李業(yè),嚴(yán)豪,劉夢(mèng)婷,白仲虎*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

2(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

3(清華大學(xué),深圳國(guó)際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院,廣東 深圳,518000)

質(zhì)粒是細(xì)胞染色體外的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子,具有獨(dú)立的自主復(fù)制能力,廣泛存在于細(xì)菌和真菌。質(zhì)粒本身在生物進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著作用[1]。作為載體,質(zhì)粒被現(xiàn)代基因工程、合成生物學(xué)等領(lǐng)域利用來(lái)研究新基因的功能[2-3]。利用質(zhì)粒作載體攜帶外源基因,通過(guò)轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞,相比將外源基因整合到宿主基因組來(lái)說(shuō)更加便捷方便。大量研究發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒在微生物宿主細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)與所攜帶基因的表達(dá)量關(guān)系密切[4-7],優(yōu)化質(zhì)粒拷貝數(shù)這一方法廣泛在生物化工領(lǐng)域用于優(yōu)化關(guān)鍵基因表達(dá),提高生物催化效率[8]。基于天然質(zhì)粒構(gòu)建的優(yōu)化體系存在諸多局限,近年來(lái)已有眾多研究,利用前沿合成生物學(xué)手段構(gòu)建出了更先進(jìn)的質(zhì)粒調(diào)控優(yōu)化系統(tǒng)。為此,本文對(duì)調(diào)控質(zhì)?？截悢?shù)優(yōu)化生物催化效率展開(kāi)綜述,并探討了通過(guò)合成生物學(xué)手段進(jìn)一步優(yōu)化系統(tǒng)的新研究方向。

1 質(zhì)粒復(fù)制及拷貝數(shù)簡(jiǎn)介

質(zhì)粒的復(fù)制大致包括復(fù)制起始、延伸和終止。復(fù)制的起始從復(fù)制起點(diǎn) (origin of replication,replicon) 開(kāi)始,涉及復(fù)雜的蛋白—蛋白、蛋白—DNA相互作用。不同的復(fù)制起點(diǎn)序列具有不同的序列結(jié)構(gòu)特征。質(zhì)粒復(fù)制的分子生物學(xué)機(jī)理已經(jīng)研究的較為透徹,詳見(jiàn)相關(guān)綜述總結(jié)[9]。

質(zhì)?？截悢?shù)是指每個(gè)微生物細(xì)胞中質(zhì)粒相對(duì)于染色體的個(gè)數(shù)[10-11]。對(duì)于給定宿主、固定的生長(zhǎng)條件,具有特定復(fù)制起點(diǎn)序列的質(zhì)粒通常具有特征拷貝數(shù)(或一定拷貝數(shù)范圍),這是特定質(zhì)粒系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)其復(fù)制相關(guān)元件來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？刂葡到y(tǒng)通過(guò)糾正單個(gè)細(xì)胞中平均拷貝數(shù)的偏差,將復(fù)制速率維持在穩(wěn)定狀態(tài),進(jìn)而決定了質(zhì)粒拷貝數(shù)。相關(guān)研究表明,質(zhì)粒復(fù)制起始起作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子(抑制劑)參與此調(diào)控,主要調(diào)控機(jī)制包括:a)利用反義RNA (antisense RNA);b)利用轉(zhuǎn)錄抑制(transcription repression);c)利用復(fù)制起點(diǎn)上的迭代子序列(iterons)[12-13]。

