◎ 劉胤璇，李春江，楊蕊銀，白秀珍

（紅河哈尼族彝族自治州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 蒙自 661199）

方法技術(shù)驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室在使用新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)前或在用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)質(zhì)性變更時(shí)，用以證實(shí)能夠正確運(yùn)用這些方法的技術(shù)性驗(yàn)證過(guò)程，是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系中至關(guān)重要的一環(huán)[1-3]。檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)通過(guò)方法驗(yàn)證，可以對(duì)方法的適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。運(yùn)用不經(jīng)驗(yàn)證的新方法進(jìn)行食品檢驗(yàn)工作，會(huì)對(duì)結(jié)果造成嚴(yán)重影響，輕則發(fā)生數(shù)據(jù)偏差，重則對(duì)產(chǎn)品判定結(jié)果造成影響[4]。

目前，仍有很多檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)食品微生物檢驗(yàn)方法的技術(shù)驗(yàn)證缺乏認(rèn)識(shí)，引用新標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，僅通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的培訓(xùn)、人員能力評(píng)價(jià)，對(duì)照評(píng)價(jià)設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑、環(huán)境等是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求來(lái)評(píng)價(jià)該標(biāo)準(zhǔn)的適用性，缺乏技術(shù)性驗(yàn)證過(guò)程[5-6]。本文以《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.7—2013）方法驗(yàn)證為例，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)適用范圍及副溶血性弧菌污染海產(chǎn)品的特性，結(jié)合《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[7]及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[8]要求，選擇水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品兩種基質(zhì)[9-11]作為分析樣本，闡述微生物檢驗(yàn)方法技術(shù)驗(yàn)證全過(guò)程，從食品微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證技術(shù)參數(shù)、要素的控制，探討微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證工作程序，結(jié)合實(shí)例，建立食品微生物檢驗(yàn)方法技術(shù)驗(yàn)證基本模式，為食品檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品海魚(yú)和耗油作為樣品基質(zhì)，樣品稱(chēng)量后加入副溶血性弧菌（編號(hào)ATCC17802，第2 代工作用菌種）菌懸液，按標(biāo)準(zhǔn)要求加入稀釋液，用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min 制備樣品勻液。

3%氯化鈉堿性蛋白胨水、TCBS 平板、弧菌顯色培養(yǎng)基、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂、氧化酶試劑、革蘭氏染色劑和干制生化鑒定試劑盒，均由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

T500 電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）、PREVI Color Gram 全自動(dòng)革蘭氏染色儀（法國(guó)梅里埃公司）、1 mL/10 mL 移液器（德國(guó)普蘭德公司）、BD115 培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER 公司）、HBM-400C 樣品均質(zhì)器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）及數(shù)顯溫濕度計(jì)（德國(guó)testo 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法

根據(jù)定性檢驗(yàn)和定量檢測(cè)要求的不同，選擇方法驗(yàn)證需要控制的驗(yàn)證要素。定性檢驗(yàn)，對(duì)方法的檢出水平LOD50進(jìn)行驗(yàn)證；定量檢測(cè)，從估計(jì)偏差、精密度、不確定度評(píng)定3 方面進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)定性檢驗(yàn)、定量檢測(cè)流程參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.7—2013）[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性檢驗(yàn)

因沒(méi)有方法的確認(rèn)資料，估計(jì)LOD50≤3 CFU/測(cè)試單元。取副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌種制備0.5 麥?zhǔn)蠞岫染?，稀釋?0-7，每個(gè)稀釋度菌液各取1 mL 至兩個(gè)培養(yǎng)皿，加入3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)48 h 后計(jì)數(shù)，得到10-6培養(yǎng)皿上菌落數(shù)為19 CFU，按高（10×LOD50）、中（5×LOD50）、低（1×LOD50），3 個(gè)接種水平接種量應(yīng)為30 CFU、15 CFU、3 CFU，制備8 個(gè)樣品后，兩個(gè)高接種水平樣品中加入1.5 mL 稀釋度10-6菌液，兩個(gè)中接種水平樣品中加入0.75 mL 稀釋度10-6菌液，兩個(gè)低接種水平樣品中加入0.15 mL 稀釋度10-6菌液，剩余兩個(gè)為空白樣品。加入標(biāo)準(zhǔn)菌種后，按GB 4789.7—2013 標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行定性檢驗(yàn)。參考《微生物檢測(cè)方法確認(rèn)與驗(yàn)證指南》（RB/T 033—2020）要求，根據(jù)不同污染水平陽(yáng)性結(jié)果估計(jì)LOD50，結(jié)果如表1 所示。

表1 副溶血性弧菌定性檢出水平檢測(cè)結(jié)果表

2.2 定量檢測(cè)

