李錦帥,楊子?jì)?王 韜,賈 丹,王亞瓊,熊 廣,謝 緯,陳 生,李敏芳,4

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 深圳 518033;2.深圳市中醫(yī)院,廣東 深圳 518033;3.暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510632;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510006)

咳嗽高敏綜合征病因尚不明確,主要特征為對(duì)各種刺激性物質(zhì)或條件產(chǎn)生異常敏感的咳嗽反應(yīng),臨床中以慢性刺激性干咳為主要表現(xiàn),目前其發(fā)病機(jī)制存在爭(zhēng)議[1-2]。相關(guān)研究表示,慢性咳嗽患者普遍存在氣道管壁增厚、支氣管上皮受損伴杯狀細(xì)胞增生、基底膜增厚和肥大細(xì)胞慢性炎癥浸潤(rùn)[3-4]。大量慢性咳嗽患者存在肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、神經(jīng)肽P物質(zhì)(Substance P,SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)高水平[5-8]。目前咳嗽高敏綜合征臨床治療效果不理想,且存在較多不良反應(yīng),給患者的社交、心理等方面帶來(lái)了極大的負(fù)擔(dān)[9-10]。國(guó)醫(yī)大師晁恩祥認(rèn)為咳嗽敏感性增高的特點(diǎn)與風(fēng)邪致病特點(diǎn)之“風(fēng)善行數(shù)變”“風(fēng)性攣急”“無(wú)風(fēng)不作癢”等相契合,故將其歸屬于“風(fēng)咳”范疇,并提出治療時(shí)應(yīng)從“風(fēng)”論治,以疏風(fēng)宣肺、緩急止咳為法[11]。國(guó)醫(yī)大師晁恩祥結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制出蘇黃止咳膠囊[12]。多項(xiàng)研究表明蘇黃止咳膠囊治療感染后咳嗽、咳嗽變異性哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病安全有效[13-16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)蘇黃止咳膠囊組成中9種中草藥具有75種活性成分[17]。其中五味子的活性物質(zhì)總木脂素具有治療慢性咳嗽的潛力[18]。基于蘇黃止咳膠囊良好的抗炎止咳效果,本研究旨在對(duì)蘇黃止咳膠囊改善咳嗽高敏模型的抗炎止咳作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:普通級(jí)別雄性白化豚鼠36只,體重為300～350 g,皆購(gòu)自珠海百試通生物科技公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0051。以上豚鼠在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),許可證號(hào):SYXK(粵)2018-0085。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:蘇黃止咳膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字23060991);磷酸可待因片(批號(hào)20190601,國(guó)藥集團(tuán));苯酚、濃硫酸、乙醇、水合檸檬酸(批號(hào)90-72-2、64-17-5、7664-93-9、5949-29-1,西隴科學(xué));磷酸鹽緩沖液(批號(hào)MA0015,Meilunbio公司);紅細(xì)胞裂解液(批號(hào)HRA2081,荷瑞生物);4%多聚甲醛(批號(hào)HM0123,廣州浩瑪);蘇木素、伊紅染液(批號(hào) G1004、G1005,西隴科學(xué));IL-1β、TNF-α試劑盒(批號(hào) JER-01、JER-06,安徽巧伊);SP試劑盒(批號(hào)D751030,上海生工);CGRP試劑盒(批號(hào) CSB-E08211r,華美生物)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:大動(dòng)物用全身體積描記系統(tǒng)(WBP型,上海塔望智能科技);低溫離心機(jī)(5430R型,美國(guó)Thermo Scientific公司);多功能血細(xì)胞分類儀(BM2型,東吳醫(yī)用電子儀器廠);多功能酶標(biāo)儀(Multiskan GO型,美國(guó)Thermo Scientific公司);實(shí)驗(yàn)室用制冰機(jī)(MR46AS+NB393型,上海冠森生物);混合研磨器(LUKYM-1型,廣州華創(chuàng));超聲波霧化器(WH-2000型,廣東粵華)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豚鼠分組、造模及給藥:36只豚鼠按照隨機(jī)分組原則分為空白對(duì)照組、模型組、可待因組以及蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組,每組6只。首先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨后,除空白對(duì)照組外,其他組參照參考文獻(xiàn)[19]建立煙草煙霧誘導(dǎo)的咳嗽高敏豚鼠模型。具體操作為將豚鼠置于煙霧染毒箱,煙熏14 d,2次/d,每次20 min,并確保兩次煙熏的時(shí)間間隔大于6 h。第15天對(duì)豚鼠進(jìn)行灌胃給藥。蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組分別予0.18、0.36、1.8 g/(kg·d)蘇黃止咳膠囊溶液灌胃?？纱蚪M接受磷酸可待因混懸液30 mg/kg灌胃?？瞻讓?duì)照組和模型組豚鼠則灌胃等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 豚鼠咳嗽敏感性檢測(cè):末次給藥1 h后,將豚鼠單獨(dú)置于密封的透明暴露箱(25 cm×12 cm×12 cm)中,暴露箱兩側(cè)均有換氣口,開(kāi)始進(jìn)行暴露。使用超聲霧化器霧化引咳劑,可使其在空氣中的顆粒直徑保持在1～5 μm,每分鐘霧化0.5 mol/L的含水檸檬酸0.5 ml,霧化5 min,觀察10 min。由經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的2名觀測(cè)者連續(xù)監(jiān)測(cè)豚鼠的咳嗽次數(shù)及聲音。同時(shí)使用大動(dòng)物用全身體積描記系統(tǒng)記錄豚鼠的咳嗽次數(shù)以及咳嗽潛伏期。

