張 雪,張 悅,劉夢雨,欒浩妮,宋 鵬,周正松,王 飛,徐 偉

(1.聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252059;2. 山東奧克特生物科技有限公司, 山東 聊城 252800)

0 引言

熊去氧膽酸(UDCA)是一種內(nèi)源性膽汁酸,具有溶解膽結(jié)石,治療膽汁淤積、膽源性胰腺炎、原發(fā)性膽管炎、結(jié)腸炎(癌)、(非)酒精性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、藥物性肝炎和改善肝移植效果的作用[1]。最新研究發(fā)現(xiàn),UDCA還可介導(dǎo)并影響癌癥基因組中致癌信號(hào)通路調(diào)控,用于癌癥治療[2];可特異性調(diào)控細(xì)胞凋亡閾值,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡,抑制癌細(xì)胞生長[3];在治療進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí),UDCA還能夠改善受損線粒體功能,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。新冠期間,UDCA還被證實(shí)具有降低新冠感染率和重癥率的臨床效果[5]。

UDCA是從北極熊膽汁中發(fā)現(xiàn)的一種天然活性產(chǎn)物,1902年由Hammarsten命名,后續(xù)研究證實(shí),UDCA與其它內(nèi)源性膽汁酸相比,在治療膽囊和肝臟疾病方面表現(xiàn)出更好療效。目前,UDCA是美國食品和藥物管理局(FDA)唯一批準(zhǔn)治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的藥物。生物法合成UDCA相對(duì)于化學(xué)合成具有綠色、高效和安全等特點(diǎn)。因此,利用膽汁酸類底物生物合成UDCA逐漸成為研究發(fā)展方向。生物法合成UDCA主要有游離酶催化合成和全細(xì)胞合成[6]。游離酶催化合成以鵝去氧膽酸(CDCA)或膽酸(CA)為底物,通過多酶級(jí)聯(lián)催化合成UDCA;全細(xì)胞合成是在微生物培養(yǎng)過程中加入CDCA或石膽酸(LCA)底物,利用微生物全細(xì)胞催化將底物轉(zhuǎn)化為UDCA。

1 游離酶催化合成UDCA

游離酶催化合成UDCA以CDCA、CA或者LCA為出發(fā)底物,其中大部分研究主要集中在CDCA和CA。一方面,CDCA和CA來自家禽(雞、鴨、鵝)和牛膽汁,原料資源豐富,價(jià)格便宜;另一方面,CDCA和CA轉(zhuǎn)化合成UDCA使用的羥基類固醇脫氫酶催化效率高,而目前真正實(shí)現(xiàn)全過程酶催化合成UDCA的只有底物CDCA。

1.1 CDCA底物合成UDCA

CDCA C-7羥基差向異構(gòu)化后即轉(zhuǎn)化為UDCA。以CDCA為底物合成UDCA涉及兩種關(guān)鍵酶:7α-羥基類固醇脫氫酶(7α-HSDH)和7β-羥基類固醇脫氫酶(7β-HSDH)。7α-HSDH催化CDCA氧化脫氫生成7-酮石膽酸(7-KLCA),7β-HSDH進(jìn)一步催化7-KLCA加氫還原生成UDCA,如圖1所示。

注:R=4-戊酸;藍(lán)色方框:C-7羥基。 Note: R= 4-valeric acid; Blue box: C-7 hydroxy.

7α-HSDH和7β-HSDH同屬短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)家族,早期發(fā)現(xiàn)的7α-HSDHs大部分從好氧菌或厭氧菌中分離得到。近年來,通過同源比對(duì)[7-9]或宏基因組學(xué)方法[10]從黑熊糞便中發(fā)現(xiàn)的7α-HSDH數(shù)量較多,已報(bào)道的7α-HSDHs如表1所示。

表1 已報(bào)道的7α-HSDH

除了上述功能驗(yàn)證的7α-HSDHs,在NCBI RefSeq數(shù)據(jù)庫中搜索“7-α-hydroxysteroid dehydrogenase”關(guān)鍵詞,已能搜尋到1 200多個(gè)條目。

與7α-HSDH不同,用于生物轉(zhuǎn)化的7β-HSDH報(bào)道數(shù)量較少,如表2所示,而且7β-HSDH的比酶活和酶穩(wěn)定性都較差[19,20],只有一個(gè)來源于野生型Clostridiumabsonum的7β-HSDH用于UDCA工業(yè)化合成工藝中[21,22];7β-HSDH幾乎都以NADPH為輔酶,目前為止,只發(fā)現(xiàn)四種NAD+依賴性7β-HSDH:蛋白序列已報(bào)道的三種分別來自Lactobacillusspicheri[23]、Roseococcussp.[24]和CandidatusLigilactobacillus[25];另一種蛋白序列鮮見報(bào)道的來自Xanthomonasmaltophilia[18]。