質(zhì)?？截悢?shù)可以利用基于熒光定量PCR (qPCR)的方法進(jìn)行絕對(duì)定量[14]?？截悢?shù)測(cè)量結(jié)果表明,可以將質(zhì)粒大致劃分為高拷貝質(zhì)粒、低拷貝質(zhì)粒、單拷貝質(zhì)粒。a)高拷貝數(shù)質(zhì)粒是指拷貝數(shù)較大的質(zhì)粒,在每個(gè)細(xì)胞中可達(dá)到幾十乃至上千份拷貝,其復(fù)制與宿主染色體不同步,僅與質(zhì)粒本身復(fù)制子的控制有關(guān),也稱為松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒[15]。高拷貝質(zhì)粒一般用作表達(dá)目的基因的載體,因?yàn)楦呖截惖幕蛲ǔＤ軐?dǎo)致獲得較高產(chǎn)量的目的基因產(chǎn)物[16];b)低拷貝數(shù)質(zhì)粒是指拷貝數(shù)較低的質(zhì)粒,少到在每個(gè)細(xì)胞中只有一到幾份拷貝[17],與染色體的復(fù)制同步進(jìn)行,受質(zhì)粒本身復(fù)制子和宿主染色體的雙重調(diào)控,也稱為嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的質(zhì)粒,在宿主細(xì)胞中表達(dá)效率較低,甚至可能導(dǎo)致質(zhì)粒分配到子細(xì)胞失敗[18],因而低拷貝質(zhì)粒在實(shí)際應(yīng)用中使用較少;c)單拷貝質(zhì)粒的研究及應(yīng)用很少。除此之外,宿主的不同、生長(zhǎng)條件不同 (培養(yǎng)基成分、溫度),也會(huì)影響質(zhì)?？截悢?shù)[19-21]。

研究者們對(duì)模式原核生物大腸桿菌(Escherichiacoli)和模式真核微生物釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)的質(zhì)粒系統(tǒng)研究最為透徹。大腸桿菌及釀酒酵母常見(jiàn)的復(fù)制起點(diǎn)、質(zhì)?？截悢?shù)以及常用質(zhì)粒分別如表1及表2所示,其他非模式微生物的質(zhì)粒系統(tǒng)常以它們?yōu)閰⒄臻_(kāi)發(fā)構(gòu)建。

表1 大腸桿菌常見(jiàn)復(fù)制起點(diǎn)及拷貝數(shù)

表2 酵母常見(jiàn)復(fù)制起點(diǎn)及拷貝數(shù)

2 天然質(zhì)粒系統(tǒng)在優(yōu)化生物催化的應(yīng)用

大量研究發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)與所攜帶基因的表達(dá)量關(guān)系密切[4-7]:一般來(lái)說(shuō),目的基因的表達(dá)量隨重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)的增加而提高,進(jìn)而提高了目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。這種對(duì)應(yīng)關(guān)系甚至在質(zhì)?？截悢?shù)>300仍存在[9]。不過(guò),當(dāng)質(zhì)粒拷貝數(shù)超過(guò)某個(gè)閾值,會(huì)嚴(yán)重影響系統(tǒng)穩(wěn)定性,反而使得目標(biāo)蛋白表達(dá)量及目標(biāo)小分子化合物合成效率降低[22]。上述研究也表明,并非質(zhì)粒(或目標(biāo)基因)的拷貝數(shù)越高,生物催化的效率也越高。測(cè)定不同質(zhì)?？截悢?shù)的影響(優(yōu)化質(zhì)?？截悢?shù)),是一種簡(jiǎn)單、有效且已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的優(yōu)化生物催化效率的策略[8](表3)。

