丁歡歡,黃思怡,周秋香,卜京,施超越,李漢廣

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,應(yīng)用微生物研究所,江西 南昌,330045)

2(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌,330045)

傳統(tǒng)化石燃料的使用在給經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來無限動(dòng)力的同時(shí),也給全球環(huán)境帶來如溫室效應(yīng)等問題,隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷提高,尋找綠色、環(huán)保的可替代燃料成為全球能源領(lǐng)域優(yōu)先發(fā)展的戰(zhàn)略[1-3]。生物丁醇是以淀粉、糖蜜等可再生原料為底物通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的物質(zhì)[4-8],因此在燃燒過程中不會(huì)產(chǎn)生新的二氧化碳,被認(rèn)為是一種碳中性燃料,而且丁醇具有密度高、揮發(fā)性低、腐蝕性小等優(yōu)點(diǎn),近年來成為全球生物質(zhì)能源領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[9-13]。

雖然加強(qiáng)生物丁醇的研究有助于實(shí)現(xiàn)“碳達(dá)峰、碳中和”雙碳目標(biāo),然而丁醇對(duì)生產(chǎn)菌的毒害作用會(huì)導(dǎo)致丙酮丁醇(acetone,butanol,and ethanol,ABE)發(fā)酵過程中出現(xiàn)低產(chǎn)物濃度及低生產(chǎn)效率現(xiàn)象[14]。有研究表明,在進(jìn)行ABE發(fā)酵時(shí)當(dāng)發(fā)酵液中的丁醇質(zhì)量濃度達(dá)13.0～14.0 g/L時(shí),菌體的生長會(huì)受到抑制,而當(dāng)丁醇質(zhì)量濃度達(dá)到或超過20.0 g/L時(shí),細(xì)胞代謝會(huì)被迫停止[15-16]。因此,如何通過發(fā)酵過程調(diào)控等手段提高ABE的生產(chǎn)強(qiáng)度或通過誘變等方法來提高生產(chǎn)菌株的丁醇耐受性以減輕丁醇帶來的傷害是ABE發(fā)酵過程研究的焦點(diǎn)。萃取發(fā)酵[17-18]、氣提發(fā)酵[19]、固定化發(fā)酵[20]等均已成功用于ABE發(fā)酵,然而研究發(fā)現(xiàn)此時(shí)的丁醇濃度往往處于抑制濃度之下,或其生產(chǎn)規(guī)模仍處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模,難以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。若能提高生產(chǎn)菌株的丁醇耐受性,有可能使生產(chǎn)菌在較高丁醇環(huán)境中仍能持續(xù)分泌目標(biāo)產(chǎn)物[21-22]。各國科學(xué)工作者就如何提高ABE發(fā)酵菌株的丁醇耐受性進(jìn)行了大量研究,各物理化學(xué)誘變、分子生物學(xué)育種、合成生物學(xué)等均已用于高丁醇耐受性丁醇生產(chǎn)菌株的選育,成功地提高了微生物細(xì)胞的丁醇耐受性[23-24]。本文系統(tǒng)介紹了近年來高丁醇耐受性丁醇生產(chǎn)菌株選育的研究進(jìn)展,以期為自身及其他高抗逆性微生物菌株的選育提供可參考的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1 傳統(tǒng)誘變育種及適應(yīng)性生物進(jìn)化獲得丁醇耐受性菌株

1.1 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室常用的育種技術(shù)之一,指采用化學(xué)物質(zhì)(如烷化劑、移碼突變劑、堿基類似物等)對(duì)微生物進(jìn)行處理,從而達(dá)到改變其性狀為目的的方法[25]?；瘜W(xué)誘變劑的特點(diǎn)之一是專一性強(qiáng),即其在處理過程中往往只作用于基因的某個(gè)部位,但是對(duì)其他部位沒有作用。而且由于大多數(shù)化學(xué)誘變劑都具有生物學(xué)毒性、易致癌和揮發(fā),在使用時(shí)應(yīng)避免直接與皮膚接觸,并嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)則。亞硝基胍(nitroso-guanidin,NTG)[26]、甲基磺酸乙酯[27]、氯化鋰[28]等試劑已成功用于高丁醇耐受性菌株選育。雖然化學(xué)誘變技術(shù)是一種傳統(tǒng)且經(jīng)典改變生產(chǎn)菌性能的方法,但由于其只作用于基因的某個(gè)特定部位,若連續(xù)使用會(huì)導(dǎo)致誘變效率大大降低,而且誘變劑往往具有致癌和揮發(fā)性,因此在實(shí)際的應(yīng)用中受到一定的限制。