表2 已報(bào)道的7β-HSDH

1.2 CA底物合成UDCA

CA是目前最豐富和最便宜的膽汁酸,CA廣泛存在于牛、羊、豬的膽汁中,其中牛膽汁中含量最為豐富,1 000 mL牛膽汁中膽酸含量達(dá)到44 g。從CA合成UDCA有四條路徑[28],如圖2所示,但每條路徑均需要借助Wolff-Kishner反應(yīng)還原中間產(chǎn)物的C-12羰基為亞甲基[29],所以,目前尚無法實(shí)現(xiàn)以膽酸為底物全過程生物合成UDCA。

注:DHCA:脫氫膽酸;12-oxo-UDCA:12-酮-熊去氧膽酸;CA:膽酸;7-oxo-DCA:7-酮-石膽酸;7,12-dioxo-LCA: 7,12-酮石膽酸;UDCA:熊去氧膽酸;12-oxo-CDCA:12-酮-鵝去氧膽酸;CDCA:鵝去氧膽酸;R=4-戊酸 ①:合成路線1;②:合成路線2;③:合成路線3;④:合成路線4。

1.3 LCA底物合成UDCA

LCA也存在于牛、羊和豬等養(yǎng)殖動(dòng)物的膽汁中,是肉類加工產(chǎn)業(yè)豐富、廉價(jià)的副產(chǎn)物。從結(jié)構(gòu)式觀察,以LCA為底物合成UDCA,僅需實(shí)現(xiàn)LCA C-7羥基化即可,如圖3所示。

圖3 P450單加氧酶催化LCA生成UDCA

P450單加氧酶能夠催化這一反應(yīng),然而P450單加氧酶在實(shí)際應(yīng)用中面臨諸多挑戰(zhàn):其利用O2的催化過程高度依賴輔因子NAD(P)H和還原伴侶蛋白復(fù)合體,復(fù)雜的蛋白復(fù)合物構(gòu)造降低了P450單加氧酶的穩(wěn)定性和催化效率。目前,只有少數(shù)微生物可以將LCA轉(zhuǎn)化成UDCA,而通過游離P450單加氧酶催化LCA合成UDCA,只有Grobe等報(bào)道的一個(gè)工程化細(xì)胞色素P450單加氧酶OleP[30]。

1.4 游離酶催化UDCA合成的方式

以CDCA為底物,采用游離酶催化合成UDCA是現(xiàn)今最具發(fā)展?jié)摿Φ纳锖铣煞椒?其在成本、轉(zhuǎn)化率和技術(shù)成熟度上相較于其它兩種底物優(yōu)勢明顯。以CDCA為底物合成UDCA一般采用“一鍋兩步法”和“一鍋一步法”。

“一鍋兩步法”采用分步反應(yīng):第一步,7α-HSDH催化CDCA生成7-KLCA,反應(yīng)完成后滅酶(或與第二步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)空間隔離),第二步,添加7β-HSDH,催化7-KLCA生成UDCA?！耙诲亙刹椒ā鞭D(zhuǎn)化率高;但承載底物濃度低,效率低,耗時(shí)長[31,32]?！耙诲佉徊椒ā睂?α-HSDH、7β-HSDH、底物和其它輔料一并加入反應(yīng)釜進(jìn)行反應(yīng)?！耙诲佉徊健狈ǔ休d底物濃度高;因?yàn)橹虚g步驟無需升溫、降溫,所以效率高,節(jié)省能源;但受限于酶的反應(yīng)平衡,底物轉(zhuǎn)化率低,后續(xù)純化工藝復(fù)雜[31,32]。

為了提高羥基類固醇脫氫酶的使用效率,無論采用“一鍋兩步法”還是“一鍋一步法”,都可以對(duì)酶進(jìn)行固定化后再使用。Yang等利用酶固定化技術(shù)提高了7a-HSDH和7β-HSDH的活性和熱穩(wěn)定性,共固定化在EP-0.5-C時(shí),7a-HSDH和7β-HSDH的催化效率和重復(fù)使用性得到提高[33];Zheng等將7α-HSDH/乳酸脫氫酶(LDH)以及7β-HSDH/葡萄糖脫氫酶(GDH)分別固定在環(huán)氧樹脂ES-103上制得固定化酶LDH-7αHSDH@ES-103和7βHSDH-GDH@ES-103,用于催化CDCA合成UDCA,并通過在兩個(gè)連續(xù)填充床反應(yīng)器中使用固定化酶實(shí)現(xiàn)了CDCA連續(xù)生產(chǎn)UDCA[32]。