表3 優(yōu)化天然質(zhì)粒系統(tǒng)提高生物催化效率

2.1 調(diào)控質(zhì)?？截悢?shù)原核系統(tǒng)生物催化

2.1.1 在大腸桿菌中調(diào)控質(zhì)粒拷貝數(shù)的應(yīng)用

腈水合酶是一類重要的金屬酶,可以催化腈類化合物水合生成相應(yīng)的酰胺,在合成酰胺已廣泛應(yīng)用。但是,目前腈水合酶的數(shù)量較少,催化效率低下[23]。為提高腈水合酶的表達(dá)量,史悅等[24]在大腸桿菌BL21(DE3)中利用質(zhì)粒pET28a(+)異源表達(dá)諾卡氏菌來(lái)源的腈水合酶,比活性可高達(dá)450 U/mg,遠(yuǎn)高于野生諾卡氏菌,說(shuō)明了異源多拷貝表達(dá)相比野生天然宿主表達(dá)具有明顯優(yōu)勢(shì)。王麗燕等[25]在BL21(DE3)中表達(dá)Klebsiellaoxytoca來(lái)源的腈水合酶,考察了不同拷貝數(shù)質(zhì)粒對(duì)腈水合酶表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)蛋白濃度(g/L)和粗酶活力(U/L)隨著拷貝數(shù)的提高具有增加。使用pCDFDuet或者pETDuet質(zhì)粒(拷貝數(shù)15～20)比使用pACYCDuet質(zhì)粒(拷貝數(shù)10～12) 單位蛋白的粗酶活力(U/g)也隨質(zhì)粒拷貝數(shù)增加而提高,但是使用高拷貝質(zhì)粒pRSFDuet (拷貝數(shù)100～200) 卻對(duì)提高酶表達(dá)效果并不明顯。因此,優(yōu)化質(zhì)?？截悢?shù)是提高酶異源表達(dá)量的簡(jiǎn)單可行的辦法。

腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)在診斷心力衰竭、調(diào)節(jié)血壓等方面有很大的醫(yī)學(xué)作用,尤其是在診斷是否為心力衰竭患者方面,已成為公認(rèn)的診斷心力衰竭的血漿標(biāo)志物[26]。異源宿主表達(dá)是一種簡(jiǎn)便高效合成BNP的有效方法。易俊波等[27]在大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)中利用質(zhì)粒pCW111異源表達(dá)了BNP。作者在pCW111上分別克隆單個(gè)和兩個(gè)BNP的基因表達(dá)盒。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)BNP的表達(dá)量隨著目標(biāo)基因拷貝數(shù)增加,菌體總蛋白占比從單拷貝的8.12%增加到兩拷貝的9.94%,這也預(yù)示了利用多拷貝質(zhì)粒進(jìn)一步增加BNP的潛力。

紫黃素 (violaxanthin) 是一種存在于高等植物和微藻中重要的天然葉黃素,且被證實(shí)具有抗氧性、抗癌等生物活性,因而該物質(zhì)在化妝品、藥品等鄰域具有潛在的應(yīng)用[28]。紫黃素在微藻中的含量可變的,它會(huì)受到外部環(huán)境(如光照強(qiáng)度)的影響[29]。將合成紫黃素關(guān)鍵合成途徑引入工程菌,通過(guò)代謝工程改造構(gòu)建高產(chǎn)菌,則可以克服上述缺點(diǎn)。DONG等[30]發(fā)現(xiàn)嘗試將催化合成紫黃素的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(zeaxanthin epoxidase,ZEP)基因克隆到不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒上轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá),發(fā)現(xiàn)低拷貝質(zhì)粒(pSC101 ori)效果最好,紫黃素產(chǎn)量相比用高拷貝質(zhì)粒(pMB1 ori)提高了195%(圖1)。該研究說(shuō)明了并非質(zhì)粒拷貝數(shù)越高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量越高,這可能跟高拷貝質(zhì)粒引起的細(xì)胞負(fù)擔(dān)有關(guān)[31]。

