焦薇 譚媛芳△ 陳惠媛 范秋穎 尹艷慧 陳娟娟 （.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室，南昌 330006；.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫系，北京 009）

近年腫瘤免疫治療備受關(guān)注，尋找表達(dá)于腫瘤組織的特異性或相關(guān)性抗原，制備抗原特異性疫苗靶向攻擊腫瘤已成為腫瘤免疫治療的新動向。腫瘤疫苗接種的前景將集中于更有效的免疫策略［1］。

腫瘤-睪丸（cancer testis，CT）抗原在多種惡性腫瘤中表達(dá)，但在正常組織中除睪丸生殖細(xì)胞外不表達(dá)，是多肽或蛋白質(zhì)疫苗誘導(dǎo)的特異性CTL的有效靶點。許多CT抗原疫苗在小鼠模型中表現(xiàn)出強烈和特異的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)［2-3］。HCA587（又稱MAGE-C2）是課題組前期用SEREX方法從HCC患者肝癌組織cDNA表達(dá)文庫中克隆出的一種新CT抗原［4］。正常組織中，HCA587蛋白僅在免疫豁免的睪丸高表達(dá)；多種腫瘤組織中，如肝癌、黑色素瘤等，HCA587蛋白高表達(dá)［5］。另外腫瘤患者血清中能檢測到自發(fā)的HCA587抗體產(chǎn)生，在體外用HCA587重組蛋白可從正常人外周血中誘導(dǎo)出特異的CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞應(yīng)答［6］。表明HCA587抗原具有腫瘤組織表達(dá)特異性，且免疫原性強，具備作為腫瘤疫苗候選抗原的先決條件。

免疫佐劑通過激活共刺激因子和介導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生提高多肽和蛋白質(zhì)的免疫原性，不同程度激活早期固有免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生對疫苗抗原特異性更高的抗體和更強的細(xì)胞反應(yīng)［7］。此外，多數(shù)佐劑誘導(dǎo)更廣泛的適應(yīng)性反應(yīng)，對異型病毒等提供保護(hù)［8］。免疫佐劑可在誘導(dǎo)同等強度應(yīng)答條件下使蛋白抗原劑量減少，并提高蛋白抗原的免疫原性，增強特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答［9］。近年蛋白疫苗臨床試驗中，佐劑應(yīng)用極為廣泛。因此，研究基于HCA587蛋白的不同免疫策略并檢測其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有重要意義。本研究擬比較HCA587蛋白在不同免疫策略下的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答及抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細(xì)胞系 6～8周齡SPF級C57BL/6J雌性小鼠購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（浙）2019-0001，飼養(yǎng)于南昌樂悠生物科技有限公司潔凈環(huán)境，20～25 ℃，相對濕度55%～65%，整個實驗過程和實驗操作符合國際實驗動物認(rèn)可和評估委員會認(rèn)證要求，本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)（2015.056）。

1.1.2 主要試劑 pGEX-6P-1-HCA587重組質(zhì)粒構(gòu)建及HCA587重組蛋白表達(dá)和純化由北京中美冠科生物科技公司完成，HCA587蛋白純度為98%；OVA蛋白（＞95%純度）、弗氏完全佐劑（CFA）、弗氏不完全佐劑（IFA）購自Sigma公司；CpG ODN 1826（5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'）佐劑由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點（ELISpot）檢測試劑盒購自MABTECH公司，包括預(yù)包被抗小鼠IFN-γ單抗的96孔板、生物素標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ單抗、堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記的鏈霉親和素和BCIP-NBT底物；HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體購自Promega公司；TMB顯色液購自北京天根；胞內(nèi)細(xì)胞因子染色試劑購自Biolegend。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、克隆及鑒定 將含有HCA587全長cDNA序列的質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染B16黑素瘤細(xì)胞，通過G418壓力篩選和有限稀釋法獲得穩(wěn)定表達(dá)HCA587的B16細(xì)胞克隆（B16-HCA587），Western blot檢測其HCA587表達(dá)。