1.2 物理誘變

物理誘變指利用各種物理因素與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)特別是大分子核酸和蛋白質(zhì)反應(yīng),引起分子結(jié)構(gòu)改變。傳統(tǒng)的物理誘變以輻射誘變(如X-射線、γ-射線、紫外等)最為常見,然而傳統(tǒng)的物理誘變?cè)趹?yīng)用過程中雖然具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、成本低等優(yōu)點(diǎn),但還是會(huì)存在如操作過程周期長、工作量大以及難以有效控制變異方向等問題,因此新型物理誘變技術(shù)包括低能離子束注入、重離子束輻射、常壓室溫等離子誘變等[29-30]的出現(xiàn)逐漸成為物理誘變技術(shù)的主流。

離子束是指元素的離子經(jīng)高能加速器加速電離成離子后,獲得一束具有能量的帶電粒子放射線。20世紀(jì)80年代中期,余增亮等[31]首次提出了通過低能離子束進(jìn)行遺傳改良的方法,開辟了離子束在生物技術(shù)上應(yīng)用的新途徑。該技術(shù)與傳統(tǒng)的物理誘變相比具有突變率更高、成本低廉等特點(diǎn)。本課題組通過低能離子束注入處理ClostridiumbeijerinckiiL175,最終獲得突變菌株IB26,其與初始菌株相比,丁醇產(chǎn)率和丁醇耐受性顯著提高[1]。重離子通常是指原子序數(shù)大于2的原子(碳、氮、氖、硼等)被剝掉或部分剝掉外圍電子后的帶正電的原子核,將重離子通過加速器裝置加速而形成的具有能量的射線就是重離子束,其同樣具有改變細(xì)胞遺傳質(zhì)的作用。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變指在室溫常壓條件下,使用高濃度氦氣產(chǎn)生大量的等離子體射流使細(xì)胞DNA單鏈或雙鏈發(fā)生斷裂,損傷微生物的遺傳物質(zhì) DNA,引起微生物突變,與傳統(tǒng)物理誘變相比,ARTP誘變具有易人工控制、誘變效率高等優(yōu)點(diǎn)。本課題組采用ARTP誘變技術(shù)對(duì)Clostridiumacetobutylicum進(jìn)行誘變處理,獲得了突變菌株ART18,其丁醇耐受性及發(fā)酵性能均有較大改善[32]。上述新型物理誘變技術(shù)與傳統(tǒng)物理誘變相比,所獲菌株的突變率高、損傷率低、成本低、易操控,解決了傳統(tǒng)誘變轉(zhuǎn)化率低、成本高、難操縱等問題,若能進(jìn)一步提高誘變后篩選的效率,該方法有望成為物理誘變技術(shù)獲得高抗逆菌株主要方向。

1.3 適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化及復(fù)合誘變

適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化(adaptive laboratory evolution,ALE)是在特定環(huán)境條件下,人工模擬自然進(jìn)化中的變異和選擇過程,借助人工選擇壓力促使菌株完成適應(yīng)性定向進(jìn)化,最后從進(jìn)化群體中獲得性能提高的菌株的一種方法[33-34]。復(fù)合誘變是通過2種或多種誘變劑對(duì)菌株進(jìn)行誘變的一種方式。在微生物育種過程中,單因素誘變技術(shù)雖可以獲得較優(yōu)良的突變菌株,但是由于存在突變譜簡(jiǎn)單、易產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”等問題,可能會(huì)對(duì)突變菌株帶來不利影響[35]。因此,實(shí)際育種過程中,經(jīng)常采用復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行處理,通過誘變劑之間的協(xié)同調(diào)控來彌補(bǔ)單一誘變的缺陷,獲得更為豐富的突變菌庫。本課題組利用丁醇脅迫馴化及ARTP誘變技術(shù)對(duì)ClostridiumbeijerinckiiL8進(jìn)行復(fù)合誘變處理,獲得突變菌株Y10,研究發(fā)現(xiàn)其能耐受25.0 g/L丁醇脅迫環(huán)境;而且當(dāng)以混糖為發(fā)酵底物時(shí),丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為10.51 g/L和12.16 g/L,相較于原始菌株分別提高了38.6%及33.5%[36]。上述誘變方式均為不定向誘變,具有不確定因素,產(chǎn)量和耐受性雖然相對(duì)而言有所提高,但是提高數(shù)量有限,生產(chǎn)菌株的丁醇耐受與產(chǎn)量仍然是ABE工業(yè)進(jìn)程的瓶頸之一,因此,有必要通過其他手段克服這一瓶頸,推動(dòng)ABE產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