A-紫黃質(zhì)合成途徑;B-使用不同的質(zhì)粒表達(dá)ZEP并應(yīng)用于類胡蘿卜素的合成

2.1.2 在谷氨酸棒桿菌中調(diào)控質(zhì)?？截悢?shù)的應(yīng)用

紫色桿菌素是一種藍(lán)紫天然色素,具有抗腫瘤、抗致病菌等多種活性,在食品、印染、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)都有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[32]。產(chǎn)生該色素的天然菌種多為條件致病菌且難于培養(yǎng),由于紫色桿菌素的前體物質(zhì)為色氨酸,利用高產(chǎn)氨基酸的異源谷氨酸棒桿菌合成該色素成為一種很好的選擇。盧丹妮等[33]在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了紫色桿菌素的合成途徑。研究發(fā)現(xiàn),基于pTET3的低拷貝重組質(zhì)粒 (p15A復(fù)制子,拷貝數(shù)～6) 比基于pEC-XK99E的高拷貝重組質(zhì)粒 (rep/ColE復(fù)制子,拷貝數(shù)～360)能夠使谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)紫色桿菌素的產(chǎn)量提高35.1%。該結(jié)果也可能跟前述高拷貝質(zhì)粒引起的細(xì)胞負(fù)擔(dān)有關(guān)。

血紅蛋白廣泛存在于大豆、玉米等植物中,該含有血紅素的蛋白質(zhì)可被用作顏色增強(qiáng)劑[34]、色素添加劑[35]等。植物血紅蛋白在作為食品添加劑方面具有巨大的價(jià)值,且利用微生物可持續(xù)生產(chǎn)血紅蛋白是一種有效途徑。WANG等[36]在谷氨酸棒桿菌中實(shí)現(xiàn)了植物來(lái)源血紅蛋白的高效合成。該研究者們對(duì)調(diào)控質(zhì)粒拷貝數(shù)相關(guān)的起始蛋白編碼基因copA進(jìn)行了突變,獲得了pXMJ19質(zhì)?？截悢?shù)提高的突變體:copAC1033T,copAC1033 del,copAC1032A,copAC1033G,對(duì)應(yīng)測(cè)定出的拷貝數(shù)分別為107、107、250、318;而表達(dá)野生copA時(shí)pXMJ19質(zhì)?？截悢?shù)僅為11。蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,在一定范圍內(nèi)蛋白表達(dá)量與拷貝數(shù)呈正相關(guān),當(dāng)質(zhì)?？截悢?shù)從11增加107,血紅蛋白表達(dá)量增加約2倍,但繼續(xù)增加質(zhì)?？截悢?shù)反而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。

2.2 調(diào)控質(zhì)?？截悢?shù)在真核生物合成生物學(xué)中的應(yīng)用

2.2.1 在釀酒酵母中調(diào)控質(zhì)粒拷貝數(shù)的應(yīng)用

三乙酸內(nèi)酯 (triacetic acid lactone,TAL) 是一種簡(jiǎn)單的聚酮化合物,可在酵母中通過(guò)非洲菊III型2-吡喃酮合酶 (2-PS)從乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成,被認(rèn)為是一種可轉(zhuǎn)化為多種高價(jià)值化合物的大宗化學(xué)品[37]。YOCUM等[38]通過(guò)酵母過(guò)氧化物酶體表面展示技術(shù),將TAL合成相關(guān)3個(gè)酶錨定于細(xì)胞質(zhì)一面,充分利用過(guò)氧化酶體流出的乙酰-CoA代謝流合成TAL。研究表明同時(shí)利用高拷貝質(zhì)粒(2 μm)攜帶的自由酶加上低拷貝質(zhì)粒(CEN/ARS4)攜帶的錨定酶,比僅利用高拷貝自由酶或者低拷貝錨定酶,TAL產(chǎn)量分別提高了3.2倍和5.9倍。

色醇是一種源自L-色氨酸的代謝產(chǎn)物,表現(xiàn)出廣泛的生物活性,并且作為一種關(guān)鍵的藥物前體,色醇及其衍生物化學(xué)方式轉(zhuǎn)化為眾多具有藥用價(jià)值的化合物。我們的研究表明色醇可以通過(guò)釀酒酵母以葡萄糖為碳源合成。分別用基因組整合、低拷貝質(zhì)粒(CEN/ARS4)或高拷貝質(zhì)粒(2 μm)表達(dá)限速步驟 (TRP2S65R,S76L),發(fā)現(xiàn)低拷貝質(zhì)粒效果最好,基因組整合次之,高拷貝質(zhì)粒效果最差。這說(shuō)明色醇的最終產(chǎn)量是基因表達(dá)量和細(xì)胞負(fù)擔(dān)兩個(gè)因素平衡的結(jié)果 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。

