李 茹,丁欣杰,商金海,秦林雪,魏 鎧,王 月,李 攀

(聊城大學 藥學院,山東 聊城 252059)

環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)是α-淀粉酶家族的成員之一,屬于水解酶類。CGTase具有多種功能,可以催化水解反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)、歧化反應(yīng)以及偶合反應(yīng)[1]。然而CGTase通常顯示出較小的水解活性,主要催化環(huán)化、偶聯(lián)和歧化這三種反式糖基化反應(yīng)[2]。環(huán)化反應(yīng)在工業(yè)上常用于環(huán)糊精的生產(chǎn),是CGTase的特征性反應(yīng),通過催化淀粉類底物,將直鏈糖的還原性末端與非還原性末端通過α-1,4-糖苷鍵首尾相連形成環(huán)狀的環(huán)糊精分子(Cyclodextrin, CD)[3]。大多數(shù)CGTase由各種微生物在細胞內(nèi)產(chǎn)生,主要來源為芽孢桿菌[4]。

常見的環(huán)糊精分子有α-環(huán)糊精(α-CD)、β-環(huán)糊精(β-CD)以及γ-環(huán)糊精(γ-CD),分別具有6、7、8個葡萄糖基[5]。環(huán)糊精具有親水性表面以及獨特的疏水性空腔,能夠溶于水,且承載疏水性的客體分子,進而改變客體分子的溶解性、穩(wěn)定性等物理化學性質(zhì)。因此,在化妝品、制藥、食品、化學工業(yè)等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用[6,7]。α-CD具有相對較小的內(nèi)腔和對酶水解的高抗性,在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[8]。由于α-CD產(chǎn)量低、價格高,其市場占有率遠低于其他CD[9]。目前,通過新酶篩選以及蛋白質(zhì)工程,提高CGTase的生產(chǎn)性能,有望降低α-CD的生產(chǎn)成本,從而獲得更實惠的α-CD[10]。

水稻是人類最主要的糧食作物之一,在解決全球糧食短缺問題中起著十分重要的作用[11]。隨著生活質(zhì)量不斷提升,人們在飲食上的要求也逐漸提高,優(yōu)質(zhì)大米越來越受到消費者的認可和歡迎。目前我國大力推進優(yōu)質(zhì)水稻品種的培育和種植,旨在培育更優(yōu)質(zhì)、更受市場歡迎的水稻[12]。淀粉是水稻的主要組成部分,包括直鏈淀粉和支鏈淀粉,約占水稻干重的70%～80%,其中直鏈淀粉是影響水稻營養(yǎng)價值和品質(zhì)的重要因素。一般來說,水稻中直鏈淀粉含量越低,水稻的外觀品質(zhì)以及食味品質(zhì)更好[13,14]。直鏈淀粉含量在5%～15%的水稻屬于低直鏈淀粉水稻,食品風味最佳,廣受消費者喜愛;直鏈淀粉含量在15%～20%之間的水稻食味品質(zhì)較好,也是市面上最常見的水稻種類;而直鏈淀粉含量大于20%的水稻食味品質(zhì)較差[15]。因此,進一步深入研究水稻直鏈淀粉的影響因素及其作用機制,有利于水稻品質(zhì)的改善,同時對優(yōu)質(zhì)稻米品種培育以及水稻經(jīng)濟價值的提高都具有重要的意義。

本研究通過克隆B.toyonensisP18中環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因JSL-1,構(gòu)建原核表達載體及植物過表達載體,獲得純化酶蛋白及JSL-1轉(zhuǎn)基因水稻株系,對其酶活力、產(chǎn)物特異性、酶學性質(zhì)以及JSL-1與水稻淀粉品質(zhì)的關(guān)系進行了研究,為JSL-1的工業(yè)化生產(chǎn)以及稻米品質(zhì)的改良提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