1.2.2 小鼠免疫模型構(gòu)建 將小鼠隨機分為7組，每組6只，分別給予HCA587蛋白結(jié)合CFA/IFA和不同劑量CpG佐劑（20 μg或50 μg），以及佐劑對照、PBS緩沖液對照。免疫分組：①HCA587+CFA+CpG 20 μg；②HCA587+CFA+CpG 50 μg；③HCA587+IFA；④HCA587+IFA+CpG 20 μg；⑤HCA587+IFA+CpG 50 μg；⑥CFA+CpG 50 μg；⑦PBS緩沖液對照組。HCA587蛋白10 μg/只，與CFA或IFA單獨1∶1混合，必要時與不同劑量CpG（20 μg或50 μg）混合，尾根部皮下注射，于第0、21天免疫，頸椎脫臼法處死小鼠。

1.2.3 IFN-γ ELISpot測定 第2次免疫后2周采集小鼠脾細(xì)胞，5×105個/孔加入預(yù)包被抗小鼠IFN-γ單抗的96孔板，加入2.5 μg/ml HCA587蛋白，對照組包括培養(yǎng)基和OVA無關(guān)蛋白，各3個復(fù)孔，37 ℃孵育20 h。加入生物素標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ單抗（1.5 μg/ml），溫育、洗板，加入ALP標(biāo)記的鏈霉親和素（1 μg/ml）室溫避光孵育，洗板，加入BCIP-NBT顯色液避光顯色后沖洗，終止反應(yīng)，統(tǒng)計各孔斑點數(shù)。

1.2.4 抗HCA587抗體ELISA測定 第2次免疫后2周采集小鼠血清，HCA587蛋白（1 μg/ml）包被，4 ℃過夜，37 ℃封閉2 h后洗滌。不同稀釋度血清加入反應(yīng)板，37 ℃反應(yīng)2 h后洗滌。加入HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體（1∶2 500） 37 ℃作用90 min后洗滌。加入TMB顯色液100 μl室溫反應(yīng)3～5 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定各孔450 nm波長處OD值。陰性血清對應(yīng)孔平均OD值的2倍為陽性。

1.2.5 胞內(nèi)細(xì)胞因子染色分析 5×106個/ml脾細(xì)胞在含10 μg/ml HCA587蛋白及10%胎牛血清的1640培基中37 ℃孵育24 h，培養(yǎng)終止前6 h加入Brefeldin A。收集細(xì)胞，洗滌后用抗小鼠CD4和CD8抗體染色30 min，洗滌，離心，棄上清，500 μl固定液室溫固定20 min，洗滌，離心，棄上清，用500 μl 1×通透液室溫通透10 min，洗滌，離心，PE-anti-IFN-γ和APC-anti-IL-4抗體染色30 min，1×通透液洗2次，重懸，進(jìn)行流式分析。

1.2.6 小鼠腫瘤治療模型 取6～8周齡小鼠，每組6只。第0天，每只小鼠于右側(cè)脅腹部皮下接種B16-HCA587腫瘤細(xì)胞（1×104個/只，100 μl）。第7、第28天進(jìn)行免疫治療，治療分組：①HCA587+CFA+CpG 50 μg；②CFA+CpG 50 μg；③PBS緩沖液對照組；100 μl/只，尾根部皮下注射。每隔2～3 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，腫瘤體積=長軸×短軸2×0.52。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖及統(tǒng)計分析。非配對t檢驗分析分泌IFN-γ的脾細(xì)胞頻數(shù)、抗體滴度和小鼠組間腫瘤體積差異，Log-rank test評估生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCA587蛋白聯(lián)合CFA和50 μg CpG誘導(dǎo)最強的細(xì)胞免疫應(yīng)答 HCA587蛋白與不同佐劑聯(lián)合免疫小鼠后，ELISpot分析各免疫策略誘導(dǎo)的分泌HCA587抗原特異性IFN-γ的脾細(xì)胞頻數(shù)。結(jié)果表明HCA587聯(lián)合CFA、CpG組均可檢測到高強度的IFN-γ分泌，50 μg CpG組更為明顯。HCA587與IFA、CpG聯(lián)用時僅檢測到微弱應(yīng)答，HCA587與IFA聯(lián)用時未見陽性應(yīng)答?？梢奌CA587蛋白需要CFA和CpG才能誘導(dǎo)較強的IFN-γ分泌，而50 μg CpG比20 μg誘導(dǎo)能力更強（圖1）。