2.2.2 在畢赤酵母中調(diào)控質(zhì)?？截悢?shù)的應(yīng)用

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是HBV的主要特征蛋白,可以作為感染HBV的診斷指標(biāo),在減少HBV感染率且消滅乙肝方面作用很大[39]。乙肝疫苗生產(chǎn)成本高,構(gòu)建多拷貝質(zhì)粒并在畢赤酵母中高效表達(dá)乙型肝炎表面抗原能減低疫苗成本。實(shí)驗(yàn)表明,乙型肝炎表面抗原在畢赤酵母中的表達(dá)量與質(zhì)?？截悢?shù)呈正相關(guān),質(zhì)?？截悢?shù)從4增加到6,HBsAg在菌體破碎液的含量增加了30%,且拷貝數(shù)的提高并未對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[40]。

3 通過(guò)合成生物學(xué)手段改造質(zhì)粒以精確調(diào)控拷貝數(shù)范圍

綜上研究表明,利用天然復(fù)制子序列,可以構(gòu)建具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒。構(gòu)建起一系列不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒合集,可以廣泛用于優(yōu)化關(guān)鍵基因表達(dá)量,進(jìn)而提高生物催化效率,提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。前述研究進(jìn)展也表明,并非質(zhì)?？截悢?shù)越高,目標(biāo)產(chǎn)物也越高,這也凸顯出優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒拷貝數(shù)的必要性。

然而,利用天然復(fù)制子構(gòu)建的質(zhì)粒,拷貝數(shù)并不是均勻分散的,還存在著動(dòng)態(tài)調(diào)控范圍小等問(wèn)題。特別是對(duì)于真核酵母體系,常用的復(fù)制起點(diǎn)只有CEN6/ARS4和2 μm,其拷貝數(shù)上限僅為30左右 (表1)。為了克服上述局限,近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究者充分利用合成生物學(xué)及分子生物學(xué)的前沿技術(shù)手段,構(gòu)建出了質(zhì)粒拷貝數(shù)調(diào)控分布更均勻、拷貝數(shù)上限更高、可調(diào)控范圍更大的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)應(yīng)用于優(yōu)化生物催化,顯著提高了生物合成的催化效率 (表4)。