2 采用合成生物學(xué)技術(shù)獲得丁醇耐受性菌株

合成生物學(xué)這一概念最早在1911年由法國科學(xué)家 Strphane Leduc首次提出。合成生物學(xué)近年來逐漸發(fā)展成為一交叉學(xué)科,通過結(jié)合分子和細(xì)胞生物學(xué)、進(jìn)化系統(tǒng)學(xué)、生物化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科技術(shù),將工程原理應(yīng)用于研究和改造生命系統(tǒng),達(dá)到創(chuàng)造、編程和控制細(xì)胞行為[37]。近幾十年來,合成生物學(xué)在化工、能源、農(nóng)業(yè)、環(huán)境和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展,越來越多的化合物可以通過改造培養(yǎng)的微生物獲得,人們正在努力實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的高效和精確改造。

2.1 基因編輯技術(shù)

多種合成生物學(xué)技術(shù)的引入為提高生產(chǎn)菌的丁醇耐受性改造迎來新的發(fā)展。促進(jìn)了產(chǎn)丁醇微生物的基因編輯技術(shù)的開發(fā),目前已開發(fā)的用于產(chǎn)丁醇微生物的基因編輯技術(shù)主要有:反義RNA與RNA干擾;ClosTron;CRISPR/Cas;單堿基編輯技術(shù),此4種基因編輯的基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。

表1 基因編輯工具的基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)

從表1可知,反義RNA是指mRNA與靶RNA通過堿基互補(bǔ)結(jié)合的方式形成雙鏈,從而抑制相關(guān)基因,使其不表達(dá)的方法,反義RNA主要分為DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯3個(gè)方面,抑制DNA的復(fù)制、阻止轉(zhuǎn)錄、抑制mRNA的翻譯。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比,具有操作簡(jiǎn)單、安全性高、適應(yīng)廣泛。RNA 干擾是在反義RNA的基礎(chǔ)上形成的一種全新技術(shù),有高效特異性、可傳播、可遺傳性等特點(diǎn),在基因敲除、遺傳疾病治療等方面應(yīng)用廣泛。ClosTron是一種常用于梭菌的基因失活工具,它依賴于二型內(nèi)含子的特異性插入,非常適合梭菌的基因重組。規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)是絕大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌的可遺傳的免疫系統(tǒng),該系統(tǒng)由CRISPR序列和編碼Cas基因組成,CRISPR系統(tǒng)主要分三類,其中第二類中的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1具有研究應(yīng)用的前景[38-39]。單堿基編輯技術(shù)是在CRISPR/Cas9技術(shù)基礎(chǔ)上衍生出的一種精準(zhǔn)定點(diǎn)的基因編輯技術(shù),主要分為2種:胞嘧啶單堿基編輯(cytosine bases editor,CBE)技術(shù);腺嘌呤單堿基編輯(adenine bases editor,ABE)技術(shù)[40],與常規(guī)的基因編輯技術(shù)比較,單堿基編輯技術(shù)具有效率高、安全性高、副產(chǎn)物相對(duì)更少等優(yōu)勢(shì),在生物領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.2 遺傳改造策略

在各種限制丁醇合成的因素中,丁醇對(duì)細(xì)胞的毒性是導(dǎo)致出現(xiàn)低生產(chǎn)量與產(chǎn)率的主要原因之一,丁醇對(duì)微生物細(xì)胞的抑制或毒性作用主要分為2個(gè)方面:a)改變細(xì)胞膜原有結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能,使物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受到影響;b)破壞了細(xì)胞原來的代謝途徑,造成細(xì)胞生長或產(chǎn)物合成受到影響[51-55]。因此,為減少丁醇對(duì)細(xì)胞生長或產(chǎn)物合成帶來的不利影響,目前利用基因工程手段對(duì)菌株進(jìn)行改造主要從以下2個(gè)方面展開:a)對(duì)丁醇合成途徑進(jìn)行改造,或使碳流代謝更多的轉(zhuǎn)向丁醇合成;b)過表達(dá)細(xì)胞中一些抗逆基因,提高菌株對(duì)丁醇的耐受能力,從而提高溶劑產(chǎn)量。