Arhat 96梯度PCR儀購自上海創(chuàng)未生物技術(shù)有限公司;LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋購自上海申安醫(yī)療機械廠;XM-1000T一體式超聲波細胞破碎儀購自小美超聲儀器(昆山)有限公司;DC-0506低溫恒溫槽購自江蘇天翎儀器有限公司;K2025高效液相色譜系統(tǒng)購自海能未來技術(shù)集團股份有限公司;Bio-TekELX800酶標儀購自山東博科再生醫(yī)學有限公司;JJ-2高速組織搗碎勻漿機購自上海達洛科學儀器有限公司;5810R高性能通用臺式離心機購自賽默飛世爾科技(上海)有限公司;T700AS紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司;CL-60T超聲波清洗機購自濟南通海機械設(shè)備有限公司;PHS-3C pH計購自上海精密科學儀器有限公司;BJPX-SGT10恒溫搖床購自濟南泰醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pGEX4T-JSL-1原核表達載體構(gòu)建及重組菌鑒定。JSL-1基因序列可從NCBI數(shù)據(jù)庫中查閱,登錄號為CP064876.1,由南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成。根據(jù)JSL-1全長cDNA序列設(shè)計引物,正向引物序列5′-tccgcgtggatccccgaattcATGAAAGAAAAAGATAGGCTTAAATTTAG-3′(含有EcoR I酶切位點);反向引物序列5′-gatgcggccgctcgagtcgacTTAAGTCTCAACCAGGATAGTTTTTT-3′(含有SalI酶切位點)。以pGEX4T為蛋白表達載體,酶切后載體片段與JSL-1全長序列進行連接,得到重組質(zhì)粒pGEX4T-JSL-1,通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,涂布至含Amp+的抗性LB培養(yǎng)基,于37℃恒溫培養(yǎng)箱放置過夜,挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒進行酶切驗證,隨后送至北科基因檢測(山東)有限公司測序,測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞,37 ℃放置過夜,挑取單菌落再次驗證后進行保菌[16]。

1.3.5 最適pH、最適溫度測定。最適pH測定:為了測定JSL-1的最適pH,配制摩爾濃度為0.05 mol /L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液,利用酸度計調(diào)節(jié)緩沖液至不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0),在不同pH的反應(yīng)體系中分別進行酶促反應(yīng),測定JSL-1的酶活力,將最高酶活力定為100%,分別計算各體系中JSL-1的相對酶活力,從而確定最適反應(yīng)pH值[19]。

最適溫度測定:在最適pH條件下,分別將不同反應(yīng)體系置于20、30、40、50、60、70 ℃進行酶促反應(yīng),測定JSL-1的酶活力,將酶活性最高者定義為100%,計算相對酶活力,從而確定該酶的最適溫度[20]。

1.3.6 轉(zhuǎn)基因水稻的獲取。稻米中淀粉含量是影響稻米品質(zhì)的重要因素,為了進一步探討JSL-1與稻米淀粉的關(guān)系,參考溫莉嫻[21]的博士畢業(yè)論文進行轉(zhuǎn)基因水稻的獲取。首先,構(gòu)建正義表達載體,以獲取的JSL-1基因為模板進行基因擴增。正向引物為5′-caggtcgactctagaggatccATGAAAGAAAAAGATAGGCTTAAATTTAG-3′(含有BamH I酶切位點),反向引物為5′-cgatcggggaaattcgagctcTTAAGTCTCAACCAGGATAGTTTTTT-3′(含有SacI酶切位點)。用限制性內(nèi)切酶BamH I和SacI對目的基因及植物雙元載體pCAMIBA3300進行雙酶切。將載體和目的片段相連接并鑒定出正確的陽性克隆質(zhì)粒,然后采用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株中,然后侵染野生型日本晴水稻胚性愈傷組織,選擇相對表達量較高的愈傷組織進行下一步實驗[22,23]。經(jīng)三代培養(yǎng)獲得純合轉(zhuǎn)基因水稻。

1.3.7 稻米淀粉提取。稱取10 g稻米,干燥后置于0.14%亞硫酸氫鈉水溶液中,固液比為1∶5,浸泡過夜。研磨稻米至糊狀,于200目尼龍網(wǎng)過濾后收集到15 mL離心管,沖洗尼龍網(wǎng)兩次,將沖洗的溶液也加入離心管,3 000 r/min離心20 min,棄去上清液。超純水吹打沉淀,使得沉淀懸浮,3 000 r/min再次離心20 min,棄上清。重復上一步驟三次,將沉淀置于烘箱中快速烘干,粉碎機粉碎后過100目篩,即得水稻淀粉[24,25]。