表4 利用合成生物學(xué)技術(shù)優(yōu)化質(zhì)粒拷貝數(shù)系統(tǒng)提高生物催化效率

3.1 調(diào)控質(zhì)?？截悢?shù)在真核生物合成生物學(xué)中的應(yīng)用

大腸桿菌中應(yīng)用廣泛的、含有ColE1復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒,其拷貝數(shù)的控制通過(guò)兩種RNA實(shí)現(xiàn):a)引發(fā)RNA (RNA-p),它以順式方式充當(dāng)復(fù)制起點(diǎn)附近的引物;b)抑制RNA (RNA-i),其轉(zhuǎn)錄為RNA-p的反義序列,并通過(guò)在原點(diǎn)附近雜交之前與引發(fā) RNA 結(jié)合而發(fā)揮反式作用,RNA-p/RNA-i的比例決定著質(zhì)?？截悢?shù)[9]。根據(jù)上述機(jī)制,ROUCHES等[8]通過(guò)調(diào)控RNA-p或RNA-i的表達(dá)量,構(gòu)建起了拷貝數(shù)可變的2個(gè)ColE1質(zhì)粒系統(tǒng)。在第一個(gè)系統(tǒng)中,研究者將Ptet啟動(dòng)子設(shè)置于RNA-p基因前,通過(guò)添加無(wú)水四環(huán)素 (aTc) 控制RNA-p表達(dá)量;而RNA-i的表達(dá)受ColE1復(fù)制子序列自帶啟動(dòng)子Pi控制。實(shí)驗(yàn)測(cè)定在aTc添加濃度為0～100 ng/mL,該系統(tǒng)質(zhì)粒拷貝數(shù)為1.4～50/細(xì)胞。在第二個(gè)系統(tǒng)中,研究者以ColE1質(zhì)粒上控制RNA-p的天然啟動(dòng)子Pp和控制RNA-i的天然啟動(dòng)子Pi的-35和-10盒子上引入定點(diǎn)和隨機(jī)突變,構(gòu)建出了1 194個(gè)RNA-p/RNA-i比例不同(質(zhì)粒拷貝數(shù)不同)基因文庫(kù)。序列及拷貝數(shù)測(cè)定表明質(zhì)粒拷貝數(shù)范圍為1～800/細(xì)胞,并且此系統(tǒng)還避免了外源添加aTc。該系統(tǒng)被用于測(cè)定質(zhì)?？截悢?shù)與細(xì)胞負(fù)擔(dān)的相關(guān)性,表明每個(gè)質(zhì)粒會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)0.063%的代謝負(fù)擔(dān)。上述2個(gè)系統(tǒng)還被應(yīng)用于了優(yōu)化生物合成途徑提高紫色桿菌素產(chǎn)量。第一個(gè)系統(tǒng)因?yàn)榭截悢?shù)變化范圍小、拷貝數(shù)較低,紫色桿菌素產(chǎn)量隨aTc添加量的增加而增長(zhǎng);第二個(gè)系統(tǒng)由于過(guò)高質(zhì)?？截悢?shù)帶來(lái)的代謝負(fù)擔(dān)逐漸加重,紫色桿菌素的產(chǎn)量在質(zhì)粒拷貝數(shù)～300時(shí)出現(xiàn)峰值。

p15A復(fù)制子和ColE1復(fù)制子機(jī)制類似。LI等根據(jù)p15A的復(fù)制原理,巧妙設(shè)計(jì)一套基因回路,構(gòu)建了受p-香豆酸誘導(dǎo)調(diào)控拷貝數(shù)的質(zhì)粒系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,該系統(tǒng)能夠動(dòng)態(tài)調(diào)控代謝通路中關(guān)鍵基因拷貝數(shù),平衡細(xì)胞生長(zhǎng)與合成目標(biāo)產(chǎn)物p-香豆酸的代謝通量。與質(zhì)?？截悢?shù)不變的靜態(tài)系統(tǒng)相比,該動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)p-香豆酸搖瓶產(chǎn)量提高78%,達(dá)到1.69 g/L[42](圖2)。

A-RNAI影響質(zhì)粒復(fù)制機(jī)理;B-基因拷貝動(dòng)態(tài)控制在p-香豆酸生物合成中的應(yīng)用

JOSHI等[45]近期開(kāi)發(fā)了原核系統(tǒng)中靈活的、能隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)質(zhì)粒拷貝數(shù)的新系統(tǒng)TULIP (TUnable Ligand Inducible Plasmid)。TULIP的設(shè)計(jì)基于pSC101復(fù)制起點(diǎn)的自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制設(shè)計(jì),與前述ColE1復(fù)制機(jī)制不同。pSC101復(fù)制子通過(guò)RepA調(diào)控蛋白單體-二聚體的平衡使質(zhì)粒拷貝數(shù)控制在3左右。該研究者們利用RepA突變體,設(shè)計(jì)了新的基因回路,使pSC101固定拷貝數(shù)系統(tǒng)變成了受異丙苯酸誘導(dǎo)調(diào)控、拷貝數(shù)動(dòng)態(tài)調(diào)控范圍達(dá)到20倍 (3～60拷貝/細(xì)胞)的新系統(tǒng)。進(jìn)一步的表征表明,TULIP在常用的大腸桿菌菌株(NEBStable、DH10B、NEBExpress、BW25113和MG1655) 和生長(zhǎng)培養(yǎng)基(M9-葡萄糖、M9-甘油、Lysogeny Broth和Super Optimal Broth)中表現(xiàn)穩(wěn)定。除了異丙苯酸誘導(dǎo)系統(tǒng),TULIP也被改造為由其他小分子誘導(dǎo)體系,如N-(3-氧代-己酰基)-L-高絲氨酸內(nèi)酯[N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone,AHL)],香草酸,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

