

根據(jù)有機(jī)胂的性質(zhì),采用陰離子固相萃取柱作為凈化柱。采用飼料空白提取液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),對比強(qiáng)陰離子交換SAX柱(100 mg/3 mL)、弱陰離子交換PWAX柱(60 mg/3 mL)、混合型陰離子交換MAX柱(60 mg/3 mL)和混合型陰離子交換PXA柱(60 mg/3 mL)等4種陰離子柱的凈化效果,4種有機(jī)胂的回收率結(jié)果見圖3。

圖3 陰離子固相萃取柱對4種有機(jī)胂回收率的影響

結(jié)果表明,混合型陰離子交換MAX柱對4種有機(jī)胂的回收效果最好。試驗(yàn)將樣品溶液過MAX柱,用5%氨水溶液淋洗,3 mL含7%甲酸的甲醇溶液洗脫,4種有機(jī)胂均取得良好的回收率,凈化效果好。

2.4 工作曲線和檢出限

從0.05,0.1,0.2,0.5,1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中各取1.0 mL, 分別加至空白樣品中, 經(jīng)提取、濃縮后,殘余物用1 mL 30%甲醇溶液溶解,過0.45 μm濾膜, 上機(jī)測定。 以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。4種有機(jī)胂工作曲線的線性范圍為0.05～1 mg·L-1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限

在空白樣品中分別添加0.01,0.02,0.03,0.04 mg·kg-1等4個濃度水平的4種有機(jī)胂,按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測定,計算信噪比(S/N)。以3倍信噪比確定檢出限(3S/N),結(jié)果見表1。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

平行稱取6份雞飼料,向雞飼料樣品中加入0.1,0.2,0.5 mg·kg-1等3個濃度水平的4種有機(jī)胂進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個濃度水平做6次平行試驗(yàn),計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

本工作采用高效液相色譜法同時測定阿散酸、硝苯胂酸、洛克沙胂、卡巴胂等4種有機(jī)胂的含量。方法檢測效率高,前處理簡便,適用性高。