1.5 UDCA合成酶的蛋白質(zhì)工程

天然羥基類固醇脫氫酶由于活性差、存在底物抑制,難以滿足工業(yè)應(yīng)用要求,為了提高酶法合成UDCA的效率和轉(zhuǎn)化率,蛋白質(zhì)工程技術(shù)應(yīng)用于UDCA合成酶的改造以提高酶的穩(wěn)定性、活力、增強(qiáng)酶的高濃度底物耐受性,甚至用于改變酶的輔酶特異性從而降低生產(chǎn)成本。

Huang等采用定向進(jìn)化和高通量篩選相結(jié)合的方法,提高了Clostridiumabsonum中7α-HSDH的催化效率和底物耐受濃度[34];Zheng等采用易錯(cuò)PCR、DNA shuffling和定點(diǎn)突變等技術(shù)定向進(jìn)化來自Ruminococcustorques的7β-HSDH,改善了7β-HSDH的活性、熱穩(wěn)定性和最適pH[19];現(xiàn)已報(bào)道的7β-HSDH幾乎都嚴(yán)格依賴于NADPH,然而,與NADPH相比,NADH更為廉價(jià),是羥基類固醇脫氫酶合成UDCA的優(yōu)先選擇輔因子。You 等基于7β-HSDH酶的結(jié)構(gòu)分析和保守序列比對(duì),對(duì)源自Ruminococcustorques的重組7β-HSDH進(jìn)行了工程設(shè)計(jì),改變了其輔助因子依賴特異性[35]。

1.6 UDCA合成的輔酶再生策略

催化CDCA或CA合成UDCA的酶都屬于羥基類固醇脫氫酶,這類酶的典型特征是反應(yīng)都需要NAD(H)或者NADP(H)輔酶[36]。理論上,消耗多少底物就需要消耗等摩爾量輔酶,而這些輔酶往往價(jià)格昂貴,從經(jīng)濟(jì)角度考慮,加大輔酶用量是不可行的,因此,羥基類固醇脫氫酶在使用時(shí)必須提供高效、低成本的輔酶再生系統(tǒng)。UDCA酶法合成中的氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)和還原性輔酶Ⅱ(NADPH)都是通過酶法再生,實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用。Zheng等在以CDCA為底物兩步法合成UDCA過程中以乳酸脫氫酶(LDH)和葡萄糖脫氫酶(GDH)分別作為NAD+和NADPH的再生酶[31];Liu等在將7-KLCA轉(zhuǎn)化為UDCA時(shí),用醇脫氫酶ADH-TE氧化異丙醇實(shí)現(xiàn)NADPH再生[26];Pedrini等用甲酸脫氫酶(ADH)實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)用于合成熊果膽酸(UCA)和UDCA[18]; Zheng等在7-KLCA生成UDCA的過程中,使用GDH用于NADPH再生循環(huán)利用[32];秦和平等以L-蘋果酸/蘋果酸脫氫酶系統(tǒng)循環(huán)NAD+,用于還原7K-LCA生成UDCA[37];Chen等利用黃素氧化還原酶(FR)和黃素單核苷酸(FMN)為原料,建立了NAD+再生體系,又以醇脫氫酶和異丙醇為原料,建立了NADPH再生體系,在一個(gè)鍋內(nèi)實(shí)現(xiàn)了CDCA到UDCA的完全轉(zhuǎn)化[11];Bovara等使用α-酮戊二酸/GLDH和葡萄糖/GDH系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了以膽酸為底物合成12-酮-UDCA[21];Sun等在全細(xì)胞催化DHCA合成12-酮-UDCA時(shí),將3α-HSDH、7β-HSDH和GDH在同一大腸桿菌中共表達(dá),GDH用于NAD(P)H再生[38];Carrea等在以CA為原料,用12α-HSDH合成12-酮-CDCA的過程中,將12α-HSDH和谷氨酸脫氫酶共固定化,谷氨酸脫氫酶用于NADP+再生,高效循環(huán)制備12-酮-CDCA[39];在化學(xué)-酶法制備UDCA的過程中,同樣也可以使用LDH實(shí)現(xiàn)NAD+循環(huán)再生[40]。可用于NAD(H)和NADP(H)再生的輔酶有很多種,并各具特點(diǎn)(表3)。