1.3.8 直鏈淀粉含量測定。繪制標準曲線:四個標準直鏈淀粉含量分別為1.5%、10.4%、17.5%、26.5%。準確稱取四種直鏈淀粉標準品各100 mg,各標準品中依次加95%的無水乙醇1 mL和1 mol/L氫氧化鈉溶液9 mL,煮沸20 min至樣品完全溶解,冷卻后定容至100 mL。分別吸取5 mL改性淀粉樣品溶液,依次加入1 mol/L冰醋酸1 mL和0.2%的稀碘液2 mL,定容至100 mL,靜置20 min后,在620 nm處測吸光度。以四個直鏈淀粉濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

含量測定:準確稱取各株系水稻淀粉樣品各100 mg,操作步驟同上。根據(jù)各樣品測得的吸光度和直鏈淀粉標準曲線,計算直鏈淀粉含量[26,27]。

1.3.9 淀粉透光率、凍融穩(wěn)定性及淀粉糊老化程度測定。淀粉透光率測定:首先配制1%的水稻淀粉溶液:準確稱取0.2 g水稻淀粉,加入20 mL蒸餾水并混勻,恒溫水浴鍋95 ℃振蕩20 min用于淀粉糊化,取出后靜置冷卻30 min,620 nm處測吸光度,4 ℃放置24 h,620 nm處再次測定吸光度[28]。

淀粉凍融穩(wěn)定性測定:取淀粉透光率測定時處理的淀粉糊,分裝至做好標記的離心管中,稱量離心管和淀粉糊的質(zhì)量,放入冰箱中,-20 ℃冷凍24 h后取出,室溫下解凍后進行離心,設(shè)置為3 000 r/min,離心20 min后去水并稱量沉淀的質(zhì)量,然后計算析水率[29]。析水率按公式進行計算:析水率=(糊重-沉淀)/糊重×100%。

淀粉糊老化程度測定:取處理后的淀粉糊進行分裝,并做好標記,放入4 ℃冰箱中,每隔一定時間取出,記錄上清液的體積,直至上清液體積不再發(fā)生變化,根據(jù)上清液的體積變化率反應(yīng)水稻淀粉老化程度[30]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均進行三次獨立的生物學重復,數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制均利用Microsoft Office Excel 2010完成。差異顯著*P<0.05,差異極顯著**P< 0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組JSL-1-pGEX4T表達載體構(gòu)建

結(jié)果如圖1所示,泳道S1與S2在2085 bp處有顯示條帶,將其進行膠回收后,連接到中間載體PBSK中,送測序,發(fā)現(xiàn)100%測序正確,表明JSL-1基因被成功克隆。為了將其連接到原核表達載體pGEX4T中,我們將JSL-1-PBSK進行雙酶切后,泳道S3與S4在2 958 bp與2 085 bp各有一條帶,其中2 958 bp為PBSK載體條帶,2 085 bp為基因JSL-1片段。將泳道S3、S4中2 085 bp膠回收,經(jīng)過基因重組后,連接到pGEX4T中,菌液PCR驗證,泳道S5與S6在2 085 bp處有顯示條帶。提取JSL-1-pGEX4T重組質(zhì)粒,進行雙酶切,泳道7與8在4 969 bp與2 085 bp各有一條帶,其中4 969 bp為pGEX4T載體條帶,2 085 bp為基因JSL-1片段,表明挑取的JSL-1-pGEX4T-BL21重組菌株為陽性,重組質(zhì)粒JSL-1-pGEX4T已成功轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21(DE3)中。

注:泳道M為DNA marker;泳道S1、S2為基因JSL-1 PCR擴增條帶;泳道S3、S4為質(zhì)粒JSL-1-PBSK雙酶切片段;泳道S5、S6為PCR擴增JSL-1-pGEX4T陽性菌液;泳道S7、S8為JSL-1-pGEX4T重組質(zhì)粒雙酶切片段。紅色方框中為目標片段JSL-1。