圖1 不同免疫策略誘導(dǎo)的HCA587特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答Fig.1 HCA587-specific cellular immune response induced by different strategies

2.2 HCA587蛋白與CFA和50 μg CpG聯(lián)合免疫產(chǎn)生高滴度抗體 ELISA檢測不同免疫策略誘導(dǎo)的抗HCA587 IgG抗體水平，HCA587蛋白與CFA或IFA聯(lián)用均能檢測到高水平的HCA587特異性抗體，這種能力不依賴于CpG存在與否或劑量高低（圖2）。盡管組間抗體滴度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但HCA587聯(lián)合CFA+50 μg CpG在多倍稀釋條件下產(chǎn)生的抗HCA587抗體滴度最高。

圖2 不同免疫策略誘導(dǎo)的抗HCA587特異性抗體滴度Fig.2 Anti-HCA587 IgG antibody titers induced by different strategies

2.3 HCA587蛋白聯(lián)合CFA和50 μg CpG誘導(dǎo)最高比例的IFN-γ+CD4+T細(xì)胞 對免疫后的脾細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。結(jié)果表明，與IFA和CpG聯(lián)用相比，HCA587聯(lián)合CFA和CpG免疫的CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的比例更高，且50 μg CpG下分泌IFN-γ的能力強于20 μg（圖3）。但CD8+T細(xì)胞中未檢測到顯著的IFN-γ分泌；同樣，CD4+T和CD8+T細(xì)胞亞群中均未檢測到顯著的IL-4分泌。說明HCA587蛋白聯(lián)合CFA和50 μg CpG能誘導(dǎo)強大的Th1型免疫應(yīng)答，且效應(yīng)細(xì)胞亞群主要為CD4+T細(xì)胞。

圖3 不同免疫策略誘導(dǎo)的IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例Fig.3 IFN-γ secreted by CD4+T cells from splenocytes following vaccination with different strategies

2.4 HCA587蛋白聯(lián)合CFA和50 μg CpG在小鼠模型中的抗腫瘤作用 基于以上研究結(jié)果，選擇HCA587蛋白聯(lián)合CFA和50 μg CpG作為最終疫苗策略觀察其在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果。結(jié)果顯示，該疫苗策略在體內(nèi)能顯著延緩腫瘤生長（圖4A），但并不能顯著改善荷瘤小鼠存活率（圖4B）。

圖4 HCA587蛋白聯(lián)合CFA和50 μg CpG對B16-HCA587荷瘤小鼠的治療效果Fig.4 Anti-tumor effect of HCA587 protein formulated with CFA and 50 μg CpG against B16-HCA587 cells in tumor-bearing mice

3 討論

蛋白疫苗的優(yōu)點包括不受MHC型別限制，在體內(nèi)能被專業(yè)抗原提呈細(xì)胞攝取和呈遞，誘導(dǎo)高強度的包含CD4+T、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的綜合免疫應(yīng)答［10］。本研究發(fā)現(xiàn)HCA587聯(lián)合CFA和50 μg CpG能誘導(dǎo)強大的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，并在小鼠體內(nèi)呈現(xiàn)一定抗腫瘤作用。

佐劑對建立理想的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。免疫應(yīng)答啟動時使用佐劑可增強天然免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答［11-12］。佐劑是激活樹突狀細(xì)胞、誘導(dǎo)良好免疫環(huán)境的必要條件［13］。弗氏佐劑是一種經(jīng)典佐劑，分為CFA和IFA，廣泛用于蛋白疫苗，并顯著增強人體宿主免疫應(yīng)答［13-14］。可以解釋本研究中無論有無CpG存在，HCA587蛋白與CFA/IFA聯(lián)合免疫均可誘導(dǎo)較強的體液免疫應(yīng)答。