1.2.3 豚鼠肺泡灌洗液取材及處理:固定豚鼠,腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉,隨后進(jìn)行氣管切開(kāi)和插管,并同時(shí)結(jié)扎右肺,以6 ml預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液分3次緩慢注入左肺進(jìn)行灌洗。將得到的BALF置于10 ml的離心管中,以1500 r/min的速度在4 ℃條件下離心5 min。離心后,輕輕吸取離心管上清液,然后將其分裝至潔凈的離心管中,并保存至-80 ℃冰箱備用,ELISA法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子水平。

1.2.4 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類:將離心后的BALF細(xì)胞沉淀加入500 μl的PBS溶液,然后懸浮細(xì)胞,取10 μl的懸浮液加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,借助光學(xué)顯微鏡對(duì)各類炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。取100 μl細(xì)胞懸液制備細(xì)胞涂片,自然風(fēng)干后置于10%中性福爾馬林中進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的固定,固定時(shí)間大于24 h。HE染色、干燥后,對(duì)炎癥細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.2.5 BALF中炎癥因子檢測(cè):遵循試劑盒的詳細(xì)操作說(shuō)明,采用ELISA法測(cè)定BALF中的炎癥因子IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平。

1.2.6 氣道組織及肺組織病理觀察:取得主支氣管及右下肺組織后,置于10%福爾馬林溶液中浸泡固定,然后進(jìn)行石蠟包埋,制備切片厚度為4 μm。經(jīng)過(guò)HE染色,最后在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。

2 結(jié) 果

2.1 蘇黃止咳膠囊對(duì)咳嗽高敏豚鼠咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期的影響 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組比較,模型組豚鼠的咳嗽次數(shù)增加,咳嗽潛伏期縮短(均P<0.01);蘇黃止咳膠囊各劑量組及可待因組相對(duì)于模型組,咳嗽次數(shù)顯著減少(P<0.01),咳嗽潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05,P<0.01)。

表1 各組豚鼠咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期比較

2.2 蘇黃止咳膠囊對(duì)咳嗽高敏豚鼠BALF中炎癥細(xì)胞的影響 見(jiàn)表2。模型組BALF中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05,P<0.01);蘇黃止咳膠囊各劑量組BALF中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞均顯著低于模型組(P<0.01);蘇黃止咳膠囊高劑量組BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于模型組(P<0.05);蘇黃止咳膠囊低劑量組BALF中淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低于模型組(P<0.05)。

表2 各組豚鼠BALF中炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(×109/L)

2.3 蘇黃止咳膠囊對(duì)咳嗽高敏豚鼠BALF中IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平的影響 見(jiàn)表3。模型組BALF中的IL-1β、TNF-α、SP、CGR水平均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)。蘇黃止咳膠囊中、高劑量組BALF中的IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平均顯著低于模型組(P<0.01)。

表3 各組豚鼠BALF中IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平比較(pg/ml)

2.4 蘇黃止咳膠囊對(duì)咳嗽高敏豚鼠肺組織病理學(xué)的影響 見(jiàn)圖1。空白對(duì)照組豚鼠的肺組織鏡下顯示氣道上皮細(xì)胞整齊排列,無(wú)充血和水腫,肺泡結(jié)構(gòu)完整,炎癥浸潤(rùn)較少,氣管腔內(nèi)也未見(jiàn)明顯炎性浸潤(rùn)。模型組和可待因組豚鼠的肺組織鏡下顯示氣道上皮細(xì)胞排列紊亂,氣管和細(xì)支氣管黏膜炎性水腫,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著,管腔中存在大量滲出物,肺泡間隔增寬,部分肺泡出現(xiàn)塌陷。與模型組相比,蘇黃止咳膠囊各劑量組豚鼠肺組織中炎癥浸潤(rùn)減輕,管腔滲出物也顯著減少。