注:泳道M為蛋白marker;泳道S1為誘導溫度20 ℃,IPTG 濃度1.0 mmol/L,誘導時間3 h;泳道S2為誘導溫度20 ℃,IPTG 濃度 1.0 mmol/L,誘導時間24 h時;泳道S3為誘導溫度20 ℃,IPTG 濃度0.5 mmol/L,誘導時間24 h;泳道S4為誘導溫度20 ℃,IPTG 濃度 0.0 mmol/L,誘導時間24 h。紅色方框為目標蛋白JSL-1。

2.2 重組JSL-1-pGEX4T蛋白表達和純化

為了獲得重組JSL-1-pGEX4T蛋白,經(jīng)過反復摸索,發(fā)現(xiàn)在誘導溫度為20 ℃,IPTG濃度為1.0 mmol/L,誘導時間為24 h時,目的蛋白條帶為68.6 kua(泳道S2),未誘導對照組無明顯蛋白條帶(泳道S4),表明JSL-1基因誘導表達成功(圖 2)。

2.3 產(chǎn)物特異性分析

通過分析環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶JSL-1與1%可溶性淀粉反應(yīng)產(chǎn)物的類型及生成量,從而確定該酶的產(chǎn)物特異性。由圖3可知,該酶的主要產(chǎn)物為α-CD,在60 min時產(chǎn)量達到最高,約為1.05 g/L,隨后α-CD的產(chǎn)量隨著時間推移而呈現(xiàn)下降趨勢。β-CD和γ-CD為該酶催化生成的次產(chǎn)物,且β-CD產(chǎn)量高于γ-CD的產(chǎn)量。反應(yīng)進行到60 min時,淀粉環(huán)化率約為33%,其中產(chǎn)生的α-CD占總CD的67%。說明環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶JSL-1主要催化淀粉進行環(huán)化反應(yīng)生成α-CD。

注:*P<0.05,**P<0.01;n=3。 Note: *P<0.05, **P<0.01; n=3.

2.4 JSL-1最適pH及最適溫度

pH對于酶催化活性有較強的影響。在pH 4.0～12.0的范圍內(nèi)測定JSL-1的最適反應(yīng)pH,從圖4(a)中可以看到,在pH 4.0～8.0的范圍內(nèi),JSL-1酶活力不斷上升,隨后酶活力隨著pH的升高而不斷降低。JSL-1的最適pH為8.0,在此pH下JSL-1催化淀粉生成環(huán)糊精的能力最強,即環(huán)化能力最強。

注:*P<0.05,**P<0.01;n=3。 Note: *P<0.05, **P<0.01; n=3.

在最適pH條件下,在20～70 ℃的范圍內(nèi)測定JSL-1的最適反應(yīng)溫度。從圖4(b)中可以得知,在20～50 ℃溫度范圍內(nèi),酶活力隨著溫度的上升而增加,隨后JSL-1的酶活力隨著溫度的上升而逐漸下降,最終失活,這表明溫度過高不利于JSL-1進行環(huán)化反應(yīng)。50 ℃時酶活力達到最大,為該酶最適反應(yīng)溫度,且在45～60 ℃范圍內(nèi)均有較高的相對酶活力,相對酶活力保持在近80%以上。

2.5 JSL-1轉(zhuǎn)基因水稻獲取

構(gòu)建好植物過表達載體后通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法侵染日本晴水稻,卡那霉素三代篩選獲得轉(zhuǎn)基因純合水稻株系。對各轉(zhuǎn)基因水稻株系通過qRT-PCR驗證JSL-1基因的相對表達水平(圖5),并選擇JSL-1表達量較低的OE3株系、表達量適中的OE7株系、以及表達量較高的OE12株系進行下一步研究。

注: *P<0.05, **P<0.01; n=3. Note: *P<0.05, **P<0.01; n=3.