表3 生物合成UDCA常用輔酶再生體系

2 全細(xì)胞合成UDCA

全細(xì)胞合成是一種具有諸多優(yōu)勢的新型催化模式,尤其在涉及多步酶催化反應(yīng),在合成諸多藥物中間體等方向體現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景和工業(yè)價(jià)值。全細(xì)胞合成UDCA的研究始于研究者發(fā)現(xiàn)野生微生物可以將CDCA或LCA轉(zhuǎn)化為UDCA[50-52]。但野生微生物只能承載濃度極低的底物(微摩爾或幾毫摩爾CDCA),底物濃度一旦增加,微生物生長受抑制,且轉(zhuǎn)化率極低。2013年,Kollerov等又篩選了不同種屬的放線菌和絲狀真菌,考察它們轉(zhuǎn)化LCA生成UDCA的能力,首次鑒定出10種可以直接將LCA轉(zhuǎn)化成UDCA的微生物菌株[53]。CDCA全細(xì)胞合成UDCA示意圖如圖4所示。

圖4 CDCA全細(xì)胞合成UDCA示意圖

某些微生物之所以可以將CDCA或LCA轉(zhuǎn)化為UDCA,是因?yàn)槲⑸镒陨懋a(chǎn)生了相關(guān)的轉(zhuǎn)化酶:將CDCA轉(zhuǎn)化為UDCA的微生物自身產(chǎn)生7α-HSDH和7β-HSDH;將LCA轉(zhuǎn)化為UDCA的微生物自身產(chǎn)生P450單加氧酶。這些微生物成為后期研究羥基類固醇脫氫酶或P450單加氧酶基因序列的重要來源。但野生微生物相關(guān)羥基類固醇脫氫酶表達(dá)量低,酶活性低,底物濃度增加后還會(huì)抑制菌體生長和轉(zhuǎn)化。所以,相關(guān)細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究一度鮮有研究者問津。直到利用工程菌株,尤其是大腸桿菌異源表達(dá)相關(guān)羥基類固醇脫氫酶,并用這些工程菌轉(zhuǎn)化CDCA合成UDCA取得了良好效果,相關(guān)全細(xì)胞催化研究才重新進(jìn)入人們的視野。相較于游離酶催化,全細(xì)胞催化可以利用微生物細(xì)胞自身的輔酶再生體系,并省去了菌體破碎制酶步驟,從而顯示出優(yōu)勢。對(duì)于LCA轉(zhuǎn)化合成UDCA,因?yàn)槭芟抻赑450單加氧酶資源欠缺、反應(yīng)條件苛刻,相關(guān)研究尚未取得突破性進(jìn)展。

Shi等報(bào)道了整合7α-HSDH和7β-HSDH的大腸桿菌工程細(xì)胞將?；撬狴Z去氧膽酸(TCDCA)轉(zhuǎn)化為牛磺酸熊去氧膽酸(TUDCA),同樣可以實(shí)現(xiàn)CDCA到UDCA的轉(zhuǎn)化[54]。之后,他們又開發(fā)了深槽靜態(tài)工藝,控制轉(zhuǎn)化后的TUDCA與TCDCA比例與藥材引流熊膽粉的比例相近,提供了一種利用微生物細(xì)胞工廠從雞膽粉生產(chǎn)人工熊膽粉替代品的方法[55]。最近,該課題組又構(gòu)建了表達(dá)兩種酶的釀酒酵母宿主菌,從食品和藥品安全的角度來看,釀酒酵母屬于GRAS菌株,安全性相較于大腸桿菌更高[56]。

Sun等則實(shí)現(xiàn)了12-酮-UDCA的全細(xì)胞合成。12-酮-UDCA是UDCA化學(xué)-酶法合成的關(guān)鍵中間產(chǎn)物[38]。將3α-HSDH、7β-HSDH和來自Bacillussubtilis的葡萄糖脫氫酶(GDH)在同一株BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞中共表達(dá),構(gòu)建了另一種單菌株全細(xì)胞催化系統(tǒng),該體系在4.5 h內(nèi)將DHCA轉(zhuǎn)化為12-酮-UDCA的轉(zhuǎn)化率大于99.5%。

3 結(jié)論與展望