2.2.1 估計(jì)偏差

本次驗(yàn)證針對(duì)水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品兩種基質(zhì)中副溶血性弧菌進(jìn)行定量檢測(cè)。每種基質(zhì)選擇3 個(gè)不同生產(chǎn)企業(yè)的不同產(chǎn)品，因所選產(chǎn)品中未檢出目標(biāo)菌，故進(jìn)行人工污染。3 個(gè)產(chǎn)品稱(chēng)樣后分別添加10-2、10-3、10-4共3 個(gè)稀釋度的菌液0.1 mL，按照GB 4789.7—2013 標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)，每個(gè)稀釋度各取0.1 mL至兩個(gè)培養(yǎng)皿，加入3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)48 h 后計(jì)數(shù)，得到10-4培養(yǎng)皿上菌落數(shù)為205 CFU、197 CFU，樣品取樣量為25 g，即加入樣品后樣品中含有副溶血性弧菌量分別為800 CFU·g-1、80 CFU·g-1、8 CFU·g-1。計(jì)算檢測(cè)結(jié)果與加入量的差值（表2），結(jié)果與對(duì)照結(jié)果之差在0.5 lgCFU·g-1以?xún)?nèi)，估計(jì)偏差符合要求。

表2 副溶血性弧菌定量檢測(cè)估計(jì)偏差檢測(cè)結(jié)果表

2.2.2 精密度

水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品兩種基質(zhì)各取10 個(gè)樣品，稱(chēng)量后各加入10-3稀釋度的菌液0.1 mL，每個(gè)樣品取兩個(gè)檢驗(yàn)單元，分別由檢驗(yàn)人員A 與B 完成檢驗(yàn)，定義為檢驗(yàn)單元A、檢驗(yàn)單元B。按照GB 4789.7—2013標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。取對(duì)數(shù)結(jié)果求重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為0.113 8%（水產(chǎn)制品A）、0.113 8%（水產(chǎn)制品B）、0.113 8%（水產(chǎn)調(diào)味品A）、0.113 8%（水產(chǎn)調(diào)味品B）。參考《食品微生物定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)估指南》（RB/T 151—2016）[13]給出的好氧嗜溫性菌凍蝦的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%，此次試驗(yàn)兩種基質(zhì)所有檢驗(yàn)單元檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.18%，故精密度符合要求。

表3 副溶血性弧菌精密度檢測(cè)結(jié)果表 單位：MPN·g-1

2.2.3 不確定度評(píng)定

參考李珍等[14]和朱夕濤等[15]的方法，分析副溶血性弧菌定量檢測(cè)不確定度分量的來(lái)源，見(jiàn)表4。根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果及不確定度分量來(lái)源，計(jì)算測(cè)量不確定度[15]。檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值見(jiàn)表5，各不確定度分量結(jié)果見(jiàn)表6。水產(chǎn)制品、水產(chǎn)調(diào)味品中副溶血性弧菌的合成不確定度均為0.110 7，取包含因子k=2，置信概率95%[16]，得到擴(kuò)展不確定度均為2×0.110 7=0.22 lgMPN·g-1。副溶血性弧菌含量對(duì)數(shù)均值均為1.41，則結(jié)果報(bào)告為101.41±0.22MPN·g-1。

表4 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量列表

表5 水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品副溶血性弧菌定量檢測(cè)對(duì)數(shù)結(jié)果表 單位：lgMPN·g-1

表6 副溶血性弧菌定量檢測(cè)不確定度評(píng)定表

3 結(jié)論

本次方法驗(yàn)證給出水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品定性檢驗(yàn)檢出水平分別為2 CFU/測(cè)試單位、3 CFU/測(cè)試單位，不高于預(yù)估檢出水平，滿(mǎn)足要求。水產(chǎn)制品3 種污染水平定量檢測(cè)副溶血性弧菌的估計(jì)偏差分別為0.35 lgCFU·g-1、0.27 lgCFU·g-1、0.24 lgCFU·g-1，水產(chǎn)調(diào)味品的估計(jì)偏差為0.35 lgCFU·g-1、0.27 lgCFU·g-1、0.24 lgCFU·g-1，均小于0.5 lgCFU·g-1，符合要求；重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差均為0.113 8%，小于《食品微生物定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)估指南》（RB/T 151—2016）給出的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差0.18%，符合要求；方法的擴(kuò)展不確定度為0.22 lgMPN·g-1（k=2，置信概率95%）。實(shí)驗(yàn)從檢出水平、估計(jì)偏差、精密度、不確定度評(píng)定等方面構(gòu)建了副溶血性弧菌檢測(cè)方法驗(yàn)證的基本模式，驗(yàn)證結(jié)果滿(mǎn)意，同時(shí)給出了不確定度評(píng)定方案，為實(shí)驗(yàn)室制定判定規(guī)則提供了參考。

食品微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室正確地實(shí)施方法驗(yàn)證，可以有效控制方法使用過(guò)程中的風(fēng)險(xiǎn)[5]。根據(jù)本研究中實(shí)例分析，建立微生物方法技術(shù)驗(yàn)證的基本模式，首先根據(jù)方法范圍和實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)擴(kuò)項(xiàng)范圍，選定合適的基質(zhì)，針對(duì)不同基質(zhì)進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證，做到基質(zhì)全覆蓋；定性檢驗(yàn)時(shí)對(duì)檢出水平進(jìn)行驗(yàn)證；定量檢測(cè)時(shí)從估計(jì)偏差、精密度、不確定度評(píng)定3 方面進(jìn)行驗(yàn)證。除此之外，還可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室需要，增加能力驗(yàn)證[17]、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)等方式，輔助完成方法驗(yàn)證，從而提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，確保出具的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。