2.2.1 細(xì)胞膜相關(guān)基因改造

細(xì)胞膜具有保護(hù)作用,同時(shí)也是細(xì)胞控制物質(zhì)進(jìn)出的滲透屏障。微生物細(xì)胞膜中脂肪酸的調(diào)節(jié)不僅對(duì)維持細(xì)胞膜的完整性至關(guān)重要,而且對(duì)膜結(jié)合蛋白也有重要影響[56]。微生物細(xì)胞通過修飾磷脂雙分子層中的脂肪酸,可以改變細(xì)胞膜的組成,保持穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu),防止溶劑的滲透,從而使溶劑的耐受性提高[57]。熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)又稱分子伴侶,當(dāng)微生物處在脅迫環(huán)境時(shí),HSPs會(huì)大量表達(dá)并積累,參與應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng),進(jìn)而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),抵抗不良環(huán)境產(chǎn)生的侵害[58-59],LUAN等[60]研究發(fā)現(xiàn)通通過過表達(dá)Thermoanaerobactertengcongensis的groESL基因,提高了微生物細(xì)胞的應(yīng)激耐受性,從而提高丁醇產(chǎn)量。外排的保護(hù)機(jī)制是基于主動(dòng)從細(xì)胞中排出有毒化合物,外排量的增加可以改變代謝通量,促進(jìn)生物轉(zhuǎn)化途徑[61]。SEDLAR等[62]研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonasputida對(duì)丁醇等小分子具有突出的耐受性,作者推測(cè)外排泵可能在這種穩(wěn)健性中發(fā)揮重要作用,過表達(dá)Pseudomonasputida外排泵基因srpB,外排泵將更多的抑制物小分子運(yùn)輸?shù)桨?以保持微生物正常的代謝活動(dòng),從而改善細(xì)胞對(duì)丁醇的耐受性,顯著增加了菌株的魯棒性[63]。雙組分系統(tǒng)(two-component regulatory system,TCS)通常由膜蛋白結(jié)合的顯示信號(hào)調(diào)節(jié)的組氨酸激酶和對(duì)應(yīng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)底物組成,主要通過感應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)調(diào)節(jié)器來適應(yīng)不同的環(huán)境變化[64-65],Clostridiumacetobutylicum中的雙組分系統(tǒng)BtrK/BtrR基因可進(jìn)行多功能調(diào)控,通常會(huì)影響有關(guān)丁醇耐受的多個(gè)關(guān)鍵基因和相關(guān)代謝途徑,通過過表達(dá)BtrK/BtrR基因,能有效提高重組菌株的丁醇耐受性[66]。通過修復(fù)受損蛋白、有機(jī)溶劑外排胞外、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等方式均能有效提高菌株丁醇耐受性,上述研究結(jié)果可為今后產(chǎn)溶劑梭菌通過對(duì)細(xì)胞膜相關(guān)的基因改造來提高丁醇耐受性提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

2.2.2 糖酵解途徑的基因改造

ABE的發(fā)酵過程主要分為2個(gè)階段:產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期,目前對(duì)代謝途徑的改造重點(diǎn)集中在下游的代謝酶,對(duì)上游的研究相對(duì)較少,而糖酵解途徑則在產(chǎn)酸階段具有重要作用,當(dāng)糖酵解速率提高時(shí),會(huì)加速分泌乙酸,從而使ABE的代謝過程快速轉(zhuǎn)入到溶劑合成階段。在產(chǎn)酸期6-磷酸果糖激酶pfkA、丙酮酸激酶pykA是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,通過過表達(dá)這2個(gè)基因,能顯著增加細(xì)胞內(nèi)NADH、ATP的濃度,從而間接提高丁醇耐受性[67]。有研究表明對(duì)Clostridiumacetobutylicum進(jìn)行基因改造,將6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶編碼基因進(jìn)行過表達(dá),可有效提高突變菌株胞內(nèi)ATP和NADH濃度,此時(shí)菌株對(duì)丁醇的耐受性與ABE的發(fā)酵性能也相應(yīng)有所提升[68]。上述研究在產(chǎn)溶劑梭菌中實(shí)現(xiàn)了糖酵解途徑相關(guān)基因的過表達(dá),從而改變細(xì)胞中ATP和NADH的含量,提高了菌株對(duì)丁醇的耐受性,這對(duì)于產(chǎn)溶劑梭菌丁醇耐受性的遺傳改造十分重要。

