廖敏 宋勇波 魏卓 劉小兵 程魁 范哲奇 雙松濤 祝存海

（孝感市中心醫(yī)院泌尿外科，武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院，孝感 432100）

免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）腎病是以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為特征的慢性腎病，發(fā)病率占原發(fā)性腎小球疾病的20%～45%［1］。IgA腎病呈慢性進(jìn)展性，目前尚無特異性治療方法，臨床常根據(jù)患者臨床表現(xiàn)和腎臟病變程度給予長(zhǎng)療程多藥聯(lián)合治療，以修復(fù)腎臟損傷、抑制腎臟異常免疫反應(yīng)從而延緩病情發(fā)展，但仍有部分患者最終進(jìn)展為終末期腎病，威脅其生命健康［2］。因此，探討影響IgA腎病患者預(yù)后不良的影響因素對(duì)預(yù)防該病進(jìn)展、改善預(yù)后有重要意義。腎小球系膜細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積是導(dǎo)致腎小球疾病進(jìn)展的核心病理環(huán)節(jié)［3］，而P21、P27是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控因子，能抑制G1期和S期的細(xì)胞周期素與細(xì)胞周期激酶（cyclin dependent kinase，CDK）結(jié)合，抑制細(xì)胞增殖，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是脫氧核糖核酸（DNA）多聚酶的一種輔助蛋白，能夠反映細(xì)胞增殖活性，既往研究發(fā)現(xiàn)P21、P27、PCNA在腎病中表達(dá)異常，參與了腎系膜細(xì)胞的增殖過程［4-5］。但以上指標(biāo)在IgA腎病患者中的表達(dá)及其與腎臟預(yù)后不良的關(guān)系尚不明確。鑒于此，本研究采用免疫組化法檢測(cè)IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達(dá)，并探討其與腎臟預(yù)后不良的關(guān)系，旨在為其臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：均行腎穿刺活檢，且病理結(jié)果證實(shí)為IgA腎??；年齡≥18歲；均對(duì)本研究知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：乙肝病毒、過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性腎炎等繼發(fā)性IgA腎?。挥心I移植史的患者；腎穿刺活檢標(biāo)本鏡下腎小球數(shù)＜8個(gè)；合并糖尿病腎病、膜性腎病、間質(zhì)性腎炎等腎病患者；其他合并糖尿病、心腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤患者。按納入、排除標(biāo)準(zhǔn)選取2017年4月至2019年8月孝感市中心醫(yī)院收治的145例IgA腎病患者作為研究對(duì)象，其中男83例，女62例；年齡21～60歲，平均（39.54±7.78）歲；病理表現(xiàn)：系膜細(xì)胞增生74例、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生7例、節(jié)段性腎小球硬化86例、腎小管萎縮29例、新月體54例。

1.2 方法

1.2.1 治療與隨訪 依據(jù)《原發(fā)性IgA腎病診治循證指南（2016）》［6］，針對(duì)患者病情和腎臟病變程度進(jìn)行治療，合并持續(xù)性肉眼血尿（持續(xù)2～4周及以上）患者給予甲潑尼龍沖擊治療，15～30 mg/（kg·d），3～5 d為1個(gè)療程，治療1～2個(gè)療程；合并蛋白尿患者結(jié)合腎臟病理結(jié)果給予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ace inhibitors，ACEI）、血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin-receptor blockade，ARB）、免疫抑制劑治療；新月體形成患者給予激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療6個(gè)月，前3～5 d給予甲潑尼龍15～30 mg/（kg·d）沖擊治療，后續(xù)口服潑尼松15～30 mg/（kg·d），同時(shí)環(huán)磷酰胺每月0.5 g/m2沖擊治療；另針對(duì)合并高血壓、高血脂、凝血異常等患者給予降壓（當(dāng)腎功能正?；蜉p微受損時(shí)給予ACEI/ARB降壓，當(dāng)腎功能受損嚴(yán)重、Scr＞440 μmol/L時(shí)給予鈣拮抗劑降壓）、調(diào)脂、抗凝等治療。

以病理確診日期為隨訪起點(diǎn)，所有患者均隨訪24個(gè)月，將腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate,eGFR）較基線值下降超過50%或進(jìn)展至終末期［eGFR＜15 ml/min·（1.73 m2）］的患者歸為預(yù)后不良組，其余患者歸為預(yù)后良好組，其中eGFR=186×Scr-1.154×年齡-0.203×（0.742女性）。