3.2 利用合成生物學(xué)技術(shù)優(yōu)化真核質(zhì)?？截悢?shù)系統(tǒng)

二氫青蒿酸能通過(guò)獨(dú)立且自發(fā)的代謝途徑形成青蒿素[46],且由于青蒿素的醫(yī)藥價(jià)值不斷被發(fā)現(xiàn),對(duì)于青蒿素合成的研究不斷深入。其中利用二氫青蒿酸在釀酒酵母中異源表達(dá),從而進(jìn)一步合成青蒿素在提高產(chǎn)量方面取得了較好的效果。曾薄軒研究發(fā)現(xiàn),用傳統(tǒng)的2 μm多拷貝質(zhì)粒表達(dá)的關(guān)鍵基因ADS、CYP71AV1和DBR2不夠穩(wěn)定高效,進(jìn)而影響二氫青蒿酸產(chǎn)量[42]?？梢詮?fù)制2 μm多拷貝質(zhì)粒的酵母自身還含有內(nèi)源性的野生2 μm質(zhì)粒 (wt 2 μm質(zhì)粒),兩者相比wt 2 μm質(zhì)粒擁有更高的拷貝數(shù),且在不含任何酵母生長(zhǎng)必須基因的前提下,能隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定遺傳。因此,在不破壞穩(wěn)定遺傳所需必須基因的基礎(chǔ)上,作者基于wt 2 μm質(zhì)粒,設(shè)計(jì)了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將外源基因插入STB與RAF1基因之間,開(kāi)發(fā)出了pE 2 μm多拷貝質(zhì)粒系統(tǒng),可以方便進(jìn)行外源基因克隆。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,利用pE 2 μm多拷貝質(zhì)粒表達(dá)關(guān)鍵基因,相比傳統(tǒng)2 μm質(zhì)粒系統(tǒng),在有篩選壓力和無(wú)篩選壓力的條件下,二氫青蒿酸產(chǎn)量分別提高到了65%和 3.4倍。類似的,YANG等[47]利用傳統(tǒng)克隆方法在wt 2 μm質(zhì)粒REP1啟動(dòng)子和RAF1啟動(dòng)子之間插入了多克隆位點(diǎn),方便進(jìn)行外源基因克隆。研究者們將酪醇合成途徑基因引入該系統(tǒng),酪醇相比基于傳統(tǒng)2 μm質(zhì)粒的體系也有提高。

釀酒酵母常用質(zhì)粒系統(tǒng)具有拷貝數(shù)較低、動(dòng)態(tài)變化范圍窄的缺點(diǎn),很大程度上限制了更多的應(yīng)用。相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),酵母質(zhì)粒拷貝數(shù)可以調(diào)控其篩選標(biāo)記基因/蛋白的表達(dá)量。CHEN等[43]發(fā)現(xiàn)通過(guò)將泛素/N-降解決定子標(biāo)簽 (ubi-tag)融合到篩選標(biāo)記N可以破壞標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性,進(jìn)而增加載體的拷貝數(shù)和同一載體目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。這種增加質(zhì)?？截悢?shù)的方法使報(bào)告蛋白LacZ的活性最高增加100%,將廣藿香醇合成途徑構(gòu)建進(jìn)該體系,其產(chǎn)量提高了3倍。