2.2.3 轉(zhuǎn)錄因子定向改造

轉(zhuǎn)錄因子是指通過序列特異性方式結(jié)合DNA并且能激活或抑制其他基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。它的表達(dá)激活了幾個(gè)功能性抗性基因的同時(shí)表達(dá),從而提高了轉(zhuǎn)錄因子的水平,改善了生物體的抗性特性,與傳統(tǒng)的插入或增強(qiáng)單個(gè)功能性基因以改善特定抗性的方法相比,這是一種通過修改或增強(qiáng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來改善抵抗不良環(huán)境能力的更有效方法,能獲得同步的、全局的最優(yōu)效果。LI等[69]利用非靶向轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法探索ABE發(fā)酵培養(yǎng)條件下生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster,BGC)的表達(dá),通過對(duì)已鑒定的高表達(dá)ClostridiumsaccharoperbutylacetonicumN1-4 (Csa)nrps3基因進(jìn)行敲除得到突變菌株Δnrps3,其與野生菌株相比,在指數(shù)期表現(xiàn)出生長缺陷,轉(zhuǎn)錄組分析表明,該非核糖體肽合成酶基因與丁醇耐受性有關(guān)。雖然轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的修飾策略具有應(yīng)用靈活和易于調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的優(yōu)勢(shì),但精確識(shí)別基因組上特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合后最終如何參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。

2.3 組合策略獲得丁醇耐受性菌株

組合策略(combinatorial strategy)是指同時(shí)應(yīng)用2種及以上策略,以達(dá)到控制單一因素組合和疊加的效果,此策略比單因素具有更好的控制效果,節(jié)約了時(shí)間。通過旁系同源基因家族組合策略進(jìn)行多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化,能獲得丁醇耐受性增強(qiáng)的突變體,而且該共轉(zhuǎn)化組合策略可為快速探索同源家族基因在細(xì)胞生存、細(xì)胞生長和目標(biāo)產(chǎn)物代謝中的多樣性功能提供了可能[70]。工程菌株對(duì)丁醇耐受性的表型是由一個(gè)復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)控制,組合策略相對(duì)于單因素策略,更具有綜合性,可能會(huì)更好地調(diào)動(dòng)微生物生產(chǎn)的積極性和潛能,有助于富集工程菌耐丁醇的有益性狀,具有良好的發(fā)展前景。

3 問題與展望

隨著世界能源價(jià)格與供給的波動(dòng)以及人們環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷提高,以可再生原料生產(chǎn)能源物質(zhì)成為全球優(yōu)先發(fā)展的策略。雖然生物丁醇近年來成為生物質(zhì)能源領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),然而丁醇對(duì)生產(chǎn)菌的毒性作用導(dǎo)致丁醇合成效率的降低限制其大規(guī)模生產(chǎn),而提高生產(chǎn)菌的丁醇耐受性是解決這一困境有效途徑之一。本文系統(tǒng)回顧了近年提高菌株丁醇耐受性的各種策略,其中:a)通過物理、化學(xué)誘變及適應(yīng)性生物進(jìn)化獲得丁醇耐受菌株的方法雖然操作簡(jiǎn)單、效果明顯,但是存在盲目性大等缺點(diǎn);b)合成生物學(xué)的誕生使選育丁醇耐受菌株邁向了理性化的時(shí)代。通過相關(guān)基因的編輯和改造進(jìn)行定向突變,更具有目的性,并且更準(zhǔn)確有效,因此成為最重要的解決措施之一。另外提高丁醇耐受性并非操縱單個(gè)基因即可完成,需多個(gè)基因共同改造,但是,目前構(gòu)建耐受菌株的遺傳背景較為復(fù)雜,其機(jī)制不夠清晰,此方面有待進(jìn)一步深入研究;c)過表達(dá)正調(diào)控基因或敲除負(fù)調(diào)控基因也是目前激活沉默基因簇的有效手段,但因?yàn)楹芏喙I(yè)菌種遺傳操作難、生長速度慢等因素也不利于對(duì)菌種進(jìn)行遺傳改造。對(duì)丁醇耐受細(xì)菌應(yīng)用局限性的分析揭示了未來的研究應(yīng)側(cè)重于:a)將微生物耐受表型與特定利用相結(jié)合,以實(shí)現(xiàn)丁醇耐受性和生產(chǎn)之間的最佳平衡;b)未來的進(jìn)一步優(yōu)化可以通過使用動(dòng)態(tài)或基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型驅(qū)動(dòng)分析,因此跨物種代謝途徑,尤其是代謝物遞送,可以合理設(shè)計(jì)和調(diào)節(jié)更高的效率和魯棒性;c)隨著酶的定向進(jìn)化、反向代謝工程、基因組模型化等技術(shù)的進(jìn)步,人們可以采用更為廣泛的技術(shù)手段對(duì)丁醇生產(chǎn)菌進(jìn)行升級(jí)改造。因此有理由相信在不久的將來會(huì)有更多丁醇耐受性以及發(fā)酵性能均提高菌株的出現(xiàn),從而有力推動(dòng)丁醇發(fā)酵工業(yè)化的進(jìn)程。