周濤，陳志民，付麗紅，吳芳芳，王華珍，朱麗婷，葉宇茜，黃梅英

(麗水藍(lán)城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 麗水 323000)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)又名五氯苯酚，是一種持久性有機(jī)污染物，曾被用作殺蟲劑、抗菌劑和防腐劑等[1]，且價(jià)格便宜，曾經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被廣泛使用[2]。研究表明，五氯酚不僅化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，而且殘留期長，容易蓄積在水體、土壤中，并通過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，對動(dòng)物的甲狀腺功能、生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等均具有破壞作用[3-5]，目前已經(jīng)被包括我國在內(nèi)的許多國家禁止使用。

當(dāng)前，有關(guān)五氯酚殘留量的檢測方法主要涉及食品和農(nóng)產(chǎn)品等報(bào)道較多，主要有高效液相法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等[6-18]。氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法需要衍生才能上機(jī)測定，前處理時(shí)間較長且成本較高，液相法前處理繁瑣，易產(chǎn)生假陽性，不利于樣品的檢測，而液相色譜-質(zhì)譜法具有前處理簡單、靈敏度高、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，是測定五氯酚殘留量的優(yōu)選方案。為此，本文結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜抗干擾強(qiáng)、靈敏度高、無需衍生等一系列優(yōu)點(diǎn)，采用液液分配提取，內(nèi)標(biāo)法定量，建立了蜂蜜中五氯酚殘留量的快速檢測方法，該方法采用氨水作堿化劑，減小了儀器受污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)減少了前處理步驟，降低了耗材使用成本，使實(shí)驗(yàn)更具操作性，并具有重復(fù)性好、定量限低等諸多優(yōu)點(diǎn)，完全適用于蜂蜜中五氯酚的定性和定量檢測，對保障食品安全和提高行業(yè)檢測水平具有重大意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司G6470)、離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)、電子天平(瑞典梅特勒托利多公司)、Milli超純水機(jī)(美國密理博)。

五氯酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.0%)及同位素內(nèi)標(biāo)(13C6-五氯酚內(nèi)標(biāo)13C6-PCP)均購自上海振翔科技有限公司，甲醇色譜純，氨水、乙酸乙酯均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋與配置：將五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1)配置成10 μg·mL-1，稱取五氯酚內(nèi)標(biāo)粉末10.0 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-18 ℃冷凍保存。分別取適量五氯酚及其內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋配制成0.5 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：安捷倫XDB C18(2.0 mm×50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：甲醇+0.1%甲酸2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，洗脫模式見表1。

表1 色譜條件Table 1 Chromatographic conditions

電噴霧正離子掃描(ESI+)：噴霧電壓3 000 V；干燥氣溫度320 ℃，流速10 L·min-1；碰撞氣為氮?dú)?；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度375 ℃，流速10 L·min-1；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱取5.0 g蜂蜜樣品于50 mL離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)溶液，然后加入10.0 mL水，準(zhǔn)確加入12.0 mL氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯∶氨水=9∶1，V∶V)渦旋1.0 min，超聲3.0 min，置于離心機(jī)中以6 000 r·min-1離心3.0 min。吸取上清液于10 mL刻度管中，50 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL定容液(甲醇∶水=1∶1，V∶V)，混勻，過膜供液質(zhì)聯(lián)用譜儀上機(jī)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)條件下，五氯酚在6.0 min內(nèi)能得到良好分離，基本無干擾峰，且分析時(shí)間短。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(MRM)如圖1所示，五氯酚內(nèi)標(biāo)溶液色譜圖如圖2所示。

圖1 五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of pentachlorophenol standard solution

圖2 五氯酚內(nèi)標(biāo)(13C6-PCP)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of pentachlorophenol internal standard (13C6-PCP) solution