2.6 直鏈淀粉含量測定

直鏈淀粉標準曲線繪制結(jié)果如圖6(a)所示,標準曲線回歸方程為y=0.013 3x+0.066 6,線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 9,其中x代表直鏈淀粉含量(%),y代表620 nm處的吸光度(Abs),從圖中可以看出,吸光度和直鏈淀粉含量具有良好的線性關(guān)系。各株系直鏈淀粉含量如圖6(b)所示,其中野生型水稻的直鏈淀粉含量達到18.2%,OE3直鏈淀粉含量為14.7%,OE7直鏈淀粉含量為12.8%,OE12直鏈淀粉含量為10.9%。隨著JSL-1基因表達水平上升,直鏈淀粉含量下降,逐漸向低直鏈淀粉水稻發(fā)展。可能是由于環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶JSL-1發(fā)生環(huán)化反應(yīng),催化水稻中的直鏈淀粉生成環(huán)糊精,從而造成水稻中直鏈淀粉含量下降。

注: *P<0.05, **P<0.01; n=3. Note: *P<0.05, **P<0.01; n=3.

2.7 淀粉透光率、凍融穩(wěn)定性、老化程度測定

用淀粉透光率來表示轉(zhuǎn)基因水稻淀粉的透明度,結(jié)果如圖7(a)所示。隨著JSL-1基因表達量的增加,淀粉的透光率也增加。淀粉的透光率受直鏈淀粉含量影響,直鏈淀粉含量越高,淀粉容易發(fā)生凝沉從而造成透光率下降[31]。淀粉透光率越高,淀粉亮度越好。因此,隨著JSL-1基因表達量增加,水稻淀粉溶液外觀品質(zhì)越好。

注: *P<0.05, **P<0.01; n=3. Note: *P<0.05, **P<0.01; n=3.

如圖7(b)所示,轉(zhuǎn)基因水稻淀粉凍融穩(wěn)定性用淀粉的析出率來表示,析出率越高代表淀粉凍融穩(wěn)定性越差。隨著JSL-1基因表達量的上升,淀粉析出率下降。也就是說淀粉凍融穩(wěn)定性隨著JSL-1基因的表達量的增加而增加。通過以往的研究可知,淀粉凍融穩(wěn)定性增加,可以提高水稻在低溫儲存中的穩(wěn)定性,以及其加工食品冷藏時的穩(wěn)定性。因此提高水稻中JSL-1的表達量有利于水稻淀粉在低溫中保存。

各株系水稻淀粉上清液體積比如圖7(c)所示,轉(zhuǎn)基因水稻淀粉老化程度用淀粉上清液體積比來表示,體積比越高代表淀粉老化程度越高。隨著JSL-1基因表達量的增加,上清液的體積比減小,淀粉老化程度下降。這與JSL-1基因表達量對淀粉透光率以及凍融穩(wěn)定性影響結(jié)果相一致。老化是淀粉最常見的性質(zhì)之一,也是導致食品老化的重要原因,老化后的淀粉會變渾濁,嚴重影響食品的外觀品質(zhì),存放質(zhì)量以及口感風味等。因此,JSL-1基因表達量越高,越有利于水稻淀粉及其加工食品貨架期的延長。

3 結(jié)論

本項研究克隆了來源于B.toyonensisP18環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因JSL-1,并對其功能進行了初步研究。結(jié)果表明JSL-1主要催化直鏈淀粉生成α-CD,該酶最適pH為8.0,最適溫度為50 ℃。由于環(huán)糊精在食品、藥品、化妝品等多個領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,因而對JSL-1的產(chǎn)物特異性及酶學性質(zhì)具有一定研究意義。在轉(zhuǎn)基因水稻株系中,隨著JSL-1基因表達水平的增加,水稻中直鏈淀粉含量增加,水稻淀粉透光率、凍融穩(wěn)定性增加,水稻淀粉老化程度下降。已有研究表明,水稻中直鏈淀粉含量與水稻的食味品質(zhì)成負相關(guān),決定系數(shù)高達92%。因此JSL-1轉(zhuǎn)基因水稻不僅可以提高水稻的食味品質(zhì),同時可以改善水稻的外觀品質(zhì)以及冷藏存儲的穩(wěn)定性。對環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶JSL-1的一系列研究為將來提高催化產(chǎn)物的專一性以及環(huán)糊精的生產(chǎn)工藝的改良奠定了基礎(chǔ),同時為對低直鏈淀粉水稻的育種提供了優(yōu)質(zhì)的基因資源,為水稻品質(zhì)的改良提供了新的思路。