1.2.2 臨床指標(biāo)檢測(cè) 收集所有患者年齡、性別、病理表現(xiàn)、血壓及24 h尿蛋白、血肌酐（serum creatinine,Scr）、白蛋白（albumin,ALB）、尿酸（uric acid,UA）、膽固醇（TC）、三酰甘油（triacylglycerol,TG）等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，所有臨床指標(biāo)均為腎活檢前最后一次晨起空腹檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 腎小球陽(yáng)性和陰性細(xì)胞檢測(cè) 收集所有患者腎穿刺活檢組織，采用甲醛-醋酸-乙醇固定液固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋制成石蠟切片。切片經(jīng)烘烤、脫蠟水化后用3%過氧化氫（H2O2）室溫孵育10 min滅活H2O2酶活性。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，P21、P27組織切片微波進(jìn)行抗原修復(fù)（PCNA無須進(jìn)行）；滴加牛血清蛋白進(jìn)行封閉，室溫孵育20 min后用PBS清洗；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗試劑，室溫孵育1 h，PBS清洗3次；滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS清洗3次；再滴加鏈親和素-過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育10 min，PBS清洗3次后用二氨基聯(lián)苯胺顯色，待顯色后用蘇木素復(fù)染，沖洗后用鹽酸乙醇分色，脫水透明后封片。結(jié)果判讀：在高倍鏡（×200倍）下閱片，核顯示黃色或棕褐色為陽(yáng)性，藍(lán)色為陰性，計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球陽(yáng)性和陰性細(xì)胞，陽(yáng)性率（%）=陽(yáng)性核數(shù)/（陰性核數(shù)+陽(yáng)性核數(shù)）×100%，取所有腎小球的平均值作為該切片的表達(dá)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布以±s描述，采用t檢驗(yàn)；計(jì)量資料若不符合正態(tài)分布則采用M（Q1，Q3）描述，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以“%”描述，采用χ2檢驗(yàn)；并采用Logistic多元回歸分析IgA腎病患者預(yù)后不良的影響因素。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達(dá) IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分別為（38.69±6.83）%、（55.94±8.08）%、（33.47±5.72）%，見圖1。

圖1 IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA表達(dá)Fig.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with IgA nephropathy

2.2 IgA腎病患者預(yù)后不良情況及不同預(yù)后患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達(dá) 隨訪結(jié)束時(shí)，145例IgA患者中預(yù)后不良者25例，預(yù)后良好者120例，預(yù)后不良發(fā)生率為17.24%（25/145）。預(yù)后不良組腎小球系膜組織P21、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率均高于預(yù)后良好組（P＜0.05），P27陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率低于預(yù)后良好組（P＜0.05），見表1、圖2。

表1 不同預(yù)后患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達(dá)（±s，%）Tab.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with different prognosis （±s，%）

表1 不同預(yù)后患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA的表達(dá)（±s，%）Tab.1 Expressions of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue of patients with different prognosis （±s，%）

Groups Poor prognosis（n=25）Good prognosis（n=120）t P P21 48.69±8.72 36.57±5.83 8.605＜0.001 P27 51.64±9.43 56.85±7.24 3.103 0.002 PCNA 44.17±7.62 31.20±4.06 12.180＜0.001

圖2 腎小球系膜組織P21、P27、PCNA表達(dá)Fig.2 Expression of P21， P27 and PCNA in glomerular mesangial tissue

2.3 IgA腎病不同預(yù)后患者一般資料比較 預(yù)后不良組舒張壓、24 h蛋白尿、節(jié)段性腎小球硬化占比、腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化占比、新月體占比均高于預(yù)后良好組（P＜0.05），見表2。

表2 IgA腎病不同預(yù)后患者一般資料比較Tab.2 Comparison of prognosis of patients with IgA nephropathy

2.4 IgA腎病患者預(yù)后不良的影響因素 經(jīng)Logistic多元回歸分析，舒張壓升高、24 h蛋白尿增多、系膜細(xì)胞增生、節(jié)段性腎小球硬化、腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化、新月體與P21、PCNA陽(yáng)性表達(dá)率升高、P27陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率降低均是影響IgA腎病患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表3。