一些臨床研究表明弗氏佐劑需要與其他佐劑結(jié)合才能增強其活性，如Toll樣受體3（TLR3）激動劑和TLR4激動劑CpG ODN［15-17］。MELSSEN等［15］研究表明，LPS和Polyiclc與IFA聯(lián)用是安全有效的疫苗佐劑，加入TLR激動劑時，IFA增強了T細(xì)胞對肽疫苗的反應(yīng)。SPEISER等［17］研究表明，多肽、IFA和CpG ODN 7909疫苗可引起快速強烈的人類CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。此外，報道顯示，含有Montanide ISA 51佐劑的乳劑（油包水乳劑）中免疫多肽可能誘導(dǎo)以Th2為主的微環(huán)境，表明疫苗部位微環(huán)境并未誘導(dǎo)Th1/Tc1應(yīng)答，而是誘導(dǎo)Foxp3+細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，表明可能存在Th2主導(dǎo)的微環(huán)境［16］。以上結(jié)果支持了本研究結(jié)論，即弗氏佐劑需要其他佐劑幫助誘導(dǎo)足夠的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

CpG寡脫氧核苷酸是TLR9的配體，正廣泛作為刺激癌癥反應(yīng)性CTL的多肽和蛋白質(zhì)癌癥疫苗的有效佐劑［17］。CpG是一種含CpG基序的人工合成的寡核苷酸，是B細(xì)胞和Th1型免疫應(yīng)答的有力驅(qū)動因素，并通過交叉遞呈促進(jìn)分泌IFN-γ的細(xì)胞毒細(xì)胞產(chǎn)生［18-19］。疫苗有效性的基礎(chǔ)是宿主對抗原的免疫應(yīng)答能否夠隨著時間推移而引起記憶T細(xì)胞反應(yīng)［20］。疫苗接種試驗中，CpG佐劑可誘導(dǎo)較強的免疫應(yīng)答。研究表明將合成的長NY-ESO-1多肽與強大的免疫佐劑CpG-B聯(lián)合接種，可在黑色素瘤患者中誘導(dǎo)完整和功能強大的CD8+T和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，并顯著增強腫瘤抗原特異性抗體［21-22］。T細(xì)胞分泌的Ⅰ型細(xì)胞因子，如IFN-γ在T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤機制中發(fā)揮重要作用［23］。本研究采用IFN-γ ELISpot實驗對幾種免疫策略進(jìn)行比較，結(jié)果表明HCA587蛋白與CFA和CpG 50 μg聯(lián)合免疫可誘導(dǎo)大量分泌IFN-γ的脾細(xì)胞。同時，為了解免疫后的免疫應(yīng)答類型和免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力進(jìn)行了胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，HCA587和50 μg CpG誘導(dǎo)的脾細(xì)胞分泌IFN-γ的主要細(xì)胞群為CD4+T細(xì)胞，提示HCA587蛋白疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，而CpG的存在是誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。

為評價HCA587蛋白疫苗在體內(nèi)的抗腫瘤作用，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HCA587陽性的B16黑色素瘤細(xì)胞接種C57BL/6J小鼠。HCA587蛋白聯(lián)合CFA和50 μg CpG可特異性抑制HCA587抗原陽性小鼠腫瘤細(xì)胞，但不能延長荷瘤小鼠生存時間，可能與腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性有關(guān)。PD-1/PD-L1信號通路可抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，適應(yīng)性免疫維持的平衡狀態(tài)被破壞［24-25］。Tregs也可能在腫瘤微環(huán)境中通過各種直接和間接機制抑制T細(xì)胞反應(yīng)和功能［26］。此外，IFA誘導(dǎo)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞在細(xì)胞因子產(chǎn)生和增殖能力方面存在紊亂，可能是弗氏佐劑產(chǎn)生瞬時免疫應(yīng)答和低臨床緩解率的重要機制［13］。佐劑可促進(jìn)疫苗接種地點內(nèi)T細(xì)胞招募、耗盡和最終死亡［27］。因此，基于以上結(jié)果，可以考慮改善免疫策略：使用更好的佐劑組合，如使用CpG和ISCOM佐劑組合誘導(dǎo)更強大的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答［28-29］；聯(lián)合檢查點抑制劑PD-1抗體治療；抑制PCSK9，有效減少MHCⅠ在溶酶體中的降解，顯著提高腫瘤細(xì)胞表面MHCⅠ表達(dá)和抗原遞呈，增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答［30］。

綜上，HCA587蛋白聯(lián)合CFA和50 μg CpG佐劑能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強大的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，并具有一定抗腫瘤作用，為腫瘤抗原蛋白疫苗進(jìn)入臨床試驗提供了新的依據(jù)。