LIAN等[14]隨后系統(tǒng)性利用截短篩選標(biāo)記基因啟動(dòng)子的方法來(lái)弱化標(biāo)記蛋白表達(dá)量,進(jìn)而增加質(zhì)?？截悢?shù)。他們發(fā)現(xiàn)對(duì)某些篩選標(biāo)記 (HIS3,URA3,KanR,HygR),2 μm多拷貝質(zhì)粒隨篩選標(biāo)記啟動(dòng)子截短而增加;但是對(duì)另外一些篩選標(biāo)記 (TRP1,LEU2)則無(wú)此相關(guān)性,最高拷貝數(shù)達(dá)到了100 拷貝/細(xì)胞。KanR和HygR的系統(tǒng)隨即被用作胡蘿卜素及n-丁醇代謝途徑的優(yōu)化,產(chǎn)量較野生型最高增加10倍和100倍。類似通過(guò)弱化篩選標(biāo)記基因表達(dá)、進(jìn)而增加篩選壓力來(lái)提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的方法還用于了重要天然產(chǎn)物靈芝酸[44]。

近期,本課題組將上述拷貝數(shù)增加且可調(diào)控的方法應(yīng)用到了雙質(zhì)粒表達(dá)真菌I型聚酮合酶的體系中,用于優(yōu)化產(chǎn)量極低的間苯二酚類聚酮,因?yàn)樵擃惢衔飿O具藥用價(jià)值[32]。通過(guò)組合優(yōu)化,我們將新發(fā)現(xiàn)的化合物產(chǎn)量提高最高10倍(圖3)。這加速了此類微量產(chǎn)物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定,進(jìn)而促進(jìn)了結(jié)構(gòu)新穎的非天然真菌聚酮的合成以及加深了對(duì)I型真菌聚酮合酶催化機(jī)制的理解。

A-組合拷貝數(shù)工程優(yōu)化非天然產(chǎn)物合成;B-通過(guò)組合調(diào)節(jié)還原性聚酮合酶以及非還原性聚酮合酶的質(zhì)?？截悢?shù)來(lái)優(yōu)化生產(chǎn)非天然產(chǎn)物

同時(shí)有實(shí)驗(yàn)證明,在截短啟動(dòng)子前提下,不同濃度的抗生素也會(huì)影響質(zhì)粒的拷貝數(shù),且啟動(dòng)子截短程度較高的對(duì)抗生素濃度變化更加敏感[14]。結(jié)合啟動(dòng)子截短工程和抗生素的不同濃度,可以構(gòu)建拷貝數(shù)變化梯度更大的質(zhì)粒系統(tǒng)。

4 總結(jié)與展望

綜上,天然復(fù)制子、拷貝數(shù)不同的質(zhì)粒,已經(jīng)廣泛用于優(yōu)化關(guān)鍵基因表達(dá)量,進(jìn)而提高生物催化效率。然而,天然復(fù)制子系統(tǒng)也具有拷貝數(shù)分布區(qū)間不均勻、動(dòng)態(tài)調(diào)控范圍小等局限,這些問(wèn)題對(duì)于真核酵母體系尤為突出。近年來(lái),為了克服上述局限,國(guó)內(nèi)外研究者充分利用合成生物學(xué)及分子生物學(xué)的前沿技術(shù)手段,設(shè)計(jì)并構(gòu)建出了質(zhì)?？截悢?shù)調(diào)控分布更均勻、拷貝數(shù)上限更高、可調(diào)控范圍更大的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)應(yīng)用于優(yōu)化生物催化,顯著提高了生物合成的催化效率。但總體而言,目前相關(guān)研究不是很多,尤其在真核生物合成生物學(xué)領(lǐng)域,這需要對(duì)質(zhì)粒復(fù)制機(jī)制更深入研究和理解?？梢灶A(yù)見(jiàn),上述領(lǐng)域的進(jìn)一步進(jìn)展,可以為合成生物學(xué)提供更多解決方案。