A:空白對(duì)照組;B:模型組;C:可待因組;D:蘇黃止咳膠囊低劑量組;E:蘇黃止咳膠囊中劑量組;F:蘇黃止咳膠囊高劑量組圖1 各組豚鼠肺組織病理學(xué)改變(HE染色,×200)

3 討 論

咳嗽高敏綜合征的發(fā)生受多種因素影響,比如氣道炎癥、咳嗽中樞敏化和神經(jīng)源性炎癥等[20]。氣道炎癥在咳嗽高敏綜合征中占重要作用,當(dāng)呼吸道黏膜受到外界刺激時(shí),會(huì)激活氣道炎癥反應(yīng),導(dǎo)致中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加,本研究中蘇黃止咳膠囊各劑量組顯著低于模型組豚鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)水平,表明蘇黃止咳膠囊有助于抑制氣道炎癥細(xì)胞的釋放。氣道炎癥反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)伴隨IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)水平的升高[21],這些炎癥介質(zhì)的刺激可激活咳嗽感受器,進(jìn)而提高咳嗽纖維傳入神經(jīng)末梢C纖維的敏感性,從而導(dǎo)致咳嗽閾值下調(diào)。本研究中低、中、高劑量蘇黃止咳膠囊可顯著下調(diào)BALF中IL-1β、TNF-α水平,氣道炎癥介質(zhì)的釋放減少可進(jìn)一步減少對(duì)咳嗽感受器的刺激且能降低咳嗽纖維傳入神經(jīng)的敏感性;當(dāng)咳嗽中樞被激活時(shí),SP物質(zhì)的釋放增加會(huì)導(dǎo)致傳入信號(hào)的放大和咳嗽反應(yīng)的加強(qiáng)。研究表明,使用SP拮抗劑治療后,豚鼠的咳嗽敏感性明顯減弱[22]。目前認(rèn)為C纖維被激活后神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多可能在慢性咳嗽中扮演重要角色,C纖維中釋放的神經(jīng)遞質(zhì)主要包括SP、CGRP等,在吸入刺激性物質(zhì)后可誘導(dǎo)SP釋放增多并引起咳嗽,且慢性咳嗽患者咳嗽敏感性與其BALF中CGRP水平呈正相關(guān)[23]。本研究中,中、高劑量蘇黃止咳膠囊可顯著下調(diào)BALF中SP、CGRP水平,SP物質(zhì)的減少可以減弱咳嗽傳入信號(hào)且使氣道對(duì)刺激的敏感性降低,CGRP水平的下降可以減輕咳嗽反應(yīng)且進(jìn)一步降低咳嗽敏感性。

晁恩祥教授對(duì)咳嗽、肺痿等疾病有較深的見(jiàn)解,蘇黃止咳膠囊由國(guó)醫(yī)大師晁恩祥研發(fā)[24]。臨床中部分患者咳嗽癥狀遷延難愈且突發(fā)突止,運(yùn)用常規(guī)散寒、清熱等方法不能奏效。國(guó)醫(yī)大師晁恩祥結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為咳嗽遇刺激性而發(fā)、突發(fā)突止、咽癢等特點(diǎn)與風(fēng)邪致病特點(diǎn)相契合,由此創(chuàng)立“風(fēng)咳”理論,將其病因病機(jī)歸納為風(fēng)邪犯肺,肺失宣肅,并強(qiáng)調(diào)治療時(shí)應(yīng)從風(fēng)論治。蘇黃止咳膠囊諸藥并用,共奏疏風(fēng)宣肺、止咳利咽之功,可以有效緩解咳嗽癥狀并改善肺功能[25-26],且現(xiàn)代藥理學(xué)證明蘇黃止咳膠囊具有抗組胺、降低炎癥因子水平等作用[27]。

綜上所述,蘇黃止咳膠囊可能通過(guò)抑制氣道炎癥的發(fā)生和炎癥介質(zhì)的釋放,減少刺激咳嗽感受器,并且還可能通過(guò)下調(diào)SP、CGRP的水平,縮小咳嗽傳入信號(hào)并且減輕咳嗽反應(yīng),最終降低豚鼠模型的咳嗽敏感性,然而具體的通路仍需進(jìn)一步研究。本研究為治療咳嗽高敏綜合征提供了新的思路,但本研究為動(dòng)物研究,選用的豚鼠均為雄性,可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成偏倚,未來(lái)還需要在真實(shí)世界中進(jìn)行人類大樣本的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其具體作用。