表3 Logistic多元回歸分析Tab.3 Logistic multiple regression analysis

3 討論

IgA腎病發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，近年來研究發(fā)現(xiàn)IgA1對(duì)腎小球系膜細(xì)胞具有親和力，能夠特異性結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，引發(fā)腎小球炎癥反應(yīng)進(jìn)而損傷腎小球［7］。有研究顯示約1/3的IgA腎病患者腎損傷呈進(jìn)行性加重，最終導(dǎo)致預(yù)后不良［8］。本研究145例IgA腎病患者僅隨訪24個(gè)月預(yù)后不良發(fā)生率高達(dá)17.24%，證實(shí)了IgA腎病預(yù)后不良的高風(fēng)險(xiǎn)，故亟須探討影響IgA腎病預(yù)后不良的因素以指導(dǎo)臨床干預(yù)，改善預(yù)后。

本研究結(jié)果顯示，IgA腎病患者腎小球系膜組織P21、P27、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分別為（38.69±6.83）%、（55.94±8.08）%、（33.47±5.72）%，提示P21、P27、PCNA可能在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。IgA腎病以IgA免疫復(fù)合物沉積于系膜區(qū)，誘發(fā)腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)堆積為主要特征，腎小球系膜的增生與系膜細(xì)胞過度增殖有關(guān)，而細(xì)胞增殖必須經(jīng)歷完整的細(xì)胞周期，受細(xì)胞周期調(diào)控因子的調(diào)控［9］。PCNA是在細(xì)胞增殖中呈階段性表達(dá)的一種蛋白，與DNA聚合酶結(jié)合引導(dǎo)DNA復(fù)制，可有效反映細(xì)胞的增殖活性，既往研究報(bào)道IgA腎病小鼠PCNA水平相較健康對(duì)照組升高，且此類小鼠系膜細(xì)胞增殖增強(qiáng)，提示PCNA可能與腎系膜細(xì)胞增殖關(guān)系密切［10］。P21、P27是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）家族中的成員，能夠抑制多數(shù)細(xì)胞周期素和CDK復(fù)合物，使細(xì)胞不能通過G1期到S期之間的檢驗(yàn)點(diǎn)，停滯在G1期；另外，P21可與PCNA結(jié)合抑制DNA復(fù)制，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖［11-12］。正常情況下P21處于低表達(dá)水平，P27處于高表達(dá)水平來抑制細(xì)胞增殖，而在腎小球系膜組織中P21表達(dá)上調(diào)、P27表達(dá)下調(diào)則提示抑制腎系膜細(xì)胞增殖能力減弱，進(jìn)而參與IgA腎病的發(fā)生。此外，本研究結(jié)果顯示IgA腎病預(yù)后不良組腎小球系膜組織P21、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率均高于預(yù)后良好組，P27陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率低于預(yù)后良好組，經(jīng)多因素分析顯示其均是IgA腎病預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。腎小球系膜細(xì)胞增殖是IgA腎病的重要病理機(jī)制，也是病情進(jìn)展的重要原因。PCNA是細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，而P27是抑制細(xì)胞增殖的因子，PCNA表達(dá)增加，P27表達(dá)減少說明腎小球系膜細(xì)胞增殖增多，促進(jìn)IgA腎病進(jìn)展。P21可與CDK復(fù)合物結(jié)合抑制細(xì)胞增殖，但P21參與足細(xì)胞的損傷，當(dāng)足細(xì)胞在增殖表型狀態(tài)下P21可從復(fù)合物中分離，變?yōu)橛坞x狀態(tài)［13］，因此在腎小球硬化過程中隨著足細(xì)胞增生，P21同樣作為抑制細(xì)胞增殖的因子表達(dá)增加。另外焦素敏等［14］發(fā)現(xiàn)P21表達(dá)水平與腎小球硬化呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了P21表達(dá)增加與IgA腎病進(jìn)展相關(guān)，是導(dǎo)致其預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。且目前已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過在腎炎小鼠中調(diào)控P21、P27的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖來干預(yù)腎病進(jìn)展，改善預(yù)后［15］。本研究結(jié)果還顯示，舒張壓升高、24 h蛋白尿增多、系膜細(xì)胞增生、節(jié)段性腎小球硬化、腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化、新月體均是影響IgA腎病預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，與既往研究報(bào)道一致［16-18］。

綜上，P21、P27、PCNA在IgA腎病腎小球系膜組織中均存在陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，預(yù)后不良患者P21、PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率高于預(yù)后良好者，P27陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率低于預(yù)后良好者，且均是IgA腎病患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。