2.2 儀器參數(shù)的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用電噴霧電離源(ESI)進(jìn)行了探索，分別對五氯酚和五氯酚同位素內(nèi)標(biāo)(13C6-PCP)進(jìn)行正負(fù)離子掃描，再結(jié)合五氯酚的酸性特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)五氯酚及其同位素內(nèi)標(biāo)(13C6-PCP)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，[M-H]離子化效率很低，無法獲得特征離子。故選擇五氯酚中氯元素的4個(gè)同位素為母離子對(262.7/262.7；264.7/264.7；266.7/266.7；268.7/268.7)、五氯酚同位素內(nèi)標(biāo)(13C6-PCP)的母離子對(270.7/270.8；272.7/272.8；274.7/274.8；276.7/276.8)進(jìn)行分析，結(jié)合實(shí)際通過對蜂蜜空白樣品和加標(biāo)樣品分析過程發(fā)現(xiàn)五氯酚定量離子對266.7/266.7；268.7/268.7存在較大干擾，因此，選取(262.7/262.7；264.7/264.7)作為五氯酚定量定性離子對，(272.7/272.8；274.7/274.8)作為五氯酚內(nèi)標(biāo)(13C6-PCP)子離子；五氯酚同位素內(nèi)標(biāo)及其定性定量離子對、碰撞能量以及保留時(shí)間見表2。

表2 質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrum conditions

2.3 提取溶劑的選擇

目前，食品與農(nóng)產(chǎn)品等基質(zhì)中五氯酚的提取方法主要以酸化法與堿化法兩種方式為主。兩種提取方法各有優(yōu)劣，本實(shí)驗(yàn)主要采用堿化法提取，堿化法常規(guī)的做法是在有機(jī)試劑中加入一定比例的三乙胺進(jìn)行提取，若前處理凈化未完全，極易造成上機(jī)樣品中三乙胺的殘留，一旦三乙胺殘留量增加，時(shí)間延長，嚴(yán)重影響質(zhì)譜儀的靈敏度，對樣品檢測產(chǎn)生重大影響。所以本文選取氨水做堿化，在未加內(nèi)標(biāo)的同時(shí)比較提取溶劑中氨水含量對五氯酚提取效率的影響，通過反復(fù)試驗(yàn)對比，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。當(dāng)氨水含量為10%時(shí)提取效率達(dá)到53.0%，當(dāng)氨水含量提高到20%時(shí)，提取效率明顯下降。最終采用氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯∶氨水=9∶1)作為提取溶劑。

圖3 氨水含量與回收率Fig.3 Ammonia content and recovery rate

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證

按內(nèi)標(biāo)法配置濃度為1.0、2.0、4.0、10.0、50.0、100.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液在設(shè)定的儀器條件下進(jìn)行上機(jī)確定其線性方程，結(jié)果表明，在1.0～100.0 ng·mL-1其線性方程為y=72 475.3x-1 352.26，其相關(guān)系數(shù)r為0.998。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合檢測要求，此方法可用于五氯酚藥物的定量分析。

2.5 回收率及檢出限

按照前處理方法稱取空白蜂蜜樣品18份，進(jìn)行0.5、2.0和10.0 μg·kg-13檔濃度加標(biāo)(每檔6平行)，在基質(zhì)中分別加入適量的五氯酚內(nèi)標(biāo)(13C6-PCP)和五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照實(shí)驗(yàn)步驟處理后測定，計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，在3檔濃度加標(biāo)水平下，五氯酚的回收率在93.5%～101.3%，RSD在4.30%～6.82%(表3)。以加標(biāo)濃度為5 μg·kg-1為基準(zhǔn)，計(jì)算得出該方法的檢出限(LOD)為0.2 μg·kg-1，定量限(LQD)為0.5 μg·kg-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于實(shí)際樣品的快速定量分析。

表3 回收率及精密度(RSD，n=6)Table 3 Recovery rate and precision

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了蜂蜜中五氯酚殘留量的LC-MS/MS檢測方法，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀抗干擾強(qiáng)、靈敏度高等特有優(yōu)點(diǎn)對前處理過程進(jìn)行簡化，并減少了試劑的使用量。同時(shí)該方法具有回收率高、重復(fù)性好的諸多優(yōu)點(diǎn)，說明該方法完全適用于蜂蜜樣品的定性和定量分析，為蜂蜜中五氯酚藥物殘留量的測定提供有力參考。